专利名称：辛德毕斯病毒毒株全基因组序列及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种辛德毕斯病毒(XJ-160)毒株全基因组序列及其克隆方法。
病毒是一种可感染动物、人类，引起组织病变甚至引起动物、人类死亡的微生物。因此，对病毒的研究，对人类的身体健康具有重要意义，许多病毒学家致力于从分子水平研究其基因序列，以便了解病毒的来源、致病性、分类、进化等过程。
本发明目的是提供一种辛德毕斯病毒毒株全基因组序列及其克隆方法，该基因序列从分子水平阐明其与国外流行株的差异，它对了解病毒的来源、进化过程及分子流行病学有重要意义。
为达到上述目的本发明采用以下技术方案辛德毕斯病毒毒株全基因组序列的克隆方法，它包括以下步骤(1)病毒的培养及纯化；(2)病毒RNA的提取；(3)病毒RNA的反转录；(4)病毒基因序列扩增引物设计与合成；所述的引物是选择甲病毒保守区域的核苷酸序列设计引物；引物3’末端尽可能终止在简并密码子较少的氨基酸位置且最后一个碱基终止在氨基酸密码子的第二位碱基；引物扩增片段一般不超过1.4kb。
(5)目的基因的PCR扩增，将全基因分多个片段，用RT-PCR方法扩增相应的cDNA；(6)目的基因片段回收；(7)将目的基因片段与pGEM-T载体连接；(8)感受态细胞的制备；(9)连接产物的转化；(10)双链模板的提取及序列测序。
本发明优点本发明将全基因分15个片段，用RT-PCR方法扩增相应的cDNA，连入pGEM-T载体，利用通用引物测序，在扩增中所用引物根据甲病毒保守区域的核苷酸序列设计引物，引物3’末端可能终止在简单密码子较少的氨基酸位置，且最后一个碱基终止在氨基酸密码子的第二位碱基。本发明从分子水平阐明了本病毒与流行株的差异，对了解病毒的来源，进化过程及分子流行病学有重要意义，同时该病毒序列的测定为病毒载体构建奠定了基础，新型的以该病毒序列为基础的基因治疗载体有潜在的应用前景。
以下结合实施例对本发明作进一步说明
1.病毒培养及纯化取冻干保存的XJ-160病毒，加高压灭菌的PBS 1ml重溶，接种BHK细胞。BHK细胞种由本所虫媒室提供。细胞用Eagle′s培养，加10％的小牛血清和10％的双抗，37℃度培养。细胞长满单层后，弃去培养液，将病毒悬液加入，37℃吸附半小时后，弃去病毒悬液，加细胞维持液，细胞维持液除血清含量为2％以外，其余与细胞培养液相同。病毒接种约24小时后细胞开始出现病变，大部分细胞48后小时脱落。离心留取上清做为病毒空斑纯化的毒种。
空班纯化的方法如下将活化的毒种接种长满单层的BHK细胞，方法同上。接种后加含3％琼脂的固体Ealge′s培养物，37℃倒置培养24小时，然后加第二层含中性红的琼脂培养物，避光再培养24小时，待培养物中出现明显可见的噬斑后，用带有弯头的毛细小心吸取单斑，接种BHK细胞扩增，收获的病毒培养上清用于下一轮的单斑筛选。测序所用病毒为三轮单斑筛选后扩增的第一代病毒。
2.病毒RNA的提取取病毒感染后的细胞培养上清200ul，加入750ul总RNA提取缓冲液(Trizol，美国GIBCOBRL公司产品)和酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃12000rpm离心10分钟，取上清加等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃12000rpm，离心10分种，弃上清，沉淀用70％乙醇洗一次，凉干，管底沉淀物即为病毒的总RNA。溶于5ul超纯水。
3.病毒RNA的反转录取5ul总RNA，加入六随机引物1.0ul(10mM)70℃水浴10分钟，冰浴5分钟。加入5ul 5×first-strand buffer，2.5uldNTP(Mix 10mM)，1.0ul AMV 3ul(30u/ul)，1.0ul RNASin(40u/ul)，去离子水9.5ul，42度反应1小时。
4. XJ-160病毒基因序列扩增引物，根据甲病毒的保守序列设计引物，将全基因分14个片段分别扩增克隆测序。XJ-160病毒基因组RNA全长约11kb，为将全基因组克隆测序，共设计28个引物，分15个片段用RT-PCR方法扩增相应的cDNA，连入T载体，利用通用引物测序。设计简并引物时遵循了以下原则(1)选择甲病毒保守区域的核苷酸序列设计引物；(2)引物3’末端尽可能终止在简并密码子较少的氨基酸位置且最后一个硷基终止在氨基酸密码子的第二位硷基；(3)引物扩增的目的片段一般不超过1.4kb。
3’未端的测序方案根据甲病毒3’末端具有多聚A的特定，设计一个合14个T的引物3END，为提高引物的特异性，在引物3’末端添加D，与甲病毒3’末端高度保守的C匹配，另外在引物的5’末端随机核苷酸以平衡GC含量。此引物与DF10330配对可护增含有3’末端保守序列的片断。
扩增引物请见表1。
引物名称 表1 引物序列
