专利名称：一种利用微生物发酵生产α、ω－长链二元酸的方法
技术领域：
本发明涉及利用微生物发酵从正烷烃生产α，ω-长链二元酸的方法，特别是生产C12～C15长链二元酸的方法。
长链二元酸是难以用化学合成法生产的精细化工原料，它们被广泛地应用于香料、热熔胶、工程塑料、增塑剂和液晶等材料的合成。
从七十年代起，利用微生物发酵从C10～C18正烷烃生产长链二元酸开始进入试验室应用研究阶段，经过10多年的研究，到85年日本率先建立年产200吨的工业化生产装置。
十三碳二元酸(DCA13)是合成麝香-T(Musk-T)、高档服装用热熔胶等的重要原料；十二碳二元酸(DCA12)主要用于合成特性高级工程塑料，如尼龙12和尼龙1212。在长链二元酸中上述两种二元酸用途最广，市场用途最大，其社会效益和经济效益最为显著。
在公开的专利中，具有实际应用价值的文献是US4339536、CN1130685A、CN1162644A以及CN1092108A、CN1017350B和CN1026129C，其中，后三种专利文献分别公开了利用可同化正烷烃作生长碳源的热带假丝酵母氧化正烷烃生产长链二元酸的方法，但是这三篇专利只是分别对应十五碳二元酸、十六碳二元酸和十七碳二元酸效果较好，每篇专利的实例中只有以上所对应的烷烃转化二元酸数据。对应这三种专利的实例中结果分别为在2.5M3发酵罐中发酵144小时，乙醚萃取NaOH标准溶液滴定分析发酵清液中DCA15为178g/L；在10升发酵罐中，发酵117小时，气相色谱分析DCA16为123.4g/L，转化率79％；发酵140小时，乙醚萃取NaOH标准溶液滴定分析发酵液中DCA17为133g/L，转化率61.8％；US4339536所提出微生物发酵生产长链二元酸的方法，也是利用可同化正烷烃的热带假丝酵母(Candida tropicalis)在含有正烷烃的培养基中，在pH 3～5条件下培养6～24小时，然后调节pH 6.5～7.5开始产酸.发酵结束后，将发酵液pH调至10～13，加2～8％硅藻土混合在6～8Kg/cm2压力下过滤，用2～3倍水洗涤，将洗涤水和滤液混合，用H2SO4酸化至pH4以下，加热70～80℃维持8小时。经过滤、洗涤和干燥得到二元酸产品。在实施例三中，将120L种子液接种至1200L发酵培养基中，发酵84小时，DCA13为45g/L，在实施例四中DCA12为42g/L。
CN116244A公开了生产十三碳二元酸的方法。①利用一株可同化正烷烃的热带假丝酵母(Candida tropicals)突变株P-12-242，用烷烃种子培养基培养种子；②将种子液接入含有正烷烃的发酵培养基中，28小时内pH控制6.8以下，以菌体生长为主，并产一定数量的二元酸；28～60小时，pH控制在7.3以上，以产酸为主。增加一定量菌体，60小时后pH控制7.5～7.8，再积累二元酸。在2.5M3发酵罐内发酵161小时，发酵清液中DCA13最高达205g/L(乙醚萃取NaOH标准液滴定分析)，转化率达94％；③发酵结束后，调pH10～12，加热85～90℃，破乳分层，将清液层和分离菌体后的清液合并，加入活性炭，在85～90℃脱色30min，过滤后，加热脱色液至60～70℃，酸化pH 4～5，冷却至70℃，压滤干燥，其DCA13纯度达96～97％。
CN1130685A公开了一种生产长链二元酸的方法，对十二碳二元酸的效果较好，实例中也只有关于十二碳二元酸的数据。①利用一株可同化正烷烃的热带假丝酵母(Candida tropicals)突变株UH-2-48，用烷烃培养基培养种子；②将种子液接入发酵液培养基中，以正烷烃为生长碳源培养菌体约40～48小时。然后调pH至7.0～7.8以产酸为主，在3M3发酵罐中发酵130小时，DCA12为145g/L(分析方法同CN116244A)，转化率为90％，最终产品纯度达97.1％。
上述专利文献中，虽然US4339536生产DCA12和DCA13产量相当，但最高仅为45g/L，而其它专利文献所公开的生产长链二元酸的方法，只是对某一种二元酸而言产量较高，对其它长链二元酸来说其效果欠佳，并且以上所述的各种方法中都是利用可同化烷烃作生长碳源的微生物进行发酵，无论是种子培养还是发酵用菌体的培养都是利用烷烃作生长碳源，必然要消耗部分烷烃用于细胞合成，从而降低了烷烃对二元酸的转化率。
本发明的目的是提出一种利用难以同化烷烃作生长碳源的微生物发酵生产长链二元酸的方法，从C10～C18正烷烃中经发酵生产相应碳数的长链二元酸或混合二元酸，特别是针对C12～C15长链二元酸，产酸量和转化率均较高。
