专利名称：甲型肝炎病毒基因组全序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒基因组学领域。更具体地，本发明涉及甲型肝炎病毒的基因组序 列及其应用。
背景技术：
甲型肝炎是由甲型肝炎病毒感染人体引起的一种急性肠道传病。甲型肝炎是现已 发现的严重影响人类健康的六种病毒性肝炎之一，且感染率为最高。我国是甲型肝炎高流 行区，常引起季节性流行。由于该病的高发病率及较长的病程，给人民健康及经济发展带来
严重影响。目前，对于甲型肝炎迄今人们尚无有效的治疗手段，接种疫苗是迄今人类控制该 疾病最有效和最经济的措施。中国专利申请01140508. 2公开了一种甲肝病毒中国株和减毒株的培育及互补脱 氧核糖核酸序列。然而，甲肝减毒活疫苗存在着明显的缺点，最为突出的是毒力返祖和次传 播问题，对接种者及其密切接触者构成潜在的安全隐患。其次，对免疫功能低下或缺陷者高 度危险。此外，减毒活疫苗还存在热稳定性差、运输贮存条件要求苛刻等缺点。因灭活疫苗病毒蛋白纯度高，故免疫效果好，安全性高，这也是发达国家和地区迄 今只使用甲肝灭活疫苗的重要原因。此外灭活疫苗是公认制备多价疫苗、联合疫苗的重要 环节，而联合疫苗是世界卫生组织(WHO)与各国卫生当局所倡导的疫苗发展方向和策略。现有的甲肝灭活疫(包括减毒疫苗)的甲肝病毒株所适应的细胞基质均为人二倍 体细胞或人成纤维细胞，繁殖效率不高是其共同缺点，而制备灭活疫苗需要大量纯化的病 毒抗原，这是甲肝灭活苗制备成本高昂的根本原因。中国专利申请02106985中公开了一种甲型肝炎病毒株，该病毒株具有在Vero细 胞(ATCC NO :CCL-81)上高效稳定增殖的特性，增殖效率是其它甲肝毒株在人二倍体细胞 增殖10倍以上，且动物试验已证明该甲肝病毒株YN5具有良好的免疫原性，可以用作生产 灭活疫苗的毒种。然而，目前对于各种类型甲型肝炎病毒的基因组还了解甚少。本领域迫切需要开 发类型甲型肝炎病毒的基因组，以便了解不同HAV毒株之间区别以及用于检测应用。
发明内容
本发明的目的就是通过对甲型肝炎病毒基因组进行全序列的测定，为检测HAV、研 究HAV感染途径等目的奠定可靠的基础。在本发明的第一方面，提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子具有或其序列 为SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列或其反义序列。在另一类优选例中，所述的核酸分子是DNA或RNA。在本发明的第二方面，提供了本发明第一方面中所述的核酸分子的用途，它们被 用于制备检测甲型肝炎病毒的引物、探针或试剂盒。
3
在另一类优选例中，所述的引物长度为15-100个核苷酸。在另一类优选例中，所述的探针的长度为25-5000个核苷酸。在另一类优选例中，所述的探针的长度为50-500个核苷酸。在本发明的第三方面，提供了一种分离的DNA分子，该DNA分子由SEQ IDN0 1所 示序列或其反义序列中连续的150-7473个核苷酸所构成。在另一类优选例中，所述的DNA分子由SEQ ID NO 1所示序列或其反义序列中连 续的300-7473个核苷酸所构成。在另一类优选例中，所述的DNA分子由SEQ ID NO 1所示序列或其反义序列中连 续的1000-7473个核苷酸所构成。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再
--累述。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次获得了具有在Vero细胞上高效稳定增殖 的特性甲肝病毒的全基因组序列。在此基础上，完成了本发明。总体而言，本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基 因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码 链。