F19 5′CTA TTG AAT CAA ACA GCC GAC CAA3′DR1153 5′ATT CGY TGG TTN ARC CCN ACC CAG3′F11135′TTC ACC TGA CGA TGC AC3′DR2249 5′GAT GAT NGC NGA CTT RCC3′F22305′GAG TAATAG GCA CAC CAG3′DR3123 5′TTC CAR WGC TTT NGC CCA GC3′F31005′TCAGCT GTA AGA CTA ATG3′R38705′AAG GTG CCT CCA GGG TTG3′DF3840 5′CGT TCG GCM CTS AAY TG3′R46705′TTG TAG TAC TGT ATC CC3′DF4385′ATC CAT CCR GAB AGY TG3′R57805′CTG GCC CTG TAT CCG TC3′DF5760 5′GTA GGT GGG TAC ATG TTY TC3′R65905′TAC CTC TTG CAA TGG GAC3′DF6559 5′GCN CTN TTY GCR AAG AC3′R75905′ATC TCT ACG GTG GTC CTA AAT3′F75905′ATT TAG GAC CAC CGT AGA GAT3′R81905′CGC TCC GTG GTG CCA GTT3′F81905′GAG CAC CCA GAA GGA TTC3′DR9371 5′ATG YCT GAT CAA RTC NGG3′DF9335 5′AAG TGG GTS TTY AAC TC3′R10354 5′CAT CTG GGT GTT CTC GC3′DF10330 5′ATG TGG GGN GGN GCN YAY TGY TTY TGY3′R11703 5′GAAATG TTA AAA ACA AAA 3′TF75305′TCA AGC CAT TAG AGG AG3′GSP1 5′GAC GGT GTC TCA GCA TC3′GSP2 5′CGA GAG TAT CAA GTA CGA TCC GG3′3END 5’CAC AGA CTG CAG CGA ATT CTT TAC CTT TTT TTTTTT TTT G3’备注引物命名原则按该序列在基因组的位置，正向引物标有F，反向引物标有R，分别是英文单词Forward和Reverse的第一个字母，如果引物中有随机核苷酸，则在F或R前添加D(Degenerate)。随机引物字母含义如下NA，T，G，C YC，T， SG，C， RA，G， BG，T，C5.目的基因的PCR扩增0.2ml的聚乙烯管中加入去离子水10倍反应缓冲液10ul，引物各1.0ul(100pmol)，2ul dNTP(10mM)，反转录产物2ul，煮沸三分种，冰浴一分钟，加入1ulTaq酶，混匀后覆盖少量石蜡油，进行PCR扩增。PCR的扩增条件如下94℃ 40秒，55℃ 60秒 72℃ 60秒30个循环后72℃延伸6分钟。
如果引物中有随机碱基，则选用以下扩增条件94℃ 2分种45℃ 4分钟72℃ 4分钟一个循环94℃ 30秒 45℃ 30秒 72℃ 60秒 30个循环后72℃延伸10分种。
6.5′末端的测序方案采用GIBCO公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA EndsVersion 2.0产品，方法如下6.1 cDNA第一链的合成在0.5ml离心管内混装下列液体DEPC水 15.5ulRNA 1-5ugGSP1 1ul(100pmol/ul)70℃ 10分钟后迅速冰浴，离心甩一下加入下列液体10×PCR缓冲液2.5ul25mM Mgcl22.5ul10mM dNTP1.0ul0.1M DTT 2.5ulSuperScript II反转录酶 1ul混匀后42℃反应一小时。70℃灭活15分钟后加1ul RNA酶，37℃ 30分钟。
6.2.cDNA的纯化在cDNA第一链合成反应液里加入120ul 6M NaI，混匀后移入纯化离心柱离心20秒，用4℃洗液清洗三次后用70％乙醇洗一次，13000rpm离心1分钟，最后加50ul超纯水，收集离心液体即为纯化的cDNA。
6.3 cDNA的加尾在0.5ml的离心管内混装下列液体DEPC水 6.6ul5×加尾缓冲液5.0ul2mM dCTP 2.5ul纯化cDNA样品 10ul94℃ 1分钟，加入1ul TdT，混匀后37℃ 10分钟，尔后65℃灭活10分钟。
6.4加尾cDNA的PCR扩增在0.2ml PCR管中加入以下液体ddH2O31.5ul25mMMgCl 3.0ul10mM dNTP1.0ulGSP2引物 2.0ul(100pmol/ul)锚定引物(AAP)2.0ul(10uM)加尾cDNA 5.0ulTaq酶0.5ulPCR反应条件如下94℃ 30秒 55℃ 30秒 72℃ 30秒 30个循环后延伸2分钟。
AAP的序列如下5′GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GGIGGG IIG 3′PCR产物的回收，纯化，鉴定及测序方法同向。
