一种同位素茎秆双标记示踪方法
【专利摘要】本发明属于同位素示踪方法【技术领域】，特别涉及一种同位素茎秆双标记示踪方法。为解决原有标记方法在N、C同时追踪方面的局限，对植物扰动较大，影响植物根系沉积物质的自然分泌，同位素回收率低，以及研究结果不稳定等问题，本发明提供了一种同位素茎秆双标记示踪方法。本发明方法包括以下步骤：(1)材料的准备；(2)进行标记；(3)取样与测定；(4)计算。本发明方法可以在土壤栽培条件下进行原位标记，不需扰乱根系的空间分布，保持土壤与根的联系，且可以用含13C的葡萄糖和15N的尿素混合溶液进行碳氮双标记。与其他方法相比，应用这种方法实现了对植物材料比较均匀的标记及15N和13C的高回收率。
【专利说明】一种同位素茎秆双标记示踪方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于同位素示踪方法【技术领域】，特别涉及一种同位素茎杆双标记示踪方 法。
【背景技术】
[0002] 目前在根际沉积研究领域主要的同位素标记方法可以分为气体标记法、分根法和 地上部标记法，下文将就与本发明最相关的地上部标记法进行详细介绍，并分析其优缺点。
[0003] 植物地上部标记方法通常使用高丰度的15n-尿素、15n-ncv或 15N-NH4+溶液进行单 次或多次脉冲标记，按照标记部位的不同可以分为叶片标记法、叶柄标记法和茎杆标记法。
[0004] 叶片标记法主要是通过叶片喷洒、涂抹或者叶尖端浸泡等方式进行同位素饲喂。 叶片外形细长状时（如小麦、燕麦等），通常从尖端或中间将叶片剪断，浸入含有标记同位 素的溶液中，靠作物的自然吸收将溶液吸入植株体内；叶片较为宽大时（如大豆、绿豆等）， 通常采用涂抹或喷雾的方法进行标记。为防止叶片受到损伤，一般使用较低浓度的标记溶 液，使用的同位素溶液浓度往往低于1. 〇%，如0. 25%和0. 40%，0. 5%。
[0005] 优点：叶片摄取溶液速度快，可以很方便地用于多重标记；操作方法较简便，可以 在田间进行较大量的叶片标记；不受作物生长阶段的影响，可以在任何生长时间进行标记。
[0006] 缺点：标记不均匀，标记元素的分布与标记位置相关，标记元素更多的分布于作物 的叶片和地上部，地下部相对较少；Khan等（2002b)研究发现，标记植株基部叶片时，根系 具有更高的 15N丰度；采用标记溶液处理的部分比其它部分含有更高的同位素丰度，导致部 分的15N以氨气形式损失，这也是该方法回收率低的原因之一；由于标记体系是开放的，标 记溶液滴漏会污染土壤，导致被植株吸收的量不能准确测定。
[0007] 叶柄标记法和叶片标记类似，选取一片叶片剪下叶片部分，将叶柄插入含有标记 同位素的溶液中，利用自然吸收进行同位素标记。叶柄标记法中植株吸收的标记元素量较 叶片标记法要少，若含有高浓度标记元素的叶柄脱落，则会污染土壤。与叶柄饲喂相比，叶 片饲喂方法会造成绿豆和豌豆根部同位素富集。植株的蒸腾作用，叶的位置与周围的环境 条件等都影响着植株对溶液的吸收。溶液吸收和标记效率取决于气候条件和植株的生长阶 段，这是因为溶液的吸收是由蒸腾拉力和氮的转运推动。随时间的推移标记溶液的浓度逐 渐升1?，导致标记溶液吸收率偏低也是叶柄标记法的一大缺陷。
[0008] 茎杆标记法主要有微注射法。
[0009] 微注射法即用微量注射器将标记溶液注射到植株茎杆中。该方法的优点是快速简 便，重复标记时间间隔短，且标记同位素用量能够精确控制，但通常导致植株地上部分优先 被标记，且同位素可能在标记部位高度富集。G0tz等（2002)用此方法将 15NH4C1(95%)注 射到豇豆茎杆中，研究三个不同生长阶段15N在不同器官间的分配和利用效率，但由于研究 中使用的标记元素量极低，Wichern等（2008)认为该方法不适用于根际沉积氮研究。