本发明所用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicals)突变株PF-UV-56，该突变株保藏正在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为中国.北京.中关村)，保藏日期为98年8月31日，保藏编号为CGMCC №0356。它是一株难以在正烷烃作生长碳源上生长及不能在长链二元酸作生长碳源上生长的突变株。
以糖质(如蔗糖、葡萄糖、纤维二糖、半乳糖中的一种或几种)等在生长期作生长碳源迅速增殖细胞，生长期仅为12～20小时；在产酸期以C1～C3一元酸盐或C1～C3一元醇作二次生长碳源维持菌体一定比生长速率和较高的产酸速率，提高产酸量和烷烃转化率。
Candida tropicals PF-UV-56突变株生理特性如下一、形态特征斜面菌呈缎丝状；液体培养大部分为单一细胞，呈卵圆形。两端芽殖，不产子囊胞子，有膜；菌落也不规则，有皱摺，呈梅花状。
二、生理特性不同化硝酸盐，难以同化正烷烃作生长碳源，能同化葡萄糖、蔗糖、纤维二糖、半乳糖，能同化C1～C3一元酸盐和C1～C3一元醇；不能同化棉子糖、乳糖、鼠李糖；能发酵蔗糖、麦芽糖、半乳糖和葡萄糖，不同化肌醇、赤藓糖。在39℃微弱生长，牛奶反应阴性。
本发明的种子培养基可以为
(1)斜面培养基10Brix麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；(2)液体种子培养基蔗糖10～40g/L，金属磷酸盐2～10g/L，酵母膏1～3g/L，玉米浆1～3g/L，尿素1～4g/L，NaCl 0.5～1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5～3g/L，维生素B120～200ppm，正烷烃0～50ml/L，自来水配制，自然pH。
正烷烃可以是C10～C18正烷烃，较好是C12～C15烷烃。
本发明的发酵培养基为蔗糖20～40g/L，金属磷酸盐2～10g/L，酵母膏0.5～2g/L，玉米浆0.5～2g/L，尿素1～2g/L(分消)，NaCl 0.5～2.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，维生素B120～200ppm，铵盐2～8g/L(分消)，C1～C3一元酸盐或一元醇5～15g/L，正烷烃50～350ml/L，自来水配制，自然pH。
金属磷酸盐可以是钾盐或钠盐；C1～C3一元酸盐可以是甲酸、乙酸或丙酸的钠盐或钾盐，一元醇指的是甲醇、乙醇和丙醇，它们适宜在糖质接近消耗殆尽进入产酸期前加入，也可以直接加入最初配制的培养基中；铵盐可以是(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4或CH3COONH4；正烷烃可以是C10～C18烷烃，特别是C12～C15正烷烃；在种子培养基中加入烷烃和发酵培养基在生长期加入烷烃的目的是起诱导合成长链二元酸相关酶作用和积累二元酸的作用，不是作生长碳源。
本发明培养种子的过程可以为1、取一接种环PF-UV-56酵母菌，涂布在无菌的固体斜面培养基上(φ20*200mm试管)，于29～32℃培养40～48小时。
2、取一支步骤1培养好的斜面菌种，全部接入装有经121℃，30min灭菌后的600ml种子培养基的3000ml三角瓶中，在180转/分旋转摇床上于29～32℃培养30～48小时，作摇瓶种子液。
3、采用逐级扩大培养方法，将步骤2培养好的摇瓶种子培养液接入含有液体种子培养基的种子罐内，于通气搅拌下培养12～36小时。培养温度29～32℃，采用逐级扩大培养方法培养种子直至满足发酵用接种量为止。
本发明生产长链二元酸的具体方法是将培养好的无杂菌的种子液接种至含发酵培养基的发酵罐内，在通气搅拌条件下于29～32℃培养12～20小时，主要消耗糖质如(蔗糖、葡萄糖、纤维二糖、半乳糖中的一种或几种)来迅速繁殖菌体，pH控制在4.5～6.5，罐压维持在0.01～0.1MPa；然后调节pH7.0以上转入产酸期，在转入产酸期前1～3小时，开始补加或流加二次生长碳源C1～C3一元酸盐或一元醇，以发酵混合液总体积为基准，按5～15g/L计量其总加入量，为菌体在产酸期继续繁殖提供生长碳源。在产酸期，根据发酵时间延续及二元酸积累量的增加逐渐上调pH值，其变化范围为7.0～8.5。以发酵混合液总体积为基准，总投油量为15～35％(V/V)，转入产酸期时发酵液中烷烃适宜含量为10～20％(V/V)，其余烷烃可以采用每隔12～36小时分批补加的方法加入，以维持进入产酸期后的前60～84小时内发酵液中的10～15％的较佳烷烃含量，总培养时间为72～168小时。通过加入二次生长碳源和维持发酵液中较佳烷烃含量，在产酸期以维持一定的细胞比生长速度和较高的产酸速度，提高产酸量和烷烃转化率。