本发明的基因组全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的 方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序 列来设计引物，并按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得 有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段 按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。第一方面，本发明提供了一核酸，该核酸含有在SEQ ID NO :1所示的甲肝病毒的基 因组核苷酸序列。还提供了含有与本文所公开的核苷酸序列有序列相同性的序列的核酸。 根据具体的序列，序列相同性的程度宜大于50 % (例如60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、99 % 或更高)。这些序列包括例如突变体和等位基因变体。本发明还提供了包含本文所公开的一种或多种核苷酸序列片段的核酸。这些片段 应包含诸序列中至少n个连续的氨基酸，并且根据具体的序列，n为10或更高(例如，11， 12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，50，60，75，100 或更高)。较
佳地，该片段是甲肝病毒基因组特有的，换言之在其他生物体的基因组中并不存在。更佳 地，该片段是甲肝病毒毒株的基因组特有的。本发明还提供了与本文所提供的核酸发生杂 交的核酸。杂交条件如本文中所述。本发明还提供了一核酸，该核酸包含与上述序列互补的序列(例如，用于反义、用 于探针、或用于扩增引物)。当然，本发明的核酸可以用多种方法制备(例如，化学合成、从DNA文库、或从生物体本身制得等)，并可采用各种形式(例如单链、双链、载体、探针、引物等)。术语“核酸”包 括DNA和RNA，以及它们的类似物，如含有修饰骨架的那些类似物，还包括肽核酸(PNA)等。应理解，因为SEQ ID NO 1基本上代表了甲肝病毒的完整基因组。本发明还提供了含有本发明的核苷酸序列的载体(如表达载体、测序载体、克隆 载体等)以及用这些载体转化的宿主细胞。第二方面，本发明还提供了一种蛋白质，该蛋白质含有本文所示的甲肝病毒核苷 酸序列中所编码的氨基酸序列。还提供了含有与这些蛋白质有序列相同性的序列的蛋白。 根据具体的序列，序列相同性程度宜大于50 % (例如60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、99 %或 更高)。序列相同性用如上所述的方法确定。这些同源蛋白包括本文所示的甲肝病毒核苷 酸序列中所编码的突变体和等位基因变体。本发明还提供了一种蛋白质，该蛋白质含有序列表中所公开的甲肝病毒核苷酸序 列中所编码的氨基酸序列片段。这些片段应包含诸序列中至少n个连续的氨基酸，并且根 据具体的序列，n为7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20或更高)。这些片段宜包含该 序列的表位。可用各种测试来评估本发明蛋白的体内免疫原性。例如，蛋白质可以重组表达或 者化学合成，并通过免疫印迹用于筛选病人的血清。蛋白质与病人血清之间发生阳性反应， 就表示病人早已对有关蛋白质产生过免疫应答，即该蛋白是免疫原。该方法可用于鉴别免 疫优势蛋白。本发明还提供了编码本发明蛋白的核酸。第三方面，本发明还提供了含有本发明核酸的核苷酸序列的计算机、计算机存储 器、计算机存储介质(如软盘、硬盘、CD-ROM等)和/或计算机数据库。较佳地，它含有本 文列出的一种或多种甲肝病毒核苷酸序列。这可用于分析本文所列出甲肝病毒核苷酸序列。例如，可用于检索以鉴别序列中 的开放阅读框(0RF)或编码序列。第四方面，本发明提供了鉴别氨基酸序列的方法，它包括步骤检索本文所列出的 甲肝病毒核苷酸序列中推定的开放阅读框或蛋白编码序列。类似地，本发明提供了此处所 列出的甲肝病毒核苷酸序列在检索推定的开放阅读框或蛋白质编码序列中的用途。开放阅读框或蛋白编码序列分析通常在计算机上用标准的生物信息技术进行。用 于分析的典型算法或程序包括ORFFINDER(NCBI)，GENMARK[Borodovsky &McIninch (1993) Computers Chem 17 122—133]禾口 GLIMMER[Salzberg et al. (1998)Nucl Acids Res 26: 544-548]。