6.目的基因片段的回收上述PCR产物的回收用PCR纯化回收试剂盒(Progema公司产品)方法如下PCR产物在TAE缓冲液条件下电泳，切下含目的片段的琼脂糖胶，加入溶胶缓冲液加热溶解后，用注射器将其缓慢推入纯化柱，80％的异丙醇2ml清洗柱子，12000rpm离心2分钟，加50ulTE，室温放置3-5分钟，离心20秒，收集离心液既为纯化PCR产物。
7、将目的基因片段与pGEM-T载体按适当比例(5-10∶1)加入10×T4 DNA连接酶缓冲液1ul、T4 DNA连接酶1ul及适量的去离子水中，于4℃连接过夜。
8.感受态细胞的制备挑取单个DH5α菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃活化过夜，次日取上述菌液按比1∶100再接种于50ml LB中，37℃振荡2小时，待菌液呈“云雾状”或OD值＝0.6时，4℃ 5000rpm离心8min，弃上清，沉淀用0.1M CaCl悬浮，置冰浴内30min，5000rpm离心8min，弃上清，沉淀以适量0.1M CaCl重悬，分装后置冰浴内6小时后备用。
9、连接产物的转化取上述连接产物5ul加入100ul感受态细胞内，置冰浴60min后，42℃热休克90秒，再置冰浴2分，加入无氨苄青霉素的LB 0.9ml，在37℃水浴1小时取200ul菌液加入40ul 20mg/ml 5-溴-4氯-3吲哚-(-D-半乳糖苷(X-gal)及4ul 0.1M异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，混匀后涂含氨苄青霉素LB平皿，37℃培养16小时，挑取白色菌落快速提取质粒进行酶切鉴定。
10、双链模板的提取及序列测定从新鲜转化的LB平板上挑取经上述酶切鉴定正确的单菌落，接种于含氨苄青霉素的3ml LB中，37℃摇菌10小时。5000rpm离心2分钟，用100ul溶液I悬浮，冰浴5分钟，加200ul溶液II，冰浴3分钟，加150ul溶液III，冰浴10分钟。12000rpm离心10分钟，上清中加RNA酶至终浓度20ul/ml，37℃水浴30分钟；加400ul氯仿抽提2次，上清加等体积异丙醇，12000rpm离心10分钟，然后加70％乙醇洗沉淀一次。真空抽干后加30ul去离子水悬浮沉淀，加4M NaCl 8ul、13％ PEG 8000 40ul，置4℃12000rpm离心10分钟，吸去上清，加70％乙醇洗涤沉淀1次，弃上清，沉淀真空抽干后溶于20ul去离子水中。然后采用Sanger双脱氧终止法，用荧光染料标记，在日本TaKaRa公司的377型DNA自动测序仪上采用T7和SP6通用引物从正反方向测定克隆片段的核苷酸序列。然后将测序结果与基因库同源序列比较，确认本病毒为一种新的甲病毒；测定结果XJ-160病毒基因组全长11626bp，不包扩5’帽子结构和3’端的多聚核苷酸尾。序列如下ATTGACGGCGTAGTACACACTATTGAATCAAACAGCCGACCAACAGCACTACCATCATAATGGAGAAGCCTGTAGTTAACGTAGACGTAGACCCCCAGAGTCCGTTTGTCGCTCAACTGCAAAAGAGCTTCCCGCAATTCGAGGTAGTAGCACAGCAGGCCACACCAAATGACCATGCTAATGCCAGAGCATTTTCGCATCTGGCTAGTAAATTAATCGAGCTGGAGGTTCCTACCACAGCGACGATTTTGGACATAGGCAGCGCACCGGCTCGTAGAATGTTTTCCGAGCACCACTATCACTGCGTCTGCCCTATGCGGAGCCCCGAAGATCCCGACCGTATGATGAAATACGCCAATAAGTTGGCGGAGAAGGCAAATAAGATTACTAATAAAAATTTGCATGAGAAGATTAAAGACCTCCGGATCGTACTTGATACTCCGGATGCTGAGACACCGTCGCTCTGCTTCCATAATGACGTTACCTGCAGTACGCGTGCAGAGTACTCCGTTATGCAAGATGTGTATATTAATGCACCCGGAACTATTTACCATCAAGCTATGAAAGGCGTGCGGACACTTTACTGGATTGGGTTTGACACCACTCAGTTCATGTTCTCGGCTATGGCAGGATCATATCCTGCCTATAATACTAACTGGGCCGATGAAAAAGTCCTTGAAGCACGCAATATTGGACTCTGTAGTACCAAGTTGAGCGAAGGCCGTATAGGAAAGTTGTCAATAATGAGGAAAAAGGAGTTGAAGCCCGGGTCACGGGTCTACTTCTCAGTGGGATCAACACTCTACCCAGAATATAGGGACAGCTTACAGAGCTGGCACCTCCCATCAGTGTTCCATCTGAAAGGAAAGCAATCGTATACATGCCGCTGTGATACAGTGGTAAGTTGCGAAGGCTACGTAGTGAAGAAGATCACTATTAGTCCCGGGATTACGGGAGAAACCGTGGGATACGCGGTTACAAACAATAGCGAGGGTTTCTTGCTATGTAAAGTTACTGACACAGTAAAAGGGGAACGGGTCTCGTTCCCCGTGTGCACGTATATCCCGGCCACCATATGCGACCAGATGACAGGTATAATGGTCACGGATATTTCACCTGACGATGCACAGAAGCTTCTGGTTGGGCTCAACCAGAGGATTGTCATTAACGGTAAAACCAACAGGAACACTAACACCATGCAAAACTACCTTCTGCCGATTATAGCACAAGGCTTCAGCAAGTGGGCTAAAGAGCGCAAAGAAGATCTTGATAATGAAAAGAAGCTGGGCACTAGGGAGCGTAAGCTTATTTACGGGTGTCTATGGGCGGTTCGTACTAAGAAAGTGCACTCGTTTTACCGCCCGCCCGGAACGCAGACCAGCGTGAAAGTCCCGGCATCTTTTAGCGCTTTTCCAATGTCATCTGTATGGACAACCTCACTACCCATGTCGCTGAGGCAGAAGATAAAATTGGTACTACAACCGAAAAAGGAGGAGAAATTACTGCAGGTCTCAGAAGAGTTAGTTGCGGAGGCTAAAGCGGCCTTTGAAGATGCACAGGAGGAGATCAGAGCGGAGCAACTCCGTGAAGCACTTCCACCACTGGTAGCAGACAAAGGTATTGAAGCCGCTGCAGAAGTCGTCTGTGAAGTGGAAGGGCTTCAAGCTGATATAGGAGCAGCTCTTGTTGAGACGCCACGAGGGCATGTAAGGATTATACCTCAAGTAACAGACCGCATGATTGGGCAGTACATCGTGGTCTCACCAACCTCCGTGCTTAAGAACGCCAAATTAACACCTGTTCACCCTTTGGCTGACCAAGTCAAAATTATAACACATTCAGGGAGGACAGGAAGATTCGCGGTGGAACCGTATGATGCTAAAGTGTTGATGCCAGCAGGTAGCGCCGTTCCATGGCCTGAGTTCCTGGCGTTAAGTGAAAGCGCCACGCTAGTGTATAACGAAAGAGAATTTGTCAACCGCAAACTTTACCATATCGCCATACATGGTCCCGCGAAGAATACTGAAGAGGAGCAGTATAAAGTCACTAAAGCCGAACTCGCAGAAACAGAGTATGTATTTGATGTCGACAAGAAGCGTTGCGTTAAGAAGGAAGAGGCCTCGGGGCTGGTTCTCCCGGGAGAACTAACTAACCCACCGTATCATGAAATGGCGCTTGAGGGGCTGAAGACTCGACCCGCTGTTCCGTATAAGGTCGAAACAATAGGAGTAATAGGCACACCAGGATCAGGCAAGTCTGCGATTATTAAATCGACCGTTACCGTACGAGATCTTGTTACCAGCGGAAAGAAGGAAAACTGCCGTGAAATTGAAACTGACGTGTTGAGGTTGAGAGGTATGCAGATCACGTCAAGGACGGTAGACTCAGTCATGCTTAACGGATGCCATAAAGCCGTAGAGATGCTATACGTTGATGAAGCATTTGCGTGCCATGCTGGTACGTTGCTTGCCTTGATCGCTATTGTTAGACCCCGAAAGAAGGTAGTACTTCGCGGGGATCCTAAGCAGTGTGGTTTTTTCAATATGATGCAGCTCAAAGTACATTTTAATCACCCTGAAAAAGATATATGTACTAAGACGTTTTACAAATTCATCTCTCGACGCTGCACGCAACCAGTAACGGCGATTGTTTCAACACTTCATTACGACGGAAAGATGAAGACTACAAACCCCTGCAAGAAGAGCATTGAGATAGATATTACAGGTACTACGAAGCCGAAGCCCGGGGACCTCGTTTTGACGTGCTTCCGCGGATGGGTCAAGCAGCTACAGATCGATTACGCGGGAAATGAAGTGATGACGGCTGCTGCCTCGCAGGGACTGACTAGAAAGGGTGTTTACGCCGTTCGGCAAAAAGTTAATGAGAATCCACTGTACGCGATTACGTCGGAGCACGTGAACGTGTTACTCACCCGTACTGAGGATAGATTAGTGTGGAAGACCTTACAGGGCGATCCATGGATCAAACAACTTACTAACATTCCGAAAGGAAACTTCCAAGCTACTATTGAGGACTGGGAAGCTGAACATAAGGGGATCATCGCTGCAATAAACAGCCCAACCCTTCGTATAAACCCGTTCAGCTGTAAGACTAATGTGTGCTGGGCGAAGGCACTGGAACCGATACTGGCCACAGCCGGTATTGTCCTCACCGGTTGCCAGTGGAGTGAGCTGTTTCCACAGTTCGTAGATGATAAACCCCACTCAGCTATCTACGCCCTAGATGTGATTTGTATTAAGTTCTTTGGTATCCATCTGACAAGCGGTCTATTTTCAAAGCAGAGCATCCCTCTGACGTACCACCCTGCGGACTCTGCAAGGCCAGTGGCGCATTGGGACAACAGTCCAGGAACCCGAAAGTATGGATACGATCATGCGGTTGCTGCCGAATTGTCTCGTACATTCCCGGTGTTCCAACTTGCTGGAAAAGGCACACAGCTTGACTTGCAGACTGGTAGAACCAGAGTCGTTTCCGCGCAGTGTAACTTGGTCCCAGTGAACCGTAACCTCCCGCACGCTCTTGTCCCCGAGTATAAAGAGAAACAACCCGGCCCGATTAAAAATTTTTTAAATCAGTTTAAGCATCACTCCATACTTGTAGTATCAGAAACGAAAATCGAAGTTCCCAATAAGCGCATCGAATGGATTGCACCGCTTGGCATAGCTGGTGCAGATAAGAGCTACAACCTGGCCTTCGGATTTCCACCGCAGGCACGGTATGATATGGTGTTTATCAATATAGGAACAAAATATAGAAACCACCATTTTCAACAGTGTGAAGACCATGCGGCGACTTTGAAGACTCTTTCCCGCTCGGCTCTGAATTGCCTCAACCCTGGAGGCACCTTAGTGGTGAAATCCTATGGATATGCTGATCGCAATAGCGAGGACGTAGTCACCGCACTTGCCAGGAAGTTTGTTAGAGTGTCTGCGGCCAGGCCAGAGTGCGTCTCAAGTAACACAGAAATGTACCTAATCTTTCGGCAATTAGATAATAGCCGTACACGGCAGTTCACTCCACATCATTTGAACTGTGTAATCTCGTCGGTGTATGAAGGCACGAGAGAAGGAGTCGGAGCTGCGCCATCCTACCGTGTGAAACGGGAAAATATTGCAGACTGCCATGAGGAAGCAATCGTCAACGCCGCTAACTCGCTGGGTAAACCAGGTGAAGGAGTTTGCCGCGCCGTCTACAAGCGTTGGCCGAGCAGCTTTATGGATTCCGCCACAGAAACGGGTACGGCTAAATTAACTGTAAGCCAAGGAATGAAAGTGATACACGCGGTCGGCCCTGACTTCCGTAAGTATCCTGAGGCGGAAGCTTTGAAGCTGCTGCAAAACGCTTACCATGCAGTGGCGGACTTGGTTAACAAACACAACATTAAGTCCATTGCTATCCCGCTACTATCAACAGGTATATATGCAGCTGGTAAGGATCGCTTGGAAGTTTCGCTCAATTGCCTGACCACCGCACTAGACAGGACCGATGCAGATGCAGATGTAACTATTTATTGTTTGGATAAGAAATGGAAAGAGAGAATTGACGCGGTGTTGCAACTTAAGGAGTCAGTGACAGAACTGAAGGACGAGGACATGGAAATCGATGACGAATTGGTATGGATTCATCCGGATAGTTGTCTAAAAGGGAGAAAGGGATACAGTACTACAAAAGGAAAGCTATATTCGTACTTTGAGGGTACGCGCTTACATACTGGGCGAAACCATGGAAGCAATTCGTGAAAAATGCCCAGTTG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权利要求
1.一种辛德毕斯病毒毒株全基因组序列，其特征在于其全长包括11626bp，它不包括5’帽子结构和3’端多聚核苷酸尾序列，序列如下ATTGACGGCGTAGTACACACTATTGAATCAAACAGCCGACCAACAGCACTACCATCATAATGGAGAAGCCTGTAGTTAACGTAGACGTAGACCCCCAGAGTCCGTTTGTCGCTCAACTGCAAAAGAGCTTCCCGCAATTCGAGGTAGTAGCACAGCAGGCCACACCAAATGACCATGCTAATGCCAGAGCATTTTCGCATCTGGCTAGTAAATTAATCGAGCTGGAGGTTCCTACCACAGCGACGATTTTGGACATAGGCAGCGCACCGGCTCGTAGAATGTTTTCCGAGCACCACTATCACTGCGTCTGCCCTATGCGGAGCCCCGAAGATCCCGACCGTATGATGAAATACGCCAATAAGTTGGCGGAGAAGGCAAATAAGATTACTAATAAAAATTTGCATGAGAAGATTAAAGACCTCCGGATCGTACTTGATACTCCGGATGCTGAGACACCGTCGCTCTGCTTCCATAATGACGTTACCTGCAGTACGCGTGCAGAGTACTCCGTTATGCAAGATGTGTATATTAATGCACCCGGAACTATTTACCATCAAGCTATGAAAGGCGTGCGGACACTTTACTGGATTGGGTTTGACACCACTCAGTTCATGTTCTCGGCTATGGCAGGATCATATCCTGCCTATAATACTAACTGGGCCGATGAAAAAGTCCTTGAAGCACGCAATATTGGACTCTGTAGTACCAAGTTGAGCGAAGGCCGTATAGGAAAGTTGTCAATAATGAGGAAAAAGGAGTTGAAGCCCGGGTCACGGGTCTACTTCTCAGTGGGATCAACACTCTACCCAGAATATAGGGACAGCTTACAGAGCTGGCACCTCCCATCAGTGTTCCATCTGAAAGGAAAGCAATCGTATACATGCCGCTGTGATACAGTGGTAAGTTGCGAAGGCTACGTAGTGAAGAAGATCACTATTAGTCCCGGGATTACGGGAGAAACCGTGGGATACGCGGTTACAAACAATAGCGAGGGTTTCTTGCTATGTAAAGTTACTGACACAGTAAAAGGGGAACGGGTCTCGTTCCCCGTGTGCACGTATATCCCGGCCACCATATGCGACCAGATGACAGGTATAATGGTCACGGATATTTCACCTGACGATGCACAGAAGCTTCTGGTTGGGCTCAACCAGAGGATTGTCATTAACGGTAAAACCAACAGGAACACTAACACCATGCAAAACTACCTTCTGCCGATTATAGCACAAGGCTTCAGCAAGTGGGCTAAAGAGCGCAAAGAAGATCTTGATAATGAAAAGAAGCTGGGCACTAGGGAGCGTAAGCTTATTTACGGGTGTCTATGGGCGGTTCGTACTAAGAAAGTGCACTCGTTTTACCGCCCGCCCGGAACGCAGACCAGCGTGAAAGTCCCGGCATCTTTTAGCGCTTTTCCAATGTCATCTGTATGGACAACCTCACTACCCATGTCGCTGAGGCAGAAGATAAAATTGGTACTACAACCGAAAAAGGAGGAGAAATTACTGCAGGTCTCAGAAGAGTTAGTTGCGGAGGCTAAAGCGGCCTTTGAAGATGCACAGGAGGAGATCAGAGCGGAGCAACTCCGTGAAGCACTTCCACCACTGGTAGCAGACAAAGGTATTGAAGCCGCTGCAGAAGTCGTCTGTGAAGTGGAAGGGCTTCAAGCTGATATAGGAGCAGCTCTTGTTGAGACGCCACGAGGGCATGTAAGGATTATACCTCAAGTAACAGACCGCATGATTGGGCAGTACATCGTGGTCTCACCAACCTCCGTGCTTAAGAACGCCAAATTAACACCTGTTCACCCTTTGGCTGACCAAGTCAAAATTATAACACATTCAGGGAGGACAGGAAGATTCGCGGTGGAACCGTATGATGCTAAAGTGTTGATGCCAGCAGGTAGCGCCGTTCCATGGCCTGAGTTCCTGGCGTTAAGTGAAAGCGCCACGCTAGTGTATAACGAAAGAGAATTTGTCAACCGCAAACTTTACCATATCGCCATACATGGTCCCGCGAAGAATACTGAAGAGGAGCAGTATAAAGTCACTAAAGCCGAACTCGCAGAAACAGAGTATGTATTTGATGTCGACAAGAAGCGTTGCGTTAAGAAGGAAGAGGCCTCGGGGCTGGTTCTCCCGGGAGAACTAACTAACCCACCGTATCATGAAATGGCGCTTGAGGGGCTGAAGACTCGACCCGCTGTTCCGTATAAGGTCGAAACAATAGGAGTAATAGGCACACCAGGATCAGGCAAGTCTGCGATTATTAAATCGACCGTTACCGTACGAGATCTTGTTACCAGCGGAAAGAAGGAAAACTGCCGTGAAATTGAAACTGACGTGTTGAGGTTGAGAGGTATGCAGATCACGTCAAGGACGGTAGACTCAGTCATGCTTAACGGATGCCATAAAGCCGTAGAGATGCTATACGTTGATGAAGCATTTGCGTGCCATGCTGGTACGTTGCTTGCCTTGATCGCTATTGTTAGACCCCGAAAGAAGGTAGTACTTCGCGGGGATCCTAAGCAGTGTGGTTTTTTCAATATGATGCAGCTCAAAGTACATTTTAATCACCCTGAAAAAGATATATGTACTAAGACGTTTTACAAATTCATCTCTCGACGCTGCACGCAACCAGTAACGGCGATTGTTTCAACACTTCATTACGACGGAAAGATGAAGACTACAAACCCCTGCAAGAAGAGCATTGAGATAGATATTACAGGTACTACGAAGCCGAAGCCCGGGGACCTCGTTTTGACGTGCTTCCGCGGATGGGTCAAGCAGCTACAGATCGATTACGCGGGAAATGAAGTGATGACGGCTGCTGCCTCGCAGGGACTGACTAGAAAGGGTGTTTACGCCGTTCGGCAAAAAGTTAATGAGAATCCACTGTACGCGATTACGTCGGAGCACGTGAACGTGTTACTCACCCGTACTGAGGATAGATTAGTGTGGAAGACCTTACAGGGCGATCCATGGATCAAACAACTTACTAACATTCCGAAAGGAAACTTCCAAGCTACTATTGAGGACTGGGAAGCTGAACATAAGGGGATCATCGCTGCAATAAACAGCCCAACCCTTCGTATAAACCCGTTCAGCTGTAAGACTAATGTGTGCTGGGCGAAGGCACTGGAACCGATACTGGCCACAGCCGGTATTGTCCTCACCGGTTGCCAGTGGAGTGAGCTGTTTCCACAGTTCGTAGATGATAAACCCCACTCAGCTATCTACGCCCTAGATGTGATTTGTATTAAGTTCTTTGGTATCCATCTGACAAGCGGTCTATTTTCAAAGCAGAGCATCCCTCTGACGTACCACCCTGCGGACTCTGCAAGGCCAGTGGCGCATTGGGACAACAGTCCAGGAACCCGAAAGTATGGATACGATCATGCGGTTGCTGCCGAATTGTCTCGTACATTCCCGGTGTTCCAACTTGCTGGAAAAGGCACACAGCTTGACTTGCAGACTGGTAGAACCAGAGTCGTTTCCGCGCAGTGTAACTTGGTCCCAGTGAACCGTAACCTCCCGCACGCTCTTGTCCCCGAGTATAAAGAGAAACAACCCGGCCCGATTAAAAATTTTTTAAATCAGTTTAAGCATCACTCCATACTTGTAGTATCAGAAACGAAAATCGAAGTTCCCAATAAGCGCATCGAATGGATTGCACCGCTTGGCATAGCTGGTGCAGATAAGAGCTACAACCTGGCCTTCGGATTTCCACCGCAGGCACGGTATGATATGGTGTTTATCAATATAGGAACAAAATATAGAAACCACCATTTTCAACAGTGTGAAGACCATGCGGCGACTTTGAAGACTCTTTCCCGCTCGGCTCTGAATTGCCTCAACCCTGGAGGCACCTTAGTGGTGAAATCCTATGGATATGCTGATCGCAATAGCGAGGACGTAGTCACCGCACTTGCCAGGAAGTTTGTTAGAGTGTCTGCGGCCAGGCCAGAGTGCGTCTCAAGTAACACAGAAATGTACCTAATCTTTCGGCAATTAGATAATAGCCGTACACGGCAGTTCACTCCACATCATTTGAACTGTGTAATCTCGTCGGTGTATGAAGGCACGAGAGAAGGAGTCGGAGCTGCGCCATCCTACCGTGTGAAACGGGAAAATATTGCAGACTGCCATGAGGAAGCAATCGTCAACGCCGCTAACTCGCTGGGTAAACCAGGTGAAGGAGTTTGCCGCGCCGTCTACAAGCGTTGGCCGAGCAGCTTTATGGATTCCGCCACAGAAACGGGTACGGCTAAATTAACTGTAAGCCAAGGAATGAAAGTGATACACGCGGTCGGCCCTGACTTCCGTAAGTATCCTGAGGCGGAAGCTTTGAAGCTGCTGCAAAACGCTTACCATGCAGTGGCGGACTTGGTTAACAAACACAACATTAAGTCCATTGCTATCCCGCTACTATCAACAGGTATATATGCAGCTGGTAAGGATCGCTTGGAAGTTTCGCTCAATTGCCTGACCACCGCACTAGACAGGACCGATGCAGATGCAGATGTAACTATTTATTGTTTGGATAAGAAATGGAAAGAGAGAATTGACGCGGTGTTGCAACTTAAGGAGTCAGTGACAGAACTGAAGGACGAGGACATGGAAATCGATGACGAATTGGTATGGATTCATCCGGATAGTTGTCTAAAAGGGAGAAAGGGATACAGTACTACAAAAGGAAAGCTATATTCGTACTTTGAGGGTACTAAATTTCACCAAGCAGCCAAAGATATGGCTGAAATAAAAGTGCTGTTTCCGGACGACCAGGAAAGCAACGAACAGTTATGCGCTTACATACTGGGCGAAACCATGGAAGCAATTCGTGAAAAATGCCCAGTTGATCGTAACCCGTCATCCAGTCCTCCGAAGACGCTGCCTTGCCTTTGCATGTATGCAATGACTCCGGAAAGAGTTCATAGGCT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2.一种辛德毕斯病毒毒株全基因组序列的克隆方法，其特征在于它包括以下步骤(1)病毒的培养及纯化；(2)病毒RNA的提取；(3)病毒RNA的反转录；(4)病毒基因序列扩增引物设计与合成；所述的引物是选择甲病毒保守区域的核苷酸序列设计引物；引物3’末端尽可能终止在简并密码子较少的氨基酸位置且最后一个碱基终止在氨基酸密码子的第二位碱基；引物扩增片段一般不超过1.4kb。(5)目的基因的PCR扩增，将全基因分多个片段，用RT-PCR方法扩增相应的cDNA；(6)目的基因片段回收；(7)将目的基因片段与pGEM-T载体连接；(8)感受态细胞的制备；(9)连接产物的转化；(10)双链模板的提取及序列测序。
3.根据权利要求2所述的辛德毕斯病毒毒株全基因组序列的克隆方法，其特征在于所述的全基因分为15个片段，所述病毒基因序列扩增引物为F19 5′CTA TTG AAT CAA ACA GCC GAC CAA3′DR1153 5′ATT CGY TGG TTN ARC CCN ACC CAG3′F11135′TTC ACC TGA CGA TGC AC 3′DR2249 5′GAT GAT NGC NGA CTT RCC3′F22305′GAG TAATAG GCA CAC CAG3′DR3123 5′TTC CAR WGC TTT NGC CCA GC3′F31005′TCAGCT GTA AGA CTA ATG3′R38705′AAG GTG CCT CCA GGG TTG3′DF3840 5′CGT TCG GCM CTS AAY TG3′R46705′TTG TAG TAC TGT ATC CC3′DF4638 5′ATC CAT CCR GAB AGY TG3′R57805′CTG GCC CTG TAT CCG TC3′DF5760 5′GTA GGT GGG TAC ATG TTY TC3′R65905′TAC CTC TTG CAA TGG GAC 3′DF6559 5′GCN CTN TTY GCR AAG AC3′R75905′ATC TCT ACG GTG GTC CTA AAT3′F75905′ATT TAG GAC CAC CGT AGA GAT3′R81905′CGC TCC GTG GTG CCA GTT3′F81905′GAG CAC CCA GAA GGA TTC3′DR9371 5′ATG YCT GAT CAA RTC NGG3′DF9335 5′AAG TGG GTS TTY AAC TC3′R10354 5′CAT CTG GGT GTT CTC GC3′DF10330 5′ATG TGG GGN GGN GCN YAY TGY TTY TGY3′R11703 5′GAAATG TTA AAA ACA AAA 3′TF75305′TCA AGC CAT TAG AGG AG3′GSP1 5′GAC GGT GTC TCA GCA TC3′GSP2 5′CGA GAG TAT CAA GTA CGA TCC GG3′3END 5’CAC AGA CTG CAG CGA ATT CTT TAC CTT TTT TTTTTT TTT G3’
全文摘要
一种辛德毕斯病毒毒株全基因组序列及其克隆方法,该克隆方法将全基因分15片段,用RT－PCR方法扩增相应cDNA,连入pGEM－T载体,利用通用引物测序,在病毒基因序列扩增引物设计上选择甲病毒保守区域的核苷酸序列设计引物,引物3’末端尽可能终止在简并密码子较少的氨基酸位置且最后一个碱基终止在氨基酸密码子的第二位碱基,本发明从分子水平阐明了本病毒与其他流行株的差异,对了解病毒的来源进化过程及分子流行病学有重要意义。新型的以该病毒序列为基础的基因治疗载体有潜在的应用前景。
文档编号C12P19/00GK1252444SQ9812069
公开日2000年5月10日 申请日期1998年10月27日 优先权日1998年10月27日
发明者梁国栋, 李蕾, 周国林, 付士红, 金奇, 侯云德 申请人:中国预防医学科学院病毒学研究所