发酵结束后，用无机酸如H2SO4、HCl或H3PO4直接酸化，再加热至70～85℃破乳分油，并使发酵液中大部分蛋白质固化变性，分去残油后，冷却至室温过滤，洗涤酸滤饼至中性，除部分去色素和可溶性蛋白等杂质；将含菌体的长链二元酸滤饼与水混合，加无机碱如氢氧化钠或氢氧化钾调pH至10～12，加热至60～70℃，加1～5％助滤剂过滤，除去菌体等固形物，用水洗涤滤饼至中性，将洗涤水和滤液合并，调pH6.8～8.0，加0.5～1％活性炭于20～70℃脱色20～40min，过滤得脱色液，酸化脱色液至pH 3～4，再加热至70～85℃维持2～6小时。然后缓慢冷却至60～70℃，再快速冷却至室温，经过滤、洗涤和干燥步骤，得到总酸纯度≥99％的白色长链二元酸产品。
与现有技与术相比，本发明具有菌株转化烷烃基质范围宽，以糖质作生长碳源发酵普遍产酸高、烷烃转化率高，特别是高产C12～C15长链二元酸的特点，以及在生产中具有菌体生长期短、产酸期长，生产效率高的应用效果。
实施例1(1)取一接种环PF-UV-56菌种，涂布在φ20*180大试管固体斜面培养基上于30℃培养48小时。
(2)将(1)培养好的菌种接入装有600ml种子培养基的3000ml三角瓶中于30℃在180转/分的摇床上培养72小时，每隔12小时调节pH在5.0～6.0。种子培养基组成为KH2PO46g/L，酵母膏2g/L，玉米浆2g/L，尿素2g/L，NaCl1g/L，MgSO4·7H2O1g/L，维生素B10.1g/L，C12～C15正烷烃各为15ml/L，即烷烃总量60ml/L，自来水配制，自然pH。分别于培养24、48和72小时测培养液中菌体浓度，其结果分别为未测出、0.07g干细胞/L和1.02g干细胞/L。本例表明本发明的热带假丝酵母(Candida tropicals)突变株PF-UV-56，即CGMCC №0356难以同化烷烃作生长碳源。
实施例2(1)取一接种环PF-UV-56菌种，涂布在φ20*180大试管固体斜面培养基上，重复操作，共接两支斜面，于30℃培养48小时。
(2)将(1)培养好的两支斜面菌种分别接入均装有600ml种子培养基的两个3000ml三角瓶中，于30℃在180转/分的摇床上培养36小时；培养基组成为蔗糖30g/L，KH2PO46g/L，酵母膏1g/L，玉米浆1g/L，尿素2g/L，NaCl1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，维生素B10.1g/L，正十三烷烃50ml/L，自来水配制，自然pH。
(3)将(2)培养好的无杂菌的1100ml摇瓶种子液，接入灭菌后的含有7.5升发酵培养基的13.7L发酵罐内，灭菌条件为121℃20min。按总发酵体积10升为基准，发酵培养基组成为正十三烷烃120ml/L、蔗糖30g/L、KH2PO44g/L、玉米浆1g/L、酵母膏1g/L、尿素1g/L(分消)，MgSO4·7H2O 0.5g/L、NaCl 1g/L，(NH4)2SO44g/L(分消)，维生素B10.05g/L，自来水配制，自然pH，在500ml三角瓶中加入50g醋酸钠和250ml水，并分消。于30℃、700rpm、通气量1vvm、罐压O.02MPa条件下培养15小时，此期间pH自然下降，降至5.2时开始自动控制，于培养15小时时加入醋酸钠，继续培养3小时，18小时时菌体浓度为16g干细胞/L，DCA13为9.7g/L，然后用10N氢氧化钠溶液调节并控制pH7.5培养24小时，以后每隔24小时上调0.1pH值，继续培养96小时发酵结束。发酵期间于42、66、90小时各补加500ml正十三烷烃，从接种到发酵结束，总培养时间为138小时，发酵液中菌体20g/L，正十三烷烃34.2g/L，放罐体积为10.4升，包括种子培养和发酵所用烷烃在内，总加入烷烃量为2.081kg。取发酵清液1毫升以癸二酸作内标，经酸化、乙醚萃取、去乙醚，用甲醇溶解，三氟化硼作催化剂于80～90℃酯化，再用正己烷萃取，用气相色谱分析DCA13为158g/L，发酵液中DCA13则为147g/L。