专利名称：生产l－亮氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及生产L-亮氨酸的方法，尤其是用埃希氏菌属细菌生产L-亮氨酸的方法。L-亮氨酸是一种必需氨基酸，可以用作食品和饲料的营养添加剂、药物治疗、制药业或化学工业的试剂或材料，或用于生产诸如酪氨酸之类的其它氨基酸的生长因子。
过去，主要采用属于短杆菌属、棒状杆菌属或沙雷氏菌属的产生L-亮氨酸的细菌或其突变体已生产了L-亮氨酸(Amino acid fermatation,JAPAN SCIENTIFIC SOCIETY’S PRESS，第397-422页，1996)。
当采用黄色短杆菌VKPM B-2736时获得最高水平的L-亮氨酸累积，该菌株在实验室发酵罐中在含葡萄糖的培养基上发酵72小时，产生的L-亮氨酸浓度高至26g/L(USSR作者证书1394711)。而乳发酵短杆菌34在具有蔗糖的培养基上产生的L-亮氨酸高至34g/L(Appl.Environ.Microbiol.,51，第1024页(1986))。
如上所述，L-亮氨酸的生产力已经提高到某些程度，然而，需要开发更有效和成本更有效的生产L-亮氨酸的方法，以便满足未来对L-亮氨酸日益增加的需求。
另一方面，属于埃希氏菌属的微生物由于其快速的生长速率、通过遗传分析获得的突出的数据和丰富的遗传材料，可潜在地用作有效的L-亮氨酸生产菌。然而，有几篇报道公开了采用埃希氏菌属细菌生产L-亮氨酸。
作为埃希氏菌属的L-亮氨酸生产细菌菌株，抗β-噻吩基丙氨酸菌株、抗β-噻吩基丙氨酸和β-羟亮氨酸的菌株(关于这两种，参见日本专利公告62-34397)和抗4-氮杂亮氨酸或5,5,5-三氟亮氨酸的菌株(日本专利公开公告8-70879)是已知的。
然而，既不知道埃希氏菌属的L-亮氨酸抗性菌，也不知道L-亮氨酸抗性和L-亮氨酸生产力之间的关系。
从上述观点来看，已经进行了本发明，本发明的一个目的是提高埃希氏菌属细菌L-亮氨酸的生产力，并提供有效和成本有效的L-亮氨酸的生产方法。
为了达到上述目的而努力研究的结果，本发明人已经发现赋予埃希氏菌属细菌L-亮氨酸抗性使L-亮氨酸的生产力提高，并完成了本发明。
就是说，本发明提供属于埃希氏菌属的细菌，它具有产生L-亮氨酸的能力并且抗L-亮氨酸。
另一方面，本发明提供上述细菌，它还抗亮氨酸类似物。该亮氨酸类似物例如为4-氮杂亮氨酸、3-羟亮氨酸、β-2-噻吩基丙氨酸和5,5,5-三氟亮氨酸等等，最好是4-氮杂亮氨酸和3-羟亮氨酸。
在再一方面，本发明提供属于埃希氏菌属的细菌，它通过从属于埃希氏菌属的细菌中选择抗L-亮氨酸和亮氨酸类似物的菌株而获得，其中所述选择对于L-亮氨酸和亮氨酸类似物的每种至少进行一次。
在又一方面，本发明提供生产L-亮氨酸的方法，它包括以下步骤在培养基中培养下述任何一种细菌(1)具有生产L-亮氨酸的能力并且抗L-亮氨酸和一种或多种亮氨酸类似物的埃希氏菌属细菌；(2)具有生产L-亮氨酸的能力并且抗L-亮氨酸和抗4-氮杂亮氨酸或3-羟亮氨酸的埃希氏菌属细菌；或(3)通过从属于埃希氏菌属的细菌中选择抗L-亮氨酸和一种或多种亮氨酸类似物的菌株而获得的埃希氏菌属细菌，其中所述选择对每种L-亮氨酸和亮氨酸类似物至少进行一次；以在该培养基中生产和积累L-亮氨酸，以及从该培养基中回收L-亮氨酸。
下面详细解释本发明。<1>本发明的属于埃希氏菌属的细菌本发明的细菌是属于埃希氏菌属的细菌，它具有生产L-亮氨酸的能力并且抗L-亮氨酸。作为属于埃希氏菌属的细菌可以例举大肠杆菌。属于埃希氏菌属、具有生产L-亮氨酸能力的细菌的例子例如为对亮氨酸类似物(诸如β-2-噻吩基丙氨酸、3-羟亮氨酸、4-氮杂亮氨酸和5,5,5-三氟亮氨酸)具有抗性的细菌，它们在日本专利公告62-34397号和日本专利公开公告8-70879号中进行了描述；和如WO96/06926中描述的可以通过遗传工程技术培育的细菌。通过从属于埃希氏菌属具有生产L-亮氨酸能力的细菌中选择抗L-亮氨酸的细菌，可以获得本发明的属于埃希氏菌属的细菌。或者，通过从属于埃希氏菌属抗L-亮氨酸的细菌中选择具有生产L-亮氨酸能力的细菌，也可以获得本发明的属于埃希氏菌属的细菌。属于埃希氏菌属细菌的最佳实施方案是还对亮氨酸类似物具有抗性。