对开放阅读框或蛋白编码序列的检索可包括步骤检索此处所列出的甲肝病毒核 苷酸序列中的起始密码子和检索上游序列中的处于读框中终止密码子。中间的密码子就代 表了推定的蛋白编码序列。通常，应检索一个序列中6种可能的读框。用这种方法鉴别出的氨基酸序列可用任何合适的系统进行表达，以获得蛋白。该 蛋白可用于产生抗体，而该抗体识别在鉴别出的氨基酸序列中的表位。这些抗体可用于筛 选甲肝病毒，以检测是否存在含所鉴别氨基酸序列的蛋白质。此外，一旦鉴别出0RF或蛋白编码序列，那么就可将该序列与序列数据库进行比 较。序列分析工具可在 NCBI (http //www. ncbi. nlm. nih. gov)处找到，例如 BLAST，BLAST2，BLASTn, BLASTp, tBLASTn, BLASTx,和 tBLASTx 算法[还可参见 Altschul 等人.(1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST mew generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25:2289-3402]。用于比较的合适数据库包括非冗余GenBank， EMBL，DDBJ 和 PDB 序列，以及非冗余 GenBank CDS 翻译物，PDB，SwissProt, Spupdate 和 PIR 序列。这种比较可给出蛋白质功能的指示。氨基酸序列中的疏水区可用以上算法加以预测，例如基于Esposti等人的统计学 研究的算法[“膜蛋白亲水性的关键评价〃(Critical evaluation of the hydropathy of membrane proteins) (1990) Eur J Biochem 190 :207_219]。疏水区代表了潜在的跨膜区或 疏水性前导序列，这暗示蛋白质可以被分泌或位于表面。这些特性通常是良好免疫原的标
o类似地，可用PS0RT算法(http://WWW. psort. nibb. ac. jp)来预测跨膜区或前导 序列，以及用MOTIFS程序来预测功能区(GCG Wisconsin & PR0SITE)。本发明还提供了一种核酸，该核酸含有本文所列出的甲肝病毒核苷酸序列中的开 放阅读框或蛋白编码序列。此外，基于本发明所提供的基因组序列，还提供了若干种蛋白 质，该蛋白质含有所述开放阅读框或蛋白编码序列所编码的氨基酸序列。例如，SEQ ID NO 1中第730-7413位的0RF就编码一个长度为2229个氨基酸的前原蛋白(pre-proprotein) (SEQ ID NO :2)。第五方面，本发明提供了结合这些蛋白的抗体。它们可能是多克隆的或单克隆的， 可用本领域技术人员已知的任何合适方法制得。本发明的抗体可以以各种不同方式使用，例如用于证实蛋白质的表达，或用于证 实蛋白质表达的场所。例如，标记的抗体(如荧光标记以用于FACS(流式细胞分选仪))可 以与完整的病毒一起孵育，而在病毒表面上存在标记就证实蛋白质的位置。第六方面，本发明提供了各种方法。本发明提供了一种生产本发明的蛋白的方法，该方法包括步骤在诱导蛋白表达 的条件下，培育本发明的宿主细胞。一种方法还可包括化学合成蛋白或化学合成(至少部 分合成)核苷酸。本发明提供了一种检测本发明的多核苷酸的方法，该方法包括下列步骤(a)在 杂交条件下使本发明的核酸探针与生物样品接触，形成双链体；和(b)检测所述双链体。本发明提供了一种检测本发明的蛋白质的方法，该方法包括下列步骤(a)在适 合形成抗体-抗原复合物的条件下使本发明的抗体和生物样品接触；和(b)检测所述复合 物。第七方面，本发明提供了检测选择性结合于抗原或多肽或蛋白质的抗体的方法， 这些抗原或多肽或蛋白质是对甲肝病毒的任何毒种或毒株特异性的，较佳地是对甲肝病毒 毒株特异性的，但更佳地是对甲肝病毒特异的。该方法包括步骤(a)在适合形成抗体-抗 原复合物的条件下，使本发明抗原或多肽或蛋白质与生物样品接触；和(b)检测所述复合 物。方法综述本发明提供了甲肝病毒HAV核苷酸序列、和其所编码的氨基酸序列。利用这些所 公开的序列，可以产生核酸探针试验和表达盒及载体。蛋白质还可化学合成。表达载体可以转入宿主细胞以产生蛋白。纯化或分离的多肽可用于产生抗体以检测HAV蛋白。而且， 宿主细胞或提取物可用于生物试验以分离促效剂和拮抗剂。