[0010] 以上研究方法的不完善，常常造成作物同位素标记相关研究的困难，为学科发展 造成了很大阻碍。
【发明内容】
[0011] 本发明提供了一种同位素茎杆双标记示踪方法，具体为一种使用15N和13C同位素 同时进行茎杆双标记示踪的技术，以解决原有标记方法在N、C同时追踪方面的局限，对植 物扰动较大，影响植物根系沉积物质的自然分泌，同位素回收率低，以及研究结果不稳定等 问题。
[0012] 一种同位素茎杆双标记示踪方法，该方法步骤如下：
[0013] (1)材料的准备；
[0014] (2)进行标记；
[0015] (3)取样与测定；
[0016] (4)计算。
[0017] 本发明的详细操作过程如下：
[0018] (1)材料的准备：
[0019] 需要的材料有：预开口的气相色谱瓶（1. 5mL)、脱脂棉线、缝衣针（中号）、穿针器、 细铜丝、塑料管（直径5mm)、丰度为99 %的15N-尿素、丰度为99 %的13C-葡萄糖，体积分数 为75%的酒精水溶液、酒精棉球、镊子、小喷壶、小的U型硬铁丝。
[0020] 1.脱脂棉线：
[0021] 购买普通细棉线，使用去离子水加洗洁精浸泡2h?3h，搓揉棉线使其充分洗干 净，脱去脂肪，利于溶液吸收。将棉线风干后，剪成12cm左右长的小段备用。
[0022] 2.细铜丝：
[0023] 将细铜丝剪成5cm左右长的小段，备用。
[0024] 3.塑料管：
[0025] 将塑料管剪成8cm左右长的小段，并将中间位置剪出U型豁口，使细线能够从一端 穿如，从管中间穿出，再穿入，再从另一端穿出。
[0026] 4.同位素溶液：
[0027] 按标记需求称取一定量的15N尿素和13C葡萄糖，融入一定量的灭菌蒸馏水中，混合 均匀，配成同位素混合溶液，放置在无菌的通风橱中备用。同位素用量可根据研究目的进行 调节，如标记与取样间隔时间较长，应适当增加标记同位素用量。
[0028] 上述东西准备完毕后，将所有用具（除同位素溶液）在121°C进行蒸汽灭菌 20min，然后放置在无菌通风橱中备用。
[0029] (2)进行标记：
[0030] 1.标记过程概述：
[0031] 在植物的营养生长末期进行标记，在植株待标记部位（植株距离地面大约3厘米 处）钻孔（直径为〇.25_)，用脱脂棉线穿过此孔，将脱脂棉线的两端插入装有标记溶液的 试剂瓶中；所述脱脂棉线外套有塑料管，以防止标记溶液的损失；用细铜丝固定脱脂棉线、 塑料管和植株之间不错位，并且固定牢固，防止间隙太大造成溶液蒸腾损失；所述标记溶液 为配制好的丰度为99%的 13C-葡萄糖和丰度为99 %的15N-尿素混合溶液，标记2次，中间 间隔1周时间，每次加入lmL的标记溶液，吸收完毕后，再加入lmL?2mL的去离子水，以使 脱脂棉线上残留的溶液全部被植物吸收；在全部标记过程完成后，将标记用的材料及装置 轻轻从植物上取下，收集保存。
[0032] 2.标记详细步骤：
[0033] ①将植株周围障碍物等清除，如是盆栽，则应将盆沿擦净，防止操作过程中带来不 便，以及造成污染；
[0034] ②用体积分数为75%的酒精水溶液喷手、镊子以及周围可能会接触到的物品，进 行消毒，防止感染植株；
[0035] ③用镊子夹着棉球蘸取体积分数为75 %的酒精水溶液，在植物待标记部位（距地 面3cm处）表面涂抹，进行消毒；
[0036] ④用穿针器将脱脂棉线穿入针头，将针穿过塑料软管，从中间小口拉出，动作要 慢，防止脱脂棉线滑出；
[0037] ⑤将针穿过植株（针穿过植物后立即在针扎入口处滴入一两滴去离子水，防止标 记时间过长，植物损伤），从塑料管中间小口另一端进入，从出口一端轻轻拉出；
[0038] ⑥用细铜丝将软管的两部分并拢、并固定在标记植物上，尽可能的缩小植株与软 管之间的空隙，减少蒸腾损失；