在属于埃希氏菌属的细菌中，L-亮氨酸通过L-亮氨酸固有的生物合成途径进行合成，该途径从L-缬氨酸生物合成系统的最后中间产物(2-酮异戊酸)分叉。在属于埃希氏菌属的细菌中，分别用由ilvGMEDA操纵子编码的一组酶和由leuABCD操纵子编码的一组酶进行L-缬氨酸生物合成的最后一个步骤和L-亮氨酸固有的生物合成。
leuABCD操纵子包括leuA、leuB、leuC和leuD基因。在它们中，leuA编码α-异丙基苹果酸合酶，leuB编码β-异丙基苹果酸脱氢酶，leuC和leuD编码α-异丙基苹果酸异构酶。在这些酶中，α-异丙基苹果酸合酶催化从α-酮异戊酸至α-异丙基苹果酸的合成反应，α-异丙基苹果酸异构酶催化从α-异丙基苹果酸至β-异丙基苹果酸的异构反应，而β-异丙基苹果酸脱氢酶催化从β-异丙基苹果酸至L-亮氨酸生物合成最后一个中间产物α-酮异己酸的脱氢反应。从α-酮异己酸至终产物L-亮氨酸的氨基化反应主要由转氨酶催化。属于埃希氏菌属的细菌具有四种转氨酶，即由aspC基因编码的转氨酶A(天冬氨酸-谷氨酸转氨酶)、由包含在ilvGMEDA操纵子内的ilvE基因编码的转氨酶B(BCAA转氨酶)、由avtA基因编码的转氨酶C(丙氨酸-缬氨酸转氨酶)和由tyrB基因编码的转氨酶D(酪氨酸转氨酶)。这些酶参与各种氨基化反应。在这些酶中，转氨酶B和转氨酶D催化从α-酮异己酸至L-亮氨酸的上述氨基化反应。转氨酶C和转氨酶D催化L-缬氨酸生物合成的最后一个步骤，它包括L-缬氨酸生物合成和L-亮氨酸生物合成中共同的途径。
在L-亮氨酸生物合成途径中的上述反应中，速率决定步骤是由α-异丙基苹果酸合酶催化的从α-酮异戊酸至α-异丙基苹果酸的合成反应，该反应由L-亮氨酸反馈抑制。此外，leuABCD操纵子的表达受L-亮氨酸的阻遏。编码羟乙酸合酶Ⅰ的ilvBN基因的表达受L-缬氨酸和L-亮氨酸的协同阻遏，编码羟乙酸合酶Ⅱ的ilvGM基因的表达受L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸的协同阻遏，而编码羟乙酸合酶Ⅲ的ilvIH基因的表达受L-亮氨酸的阻遏。
受抑制的α-异丙基苹果酸合酶以及受阻遏的leuABCD操纵子仅涉及L-亮氨酸的生物合成。因此，即使存在过量的L-亮氨酸，以上抑制和阻遏也不导致切断供应任一营养物质的途径。此外，尽管ilvIH基因的表达受阻遏，但不影响编码其它同工酶的ilvBN基因和ilvGM基因的表达。因此，认为过量L-亮氨酸的存在不影响细胞的生长，然而本发明人意外地发现在过量的L-亮氨酸存在下细胞生长受抑制。此外，本发明人通过赋予L-亮氨酸抗性，成功地提高了埃希氏菌属细菌的L-亮氨酸的生产力。
下面解释获得属于埃希氏菌属具有L-亮氨酸抗性的细菌和属于埃希氏菌属具有亮氨酸类似物抗性的细菌的方法。
通过将属于埃希氏菌属的细菌培养于含有引起生长抑制的浓度的L-亮氨酸的基本培养基中，可以获得属于埃希氏菌属具有L-亮氨酸抗性的细菌。此中的生长抑制是指缓慢生长或停止生长。所述突变体的选择可以进行一次或多次。该培养基中L-亮氨酸的浓度不特别限制，但其例子可以为1g/L或更多，最好为1g/L-20g/L。将属于埃希氏菌属的细菌在该选择前经过突变处理。可以通过紫外辐射或通过用通常用于人工诱变的诱变剂(诸如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸等等)处理，来进行突变。