此外，利用这些序列，人们可检 索以鉴定开放读框(0RF)和鉴定氨基酸序列。蛋白质还可用于免疫原性组合物以及用作疫 苗组份。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学 的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有全面的描述例 如，Sambrook《分子克隆实验手册》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D. N. Glover 编1985)；《寡核苷酸合成》(M. J. Gait编，1984)；《核酸杂交》(B. D. Hames和S. J. Higgins 编 1984)；《转录和翻译》(B. D. Hames和S. J. Higgins编，1984)；《动物细胞培养》 (R. I.Freshney编，1986)；《固定化细胞和酶》(IRL出版社，1986) ；B. Perbal，《分子克隆 实用指南》(1984)；《酶学方法》系列丛书(Academic Press, Inc.)，尤其是154和155卷; 《哺乳动物细胞的基因转移载体》(J. H. Miller和M. P. Calos编，1987，Cold Spring Harbor Laboratory) ；Mayer和Walker编(1987)，《细胞和分子生物学的免疫化学方法》(Academic Press, London) ；Scopes, (1987)《蛋白质纯化原理和实践》第 2 版(Springer-Verl ag， N. Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D. C. Weir和C. C. Blackwell编1986)。在本说明书中采用了核苷酸和氨基酸的标准缩写。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均全部纳入本文作参考。免疫诊断试验本发明的甲肝病毒HAV抗原或其抗原性片段，可用于免疫试验来检测抗体水平 (或相反，可用抗甲肝病毒抗体来检测抗原水平)。根据明确的免疫试验，可以开发重组抗 原，以代替侵入性诊断方法。可检测生物学样品(例如包括血液或血清样品)中的抗甲肝 病毒HAV蛋白或其片段的抗体。免疫试验的设计可作很大变化，其各种方案均是本领域中 已知的。免疫试验的方案可基于例如竞争性、或直接反应或夹心型试验。方案例如还可采 用固体支持物，或可以采用免疫沉淀法。大多数试验涉及采用标记的抗体或多肽；该标记例 如可以是荧光标记、化学发光标记、放射活性标记或染料分子。扩增探针信号的试验也是已 知的；其例子是采用生物素和亲和素的试验，酶标记的和介导的免疫试验，如ELISA试验。将合适的材料(包括本发明的组合物)以及进行试验所需的其它试剂和材料(例 如合适的缓冲液、盐溶液等)和合适的试验说明书包装到合适的容器中，构成适用于免疫 诊断且含有适当标记的试剂的试剂盒。核酸杂交“杂交”指两个核酸序列相互之间通过氢键而结合。通常，一个序列固定于固体载 体，另一个将游离于溶液内。然后，在有利于形成氢键的条件下使两个序列相互接触。影响 这种结合的因素包括溶剂的类型和体积；反应温度；杂交时间；搅拌；封闭液相序列与固 体载体非特异性结合的试剂(Denhardt's试剂或BLOTTO)；各序列的浓度；是否使用化合物 来增加序列结合的速度(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；以及杂交后洗涤条件的严谨程度。见 Sambrook等人[同上]第2卷，第9章，9. 47至9. 57页。“严谨性”指有利于非常相似的序列结合而不利于不同序列结合的杂交反应条 件。例如，应选择温度和盐浓度的组合，使温度比所研究的杂交的Tm计算值低大约120至 200°C。温度和盐浓度常可在前期初步实验中通过经验来确定，在初步实验中，固定在滤膜上的基因组DNA样品与感兴趣的序列杂交，然后在不同的严谨度条件下洗涤。见Sambrook 等人第9. 50页。在设计杂交实验时，影响核酸杂交的一些因素可以方便地予以改变。杂交和洗涤 时的温度以及洗涤时的盐浓度的调节最为简单。随着杂交温度(即严谨度)的升高，不同 源的链之间发生杂交的可能性变得更少，结果背景值降低。