[0039] ⑦用一小U型硬铁丝插下软管的两端，带动软管穿过预开口的气相色谱瓶盖，然 后取下小瓶，取出U型硬铁丝，将棉线用针挑出，然后拧上小瓶。（棉线也不宜太长，但末端 一定要到达瓶子底部）；
[0040] ⑧用体积为lmL的注射器往瓶内加入标记液体，吸收完成后再加入lmL?2mL去 离子水，不标记的处理加入同样体积的去离子水；
[0041] ⑨在溶液被完全吸收后，将标记装置，慢慢从植株上取下，尽可能减少对植物的伤 害；
[0042] ⑩标记完成后，在植株地表罩上1mm孔径的丝网，每隔几天收集落叶，防止落叶中 的同位素影响土壤。
[0043] (3)取样与测定：
[0044] 所述步骤（3)中取样与测定的方法如下：
[0045] a.材料的准备：
[0046] 自封袋、记号笔、小镊子、小铲子、筛子（2mm)、磨样机、纸袋、塑料布、天平、小纸 袋；
[0047] b.进行取样：
[0048] ①将植物地上部分齐地面剪下，按植物的茎叶等不同器官分成几部分，装入纸袋 中，做好标记，在60°C下烘干72h，称重，使用球磨机磨样，待测；
[0049] ②将土柱中的土取出，倒在一块干净的塑料布上，并用小铲子将土柱内壁的土刮 下，尽可能的取到所有的土；
[0050] ③将土捣碎，全部过2mm过筛，得到主根系，用蒸馏水洗净，在60°C下烘干72h，称 重，磨碎，待测。
[0051] ④称量全部湿土的质量，将土充分混合均匀取100g左右，烘干测定含水量；
[0052] ⑤另取100g左右湿土，通过湿筛法用200目筛子筛洗，得到土壤中的剩余细根，将 细根洗净并在60°C下烘干72h，称重（并未用于同位素测定，用于估算土壤中残留细根的 量，从而全面的计算土壤中根系生物量）。
[0053] ⑥取一小部分土样，在60°C下烘干72h，球磨机磨碎，待测；
[0054] c.进行测定：
[0055] 使用质谱仪测定植物与土壤样品中13C与15N的丰度，使用碳氮分析仪测定样品的 总碳、全氮。
[0056] (4)计算：
[0057] 依据Janzen and Bruisma(1989)所提出的方法进行计算。
[0058] 加入示踪元素时，常常使用的SI标准单位原子百分超atom% excess(atom percent excess)表示同位素的相对含量。原子百分超是指某试验样品中，稳定性核素的丰 度与其天然丰度之差。氮和碳同位素原子百分超的计算公式如下：
[0059] 15N原子百分超（atom% 15N excess)=样品中15N的丰度-天然丰度（1)
[0060] 13C原子百分超（atom% 13C excess)=样品中13C的丰度-天然丰度（2)
[0061] 实际计算过程中，植株某部分或土壤的15N(13C)原子百分超通常使用标记部分的 15n(13c)丰度减去未标记的对照植株或土壤该部分的15N( 13C)丰度。
[0062] 根际沉积氮（碳）百分比是指根际沉积氮（碳）占土壤全氮（总碳）的比例。常 用的表不方法分别是 NdfR(Nitrogen derived from Rhizodeposition)和 CMfR(Carbon derived from Rhizodeposition)，使用的计算公式如下：
[0063]
【权利要求】
1. 一种同位素茎杆双标记示踪方法，其特征在于，该方法步骤如下： (1) 材料的准备； (2) 进行标记； (3) 取样与测定； (4) 计算。
2. 根据权利要求1所述的一种同位素茎杆双标记示踪方法，其特征在于，所述步骤（1) 中准备的材料如下：气相色谱瓶、脱脂棉线、缝衣针、穿针器、铜丝、塑料管、丰度为99%的 15N-尿素、丰度为99%的13C-葡萄糖，体积分数为75%的酒精水溶液、棉球、镊子、喷壶、U型 铁丝。
3. 根据权利要求1所述的一种同位素茎杆双标记示踪方法，其特征在于，所述步骤（2) 中进行标记的方法如下：在植物的营养生长末期进行标记，在植株待标记部位钻孔，用脱脂 棉线穿过此孔，将脱脂棉线的两端插入装有标记溶液的试剂瓶中；所述脱脂棉线外套有塑 料管，以防止标记溶液的损失；用铜丝固定脱脂棉线、塑料管和植株之间不错位，并且固定 牢固，防止间隙太大造成溶液蒸腾损失；所述标记溶液为配制好的丰度为99%的 13C-葡萄 糖和丰度为99%的15N-尿素混合溶液，标记2次，中间间隔1周时间，每次加入lmL的标记 溶液，吸收完毕后，再加入lmL?2mL的去离子水，以使脱脂棉线上残留的溶液全部被植物 吸收；在全部标记过程完成后，将标记用的材料及装置从植物上取下，收集保存。
4. 据权利要求3所述的一种同位素茎杆双标记示踪方法，其特征在于，所述进行标记 的具体步骤如下： ① 将植株周围的障碍物清除，防止操作过程中带来不便，以及造成污染； ② 用体积分数为75%的酒精水溶液喷手、镊子以及会接触到的物品，进行消毒，防止感 染植株； ③ 用镊子夹着棉球蘸取体积分数为75 %的酒精水溶液，在植物待标记部位表面涂抹， 进行消毒； ④ 用穿针器将脱脂棉线穿入针头，将针穿过塑料管，从塑料管中部出口拉出，要防止脱 脂棉线滑出； ⑤ 将针穿过植株，从塑料管中部出口的另一端进入，从塑料管未穿线的一端出口拉 出； ⑥ 用铜丝将塑料管的两部分并拢、并固定在标记植物上； ⑦ 用U型铁丝带动软管穿过预开口的气相色谱瓶盖，然后取下小瓶，取下U型铁丝，然 后拧上小瓶，所述脱脂棉线末端要到达气相色谱瓶底端； ⑧ 用体积为lmL的注射器往瓶内加入标记溶液，吸收完成后再加入lmL?2mL去离子 水，不标记的空白处理加入与标记溶液同样体积的去离子水； ⑨ 在标记溶液被完全吸收后，将标记用的材料及装置从植株上取下； ⑩ 标记完成后，在所标记的植株地表罩上孔径为lmm的丝网，定期收集落叶，防止落叶 中的同位素影响土壤。
5. 根据权利要求1所述的一种同位素茎杆双标记示踪方法，其特征在于，所述步骤（3) 中取样与测定的方法如下： a.材料的准备； b.进行取样； C.进行测定。
6. 根据权利要求5所述的一种同位素茎杆双标记示踪方法，其特征在于，所述步骤a中 准备的材料如下：自封袋、记号笔、镊子、铲子、筛子、磨样机、纸袋、塑料布、天平、纸袋。
7. 根据权利要求5所述的一种同位素茎杆双标记示踪方法，其特征在于，所述步骤b中 取样步骤如下： ① 将所标记的植物地上部分齐地面剪下，按植物的不同器官分类，装入纸袋中，分别在 60°C下烘干72h，称重，使用球磨机磨样，待测； ② 将所标记的植物所用土壤取出； ③ 将土壤捣碎，全部过孔径为2mm的筛子，得到主根系，用蒸馏水洗净，经所得主根系 在60°C下烘干72h，称重，磨碎，待测； ④ 称量全部土壤的质量，将土壤充分混合均匀后取l〇〇g，烘干测定含水量； ⑤ 另取l〇〇g 土壤，通过湿筛法用200目筛子筛洗，得到土壤中的剩余细根，将所得细根 洗净并在60°C下烘干72h，称重； ⑥ 取适量土样，在60°C下烘干72h，球磨机磨碎，待测。
8. 根据权利要求5所述的一种同位素茎杆双标记示踪方法，其特征在于，所述步骤c中 测定方法如下：使用质谱仪分别测定所标记的植物样品与土壤样品中 13C与15N的丰度，使 用碳氮分析仪分别测定样品所标记的植物样品与土壤样品中的总碳和全氮含量。
【文档编号】G01N33/00GK104142382SQ201410342182
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】曾昭海, 臧华栋, 胡跃高, 杨学超, 陈恭 申请人:中国农业大学