按上述获得的属于埃希氏菌属具有L-亮氨酸抗性的细菌可以在L-亮氨酸存在下生长，L-亮氨酸的浓度使得它们的亲代菌株不能生长。
如上所述，L-亮氨酸涉及L-亮氨酸生物合成的几个调节步骤。因此，引起L-亮氨酸抗性的单个突变可能对L-亮氨酸生产力有效，然而，最好是通过双突变或多突变脱敏多个调节。属于埃希氏菌属具有单个突变的细菌即使其L-亮氨酸生产力低，也可以用作培育L-亮氨酸生产菌株的起始来源。
通过将属于埃希氏菌属的细菌在含有生长抑制浓度的亮氨酸类似物的基本培养基中培养并选择生长的菌株，可以获得属于埃希氏菌属具有对亮氨酸类似物抗性的细菌。所述亮氨酸类似物的例子为4-氮杂亮氨酸、3-羟亮氨酸、α-噻吩基丙氨酸和5,5,5-三氟亮氨酸等等，最好是4-氮杂亮氨酸和3-羟亮氨酸。
可以用一种亮氨酸类似物，或者用多种亮氨酸类似物进行亮氨酸类似物抗性突变体的选择。所述突变体的选择对于一种亮氨酸类似物可以进行一次或多次。
加入该培养基中的亮氨酸类似物的量取决于亮氨酸类似物的种类，但在4-氮杂亮氨酸或3-羟亮氨酸的情况下最好为0.1g/L或更多。在以上述同样方式进行选择之前，可以将属于埃希氏菌属的细菌经过突变处理。
在选择属于埃希氏菌属具有亮氨酸类似物抗性以及亮氨酸抗性的细菌的情况下，对于每种抗性的选择的任何顺序都是可接受的，该顺序不受限制。
在使用大肠杆菌K-12或其衍变株作为埃希氏菌属细菌的情况下，除赋予对L-亮氨酸和/或L-亮氨酸类似物的抗性外，最好是赋予L-缬氨酸抗性。K-12菌株不表达羟乙酸合酶的活性同工酶Ⅱ，因为在编码支链氨基酸生物合成途径的一个羟乙酸合酶的同工酶Ⅱ大亚基ilvG基因中存在移码突变(Proc Natl.Acad.Sci.USA 78,922-925,1981)。该同工酶Ⅱ不受L-缬氨酸的反馈抑制，然而其它同工酶同工酶Ⅰ和同工酶Ⅲ受L-缬氨酸的反馈抑制。因此，K-12菌株不能在存在过量L-缬氨酸的基本培养基中生长，因为L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸的生物合成受抑制。因此，为了获得得自K-12菌株的L-亮氨酸生产菌株，最好使用其中读框恢复的ilvG基因回复突变的菌株，以便恢复该羟乙酸合酶的活性。具有ilvG基因回复突变的这样一种菌株将表达L-缬氨酸抗性(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,922-925,1981)。通过将K-12菌株培养于含有L-缬氨酸的基本培养基中，并以用于L-亮氨酸抗性或亮氨酸类似物抗性的同样方式进行选择，可以获得具有L-缬氨酸抗性的K-12菌株。
然而，与上述K-12菌株的情况不一样，在使用属于埃希氏菌属具有不受L-缬氨酸反馈抑制的羟乙酸合酶的细菌培育属于埃希氏菌属具有L-亮氨酸抗性的细菌的情况下，不需要赋予该埃希氏菌属细菌L-缬氨酸抗性。
通过一般的突变处理或遗传工程技术，可以提高本发明的属于埃希氏菌属的细菌L-亮氨酸生物合成途径的一种或多种酶的活性。通过在质粒、噬菌体或转座子中插入含有完整或部分ilvGMEDA操纵子和/或leuABCD操纵子的DNA片段获得重组DNA，将该重组DNA导入属于埃希氏菌属的细菌，可以使这种该酶的活性提高。
在Nucleic Acid Res.,20,3305-3308(1992)中描述了leuABCD操纵子的核苷酸序列的分析。leuABCD操纵子的完整序列已经记录于该数据库(DDBJ登记号D10483,DDBJ的互联网网址http://www.ddbj.nig.ac.jp)中。通过按照PCR(聚合酶链式反应，参阅White,T.J.等，Trends Genet.,5,185(1989))扩增该DNA片段，可以获得具有leuABCD操纵子的DNA片段，其中使用在上述序列的基础上制备的寡核苷酸作为引物，将属于埃希氏菌属细菌的染色体DNA作为PCR的模板。或者，根据应用在上述序列的基础上制备的寡核苷酸探针进行的杂交，筛选属于埃希氏菌属细菌的染色体DNA文库，也可以获得leuABCD操纵子。