如果放射性标记的探针并非与 固定的片段完全同源(这在基因家族和种间杂交实验中是常见的)，则必须降低杂交温度， 而背景值将会增加。洗涤温度以类似的方式影响杂交带的强度和背景值的程度。洗涤的严 谨性也随盐浓度的降低而升高。通常，在50%甲酰胺存在下的方便的杂交温度是对于靶片段同源性达95%至 100%的探针而言，是42°C ；对于同源性为90%至95%的探针，为37°C ；对于同源性为85% 和90%的探针，为32°C。对于较低的同源性，应用上述方程式应相应地降低甲酰胺含量和 调节温度。如果探针和靶片段之间的同源性是未知的，则最简单的方法是从非严谨的杂交 和洗涤条件开始。如果在放射自显影后发现了非特异性的条带或高背景值，则可在高严谨 性下洗涤滤膜，并重新曝光。如果曝光所需时间使得该方法不切实际，则应平行测试几种杂 交和/或洗涤严谨性。核酸探针试验采用本发明的核酸探针的方法(如PCR、分支DNA探针试验或印迹技术)能确定 cDNA或mRNA的存在。如果探针和本发明的序列能形成稳定地足以被检测到的双链体或双 链复合物，则称探针与本发明的序列“杂交”。核酸探针将与本发明的甲肝病毒核苷酸序列(包括有义和反义链)杂交。尽管有 许多不同的核苷酸序列编码该氨基酸序列，但是天然的甲肝病毒序列是较佳的，因为它是 实际存在于细胞中的序列。mRNA代表一种编码序列，因此探针应与该编码序列互补；单链 cDNA与mRNA互补，因此cDNA探针应与非编码序列互补。探针的确切长度和序列将取决于杂交条件，如温度、盐浓度等。例如，对于诊断应 用，根据分析物序列的复杂程度，核酸探针通常含有至少10-20个核苷酸，较佳的15-25个， 更佳的至少30个核苷酸，但是也可短于该长度。短的引物通常需要较低温度，以便和模板 形成足够稳定的杂交复合物。探针可用合成方法产生，例如Matteucci 等人[J. Am. Chem. Soc. (1981) 103 3185] 的方法或Urdea等人[Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1983)80 7461]的方法，或用市售的自动 寡核苷酸合成仪合成。可以根据偏好选择探针的化学特征。对于某些应用，DNA或RNA是合适的。对 于其它的应用，可以加入修饰，例如骨架修饰，如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，可用来增加体 内半衰期，改变RNA亲和力，增加核酸酶抗性等[例如参见Agrawal和Iyer (1995)Curr Op in Biotechnol 6 12-19 ；Agrawal (1996) TIBTECH14 376-387]；还可采用类似物如肽 核酸[例如参见 Corey (1997) TIBTECH15 224~229 ；Buchardt 等人(1993) TIBTECH 11 384-386]。另外，聚合酶链反应(PCR)是另一个熟知的检测少量靶核酸的手段。该试验在 Mullis 等人[Meth. Enzymol. (1987) 155 :335_350]；美国专利 4，683，195 和 4，683，202 中有 所描述。用两个“引物”核苷酸与靶核酸杂交，并用来引导反应。引物可包含不与扩增靶序列(或其互补序列)杂交的序列，以帮助双链体的稳定性，或例如可插入一个简便的限制性 位点。这些序列通常侧接所需的甲肝病毒序列。利用最初的靶核酸作为模板，热稳定的聚合酶能从引物产生靶核酸的拷贝。在聚 合酶产生临界量的靶核酸后，它们可用较传统的方法(如Southern印迹)来检测。当采用 Southern印迹方法时，标记的探针将与甲肝病毒序列(如其互补序列)杂交。另外，mRNA或cDNA也可用Sambrook等人[同上]描述的传统印迹技术来检测。 用凝胶电泳可纯化并分离利用聚合酶从mRNA产生的mRNA或cDNA。然后，将凝胶上的核酸 印迹到固体载体如硝酸纤维素上。使固体载体与标记的探针接触，然后洗涤除去所有未杂 交的探针。然后，检测含有标记探针的双链体。该探针通常用放射活性物质作标记。基因组序列的应用基于对甲型肝炎病毒基因组全序列的测定，可以了解与该病毒增殖及重要调控功 能有关的基因结构和功能，找到其分子生理机制以及如何侵染宿主的关键点，寻找病毒致 病甚至致死基因。一种应用方法是，用甲型肝炎病毒感染Vero细胞，建立cDNA文库。