将发酵液用水稀释一倍，用H2SO4酸化至pH4.0，加热80℃维持2小时，分去上层残油，然后自然冷却至室温，过滤并用水洗至中性，将滤饼与20L水混合，加热至50℃，用NaOH调pH至12，加1％酸性白土和2％硅藻土助滤剂过滤，初始滤液返回，至清液澄清时收集滤液，调节滤液pH至7.3，加热至65℃，加入1％粉末活性炭脱色30min，过滤得脱色液，用H2SO4将脱色液pH调至4.0，然后加热至83℃，并维持2小时，经8小时降温至70℃，再冷却至室温。过滤、洗涤至中性，酸滤饼在60℃烘干30小时，得到白色固体产品1.348kg，气相色谱分析总酸纯度为99.2％，DCA13纯度为97.8％，产品收率87.5％，烷烃对二元酸的重量转化率为88.5％。
实施例3按实施例2的方法，以100g乙醇取代醋酸钠，并从培养15小时开始流加至40小时结束。发酵基质为C12正烷烃，总培养时间为120小时，放罐体积为10.3升，菌体19.6g/L，正十二烷烃42g/L，结果见表1。
实施例4按实施例2的方法，发酵基质为C15正烷烃，醋酸钠改为醋酸钾，其中液体培养中的蔗糖变为25g/L，KH2PO44g/L，其它组分同实例2。从培养15小时开始流加醋酸钾至40小时结束。总培养时间138小时，放罐体积为10.5升，菌体19.3g/L，正十五烷烃36g/L，结果见表1。
实施例5按实施例2的方法，发酵基质为C14正烷烃，发酵培养基中直接加入醋酸钠，培养15小时上调pH7.3转入产酸期，以后每隔12小时上调0.05pH，总培养时间为120小时，放罐体积为10.2升，菌体20.5g/L，正十四烷烃30g/L，结果见表1。
比较例1按实施例2的方法，不加醋酸钠，发酵基质为C13正烷烃，总培养时间为138小时，测发酵清液中DCA13为133g/L。
比较例2取实施例2放罐发酵清液2毫升，测发酵清液产酸量，分析方法同CN116244A，其中得到的乙醚萃取相，用蒸馏水洗涤二次。测得的DCA13为188g/L。
表1 各例实施结果
注本表中的数据分析方法及计算同实例2。
权利要求
1.一种利用微生物发酵生产α，ω-长链二元酸的方法，包括用热带假丝酵母(Candida tropicals)突变株PF-UV-56，即CGMCC №356在包括糖质的多元底物作生长碳源的液体培养基中发酵，氧化C10～C18正烷烃，积累相应碳数的二元酸，并从发酵液中回收所积累的二元酸。
2.按照权利要求1所述的利用微生物发酵生产α，ω-长链二元酸的方法，其特征在于所述的液体培养基包括蔗糖20～40g/L，金属磷酸盐2～10g/L，酵母膏0.5～2g/L，玉米浆0.5～2g/L，尿素1～2g/L，NaCl 0.5～2.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2g/L，维生素B120～200ppm，铵盐2～8g/L，C1～C3一元酸盐或一元醇5～15g/L，正烷烃50～350mL/L，自来水配制，自然pH。
3.按照权利要求1所述的利用微生物发酵生产长链二元酸的方法，其特征在于所述的正烷烃是C12～C15。
4.按照权利要求1所述的利用微生物发酵生产长链二元酸的方法，其特征在于所述的热带假丝酵母(Candida tropicals)突变株PF-UV-56，即CGMCC №0356的液体种子培养基为蔗糖10～40g/L，金属磷酸盐2～10g/L，酵母膏1～3g/L，玉米浆1～3g/L，尿素1～4g/L，NaCl 0.5～1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5～3g/L，维生素B120～200ppm，正烷烃0～50mL/L，自来水配制，自然pH。
5.按照权利要求1所述的利用微生物发酵生产长链二元酸的方法，其特征在于在所述的二元酸发酵生产过程中，加入二次生长碳源。
6.按照权利要求5所述的利用微生物发酵生产长链二元酸的方法，其特征在于所述的二次生长碳源是C1～C3一元酸盐或一元醇。
7.按照权利要求2或6所述的利用微生物发酵生产长链二元酸的方法，其特征在于所述的C1～C3一元酸盐是钠盐或钾盐，C1～C3一元醇是甲醇、乙醇或丙醇。
全文摘要
本发明公开了一种利用微生物氧化C
文档编号C12P7/40GK1257126SQ9812108
公开日2000年6月21日 申请日期1998年12月16日 优先权日1998年12月16日
发明者刘树臣, 李淑兰, 方向晨, 佟明友 申请人:中国石油化工集团公司, 中国石油化工总公司抚顺石油化工研究院