在Nucleic Acid Res.,15,2137-2155(1987)和Gene,97,21-27(1991)中分别描述了ilvGMEDA操纵子的完整的核苷酸序列和该操纵子上游区域的核苷酸序列。通过用在上述序列的基础上制备的寡核苷酸探针或引物进行PCR或杂交，可以获得具有ilvGMEDA操纵子的DNA片段。有时，在使用大肠杆菌K-12或其衍变株获得ilvGMEDA操纵子的情况下，最好使用其中读框恢复的ilvG基因回复突变的菌株，以便恢复该羟乙酸合酶的活性。在WO96/06926和Fr2627508中分别全面地描述了获得ilvGMEDA操纵子的方法和在属于埃希氏菌属细菌的细胞中扩增该操纵子的方法。<2>生产L-亮氨酸的方法通过将可以按上述获得的细菌培养在培养基中，在该培养基中生产并积累L-亮氨酸以及从该培养基中回收L-亮氨酸，可以有效地生产L-亮氨酸。
在本发明的方法中，该属于埃希氏菌属细菌的培养、从该培养基中收集和纯化L-亮氨酸可以用细菌生产亮氨酸的常规发酵方法的相似方式进行。培养所用的培养基可以或者为合成培养基，或者为天然培养基，只要该培养基包括碳源和氮源以及矿物质和需要时的合适量的所用细菌生长所需的营养物。该碳源可以包括一种或多种不同的碳水化合物(诸如葡萄糖和蔗糖)和各种有机酸。关于所用细菌的同化方式，可以使用包括乙醇和甘油在内的醇。作为氮源，可以使用各种铵盐，诸如氨和硫酸铵；其它氮化合物，诸如胺类；天然氮源，诸如蛋白胨、大豆水解产物或经消化的发酵微生物。作为矿物质，可以使用磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰或碳酸钙。
最好在需氧条件下进行该培养，诸如震荡培养和通气搅拌培养，温度为20-40℃，最好为30-38℃。该培养物的pH一般为5-9，最好为6.5-7.2。可以用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液调节该培养物的pH。通常，培养1-3天使得在该液体培养基中积累靶L-亮氨酸。
培养后，通过离心和膜过滤从该液体培养基中除去诸如细胞的不溶性物质，然后收集靶L-亮氨酸，通过离子交换、浓缩和沉淀进行纯化。
本发明的属于埃希氏菌属的细菌可以用作培育L-亮氨酸生产菌株或用于L-亮氨酸生产菌株的起始来源。与先前已知的用属于埃希氏菌属的细菌生产L-亮氨酸的方法相比，本发明使得可能更有效地生产L-亮氨酸。
下面参考实施例更具体地解释本发明。
实施例1大肠杆菌L-亮氨酸抗性菌株的构建<1>L-亮氨酸抗性菌株的选择通过按下述逐步选择，从标准实验室野生型菌株大肠杆菌K-12构建具有L-亮氨酸抗性和亮氨酸类似物抗性的大肠杆菌菌株。通过选择具有该抗性的自发突变体获得具有每种抗性的突变体菌株。具体地说，将待选择的大肠杆菌K-12或其突变体平板接种于包含以下所示各种浓度的L-亮氨酸或亮氨酸类似物的琼脂平板上。然后，选择生长的菌株。
首先，在选择具有L-亮氨酸抗性和亮氨酸类似物抗性的菌株之前，从大肠杆菌K-12选择抗5g/LL-缬氨酸的突变菌株，获得菌株B-5(Valr)。从菌株B-5，选择出抗1g/LL-亮氨酸的突变菌株，命名为第325号(Valr,Leur)。然后，从第325号菌株选择出抗0.1g/L4-氮杂-D,L-亮氨酸(下文称为“4-氮杂亮氨酸”)的突变菌株，获得第244号菌株(Valr,Leur,ALr)。从第244号菌株选择出抗2g/L4-氮杂亮氨酸的菌株，获得菌株70号(Valr,Leur,ALrr)。符号Valr、Leur、ALr分别代表赋予对L-缬氨酸、L-亮氨酸或氮杂亮氨酸抗性的菌株。符号ALrr代表赋予氮杂亮氨酸抗性两次的菌株。<2>L-亮氨酸抗性和L-亮氨酸生产之间的关系为了研究L-亮氨酸抗性和L-亮氨酸生产之间的关系，按上述从第70号菌株获得抗15g/LL-亮氨酸的自发突变菌株。