用双向末端法 测定cDNA克隆，或直接对HAV cDNA的文库用PCR扩增的方法进行序列测定。基于本发明 所提供的甲型肝炎病毒基因组序列，可以大大方便引物的设计以及克隆的进程。另一种直接的应用是使用本发明的引物或探针，来检测样品中是否存在甲型肝炎 病毒或其遗传物质。对于探针而言，这种检测方法包括步骤将DNA样品与本发明的探针接触，观察是否形成DNA-探针复合物，形成了复合物就表示样品中存在甲型肝炎病毒 或遗传物质。对于引物而言，这种检测方法包括步骤用本发明的特异性引物，对样品进行PCR反应，观察是否扩增产生了特异性的扩增产物，产生了特异性扩增产物就表示样品中存 在甲型肝炎病毒或遗传物质。在本发明的一个实例中，甲型肝炎病毒的基因组序列是通过如下方法获得的，该 方法包括步骤1.分离纯化HAV病毒，获取高纯度RNA样品。2.以此RNA样品为模板，采用“RT-PCR”合成单链cDNA。继续以此cDNA为模板，利 用32mer寡核苷酸引物，在Taq和Deep Vent DNA多聚酶的作用下进行PCR扩增，得到7. 4k 片段3.将得到的序列输入计算机，利用软件(如Irmerpeace软件)进行拼接，再经后 期工作得到完整的病毒基因组全序列。经过多次反复测序，在平均每个碱基测序约6次的基础上获得了如SEQ IDN0 :1所 示的甲型肝炎病毒基因组全序列。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1病毒RNA的提取取甲型肝炎病毒株YN5感染Vero细胞，进行超声破碎3 5秒，将细胞破碎。 4°C 800rpm离心5min后取上清液，进行蔗糖/甘油非连续密度梯度离心，获得高纯度HAV病毒。逆转录PCR (RT-PCR)设计并合成引物1 :5，-TTTTTTTTTTTTTTTTTTAT-3，(SEQ ID NO :3)。取前述制备 的RNA病毒5iiL置于200iiL的PCR扩增专用小管中，加入lOOpmol的引物1，置于65°C变 性lOmin后，立即置于冰上，加入10X逆转录缓冲液2iiL，l讓ol/L 4XdNTP，20U RNasin, 和 50U Expand Reverse Transcriptase，加水至终体积 20 ii L。混勻后 42°C温育 2h。PCR 扩增设计并合成以下引物2和引物3。引物 2 :5，-TTCAAGAGGGGTCTCCGGGAATTTCCGGAGTC-3，(SEQ ID NO 4)；引物 3 :5，-ATTTATTTACTAATAAAAGAAATAAACAAACC-3，(SEQ ID NO :5)。取上述逆转录产物5 ii L置于200 ii L的PCR扩增专用小管内，加入10 X PCR缓冲 液 2ii L，350iimol 4X dNTP，350nmol 引物 2 和引物 3，8U 含 De印 Vent 的 Taq DNA 聚合酶， 混勻后置PCR仪进行扩增，循环参数96°C 2min 1个循环，93°C 10s，69°C 50s，72°C 15min 10个循环；93°C 10s，69°C 50s，72°C 15min (每次增加20s)，30个循环。反应产物取2 ii L 于0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，将大小为7. 4Kb的片段割下，然后进行DNA片段的纯化。连接反应按如下条件与pUC18质粒进行连接 转化取50ul的大肠杆菌DH5 a，加入连接反应产物，在冰上放置30分钟。42°C条件下 放置1分钟，再进行冰浴1 2分钟。加入250ul 37°C的S0C营养液，摇菌一小时，涂板。测序然后，挑取大肠杆菌阳性克隆进行PCR。对PCR产物进行末端双脱氧法法测序。经过多次反复测序，在平均每个碱基测序约6次的基础上，获得了如SEQ IDN0 1 所示的甲型肝炎病毒基因组全序列。实施例2对甲型肝炎病毒基因组序列的验证
10
根据SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，按每800bp左右长度设计引物，进行PCR反 应，对PCR产物进行测序验证。结果表明SEQ ID NO :1的核苷酸序列是正确的。实施例3检测甲型肝炎病毒病毒株的试剂盒基于SEQ ID N0:1中所示的基因组序列，合成以下PCR引物和探针有义引物1 序列为SEQ ID NO 1中第1393-1416位。反义引物2 序列为SEQ ID NO 1中第1537-1560位的互补序列。探针3 序列为 SEQ ID NO 1 中第 1444-1473 位。制备一试剂盒(检测100次)，它含有 取甲型肝炎病毒株YN5感染Vero细胞，如实施例1获得甲肝病毒株并通过RT-PCR 获得cDNA样品。将该cDNA样品稀释104、105、106和107倍制得样品A、B、C、D，用上述试剂 盒进行PCR扩增和杂交检测，同时设置阳性对照和阴性对照。
0119]结果表明，该试剂盒可以检测稀释度为104、105、106和107倍的HAV样品。
0120]此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发 明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
0121]序列表
0122]<110>上海泽润生物科技有限公司
0123]<120>甲型肝炎病毒基因组全序列
0124]<130>091191
0125]<160>5
0126]<170>PatentIn version 3.4
0127]<210>1
0128]<211>7473
0129]<212>DNA
0130]<213>Hepatitis A virus
0131]<220>
0132]<221>CDS
0133]<222>(730).. (7413)
0134]<400>1
0135]ttcaagaggg gtgtccggga atttacggag tccctcttgg aagtccatgg tgaggggact 60
11
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2225<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>3tttttttttt ttttttttat20<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>4ttcaagaggg gtctccggga atttccggag tc32<210>5<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>5atttatttac
权利要求
一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或其反义序列。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子是DNA或RNA。
3.—种权利要求1所述的核酸分子的用途，其特征在于，用于制备检测甲型肝炎病毒 的引物、探针或试剂盒。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的引物长度为15-100个核苷酸。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的探针的长度为25-5000个核苷酸。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的探针的长度为50-500个核苷酸。
7.一种分离的DNA分子，其特征在于，它由SEQ ID NO :1所示序列或其反义序列中连 续的150-7473个核苷酸所构成。
8.如权利要求7所述的DNA分子，其特征在于，它由SEQID NO :1所示序列或其反义 序列中连续的300-7473个核苷酸所构成。
9.如权利要求7所述的DNA分子，其特征在于，它由SEQID NO :1所示序列或其反义 序列中连续的1000-7473个核苷酸所构成。
全文摘要
本发明涉及甲型肝炎病毒基因组全序列。更具体地，本发明涉及全序列如SEQ ID NO1所示的甲型肝炎病毒的基因组序列及其应用。本发明还提供了甲型肝炎病毒特异性的引物和探针。
文档编号C12R1/93GK101875942SQ20091005047
公开日2010年11月3日 申请日期2009年4月30日 优先权日2009年4月30日
发明者吴克, 周平华, 张爱晖, 施松明 申请人:上海泽润生物科技有限公司