检测从第70号菌株随机分离的7个菌落和从得自第70号菌株的L-亮氨酸抗性突变体随机分离的10个突变体的L-亮氨酸生产。结果，得自第70号菌株的任何亮氨酸抗性突变体都比亲代菌株产量高。生产平均增加60％。
实施例2从大肠杆菌K-12培育L-亮氨酸生产菌株通过按下述逐步从大肠杆菌K-12选择对L-缬氨酸、氮杂亮氨酸、羟亮氨酸和L-亮氨酸具有抗性的菌株，构建L-亮氨酸生产菌株。具体地说，将待选择的大肠杆菌菌株平板接种于包含以下所示各种浓度的L-缬氨酸、亮氨酸类似物或L-亮氨酸的琼脂平板上。然后，选择生长的菌株。
从大肠杆菌K-12选择出抗5g/LL-缬氨酸的突变菌株，获得第101号菌株(Valr)，它不生产L-亮氨酸。从第101号菌株选择出抗1.3g/L氮杂亮氨酸的突变菌株。获得的第51号菌株(Valr,ALr)产生大约0.05-0.1g/L的L-亮氨酸。然后，从第51号菌株选择出抗2g/L3-羟基-D,L-亮氨酸(下文称为“羟基亮氨酸”)的突变菌株，获得第4号菌株(Valr,ALr,Hleur)。符号“Hleur”代表赋予羟亮氨酸抗性的菌株。第4号菌株生产更多的亮氨酸(大约0.4-0.6g/L)。
第4号菌株用NTG处理，选择出抗l5g/LL-亮氨酸的突变体。结果，获得第57号和第103号两个突变菌株(Valr,ALr,Hleur,Leur)。这些突变体的亮氨酸生产量达到15-17g/L。
在以上菌株中，第4号(大肠杆菌K-12,4)、第57号(大肠杆菌K-12,57)和第103号(大肠杆菌K-12,103)已经根据布达佩斯条约保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(俄罗斯113545莫斯科1 Dorozhnyproezd,1)中，保藏号分别为VKPM-7387、VKPM-7386和VKPM-7388。
实施例3用第57号和第103号菌株生产L-亮氨酸让第57号和第103号菌株细胞于37℃在M9琼脂平板上生长30小时。将每个铂环量的培养物接种到含有15ml发酵培养基摇瓶(250ml)中，所述发酵培养基含有(％)葡萄糖(6)、硫酸铵(1.5)、磷酸氢钾(0.15)、硫酸镁(0.1)、硫胺素(0.00001)、碳酸钙(2)。该培育于32℃在旋转摇床上(250rpm)进行48小时。第57号菌株的L-亮氨酸生产量为1.5g/L，第103号菌株的L-亮氨酸生产量为1.7g/L。
权利要求
1．属于埃希氏菌属的细菌，它具有生产L-亮氨酸的能力并且抗L-亮氨酸。
2．权利要求1中定义的细菌，它还抗一种或多种亮氨酸类似物。
3．权利要求2中定义的细菌，所述亮氨酸类似物选自4-氮杂亮氨酸和3-羟亮氨酸。
4．属于埃希氏菌属的细菌，它通过从属于埃希氏菌属的细菌中选择抗L-亮氨酸和一种或多种亮氨酸类似物的菌株而获得的，其中所述选择对每种L-亮氨酸和亮氨酸类似物至少进行一次。
5．生产L-亮氨酸的方法，它包括以下步骤在培养基中培养按照权利要求1-4的任一项的细菌，以生产和在该培养基中积累L-亮氨酸，以及从该培养基中回收L-亮氨酸。
全文摘要
通过在培养基中培养属于埃希氏菌属具有生产L－亮氨酸能力并且抗L－亮氨酸的细菌,在该培养基中生产和积累L－亮氨酸,并从该培养基中回收L－亮氨酸,来生产L－亮氨酸。
文档编号C12N1/20GK1222576SQ98121460
公开日1999年7月14日 申请日期1998年10月29日 优先权日1998年10月29日
发明者G·M·马科维奇, R·Y·佐格夫纳, L·M·格里戈列夫纳, B·T·艾力克圣佐夫纳, I·L·威勒列夫纳, A·V·扎芬诺维奇, K·E·摩尔西维奇, L·V·阿卡狄维奇, K·Y·艾芬诺维奇, D·V·佐格维奇 申请人:味之素株式会社