专利名称：一种检测围产期疾病遗传易感风险的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测围产期疾病遗传易感风险的试剂 盒，通过同时检测血管紧张素转换酶基因(ACE)、 5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、 G蛋白3 亚单位基因基因(GNB3)、肿瘤坏死因子基因(TNF-a )上的多态性位点基因型来评估个体围产期疾病遗传
易感风险。
背景技术：
围产期保健对降低孕产妇死亡、围产儿死亡以及病残儿的发生、保障母婴安全健康具有重要意义。在 围产期期间，孕妇容易发生妊娠高血压综合征、妊娠糖尿病和产后肥胖。妊娠高血压综合征(简称妊高征)， 是孕产妇特有的一种全身性疾病，在我国的发病率为10.32%，多发生在妊娠20周以后至产后2周，临床 上主要表现为水肿、高血压、蛋白尿三大症候群，重度患者伴有头痛、眼花、甚至抽搐、昏迷。本病严重 威胁母胎健康，是引起孕产妇和围产儿死亡的主要原因。众多研究发现，该疾病具有较高的遗传倾向。妊 娠糖尿病是指怀孕前未患糖尿病，而在怀孕时才出现髙血糖的现象，其发生率约百分之一到三。临床数据 显示大约有2~3%的女性在怀孕期间会发生糖尿病，患者在妊娠之后糖尿病自动消失。妊娠糖尿病更容易发 生在肥胖和髙龄产妇。有近30%的妊娠糖尿病妇女以后可能发展为2型糖尿病。糖尿病的病因和发病机理 非常复杂，不同类型和不同人群可有显著的差异，总的来说为遗传因素和环境因素共同作用所引起。产后 肥胖是大多数妇女产后所面临的困扰。产后六周，如果体重超过妊娠前体重的10%即定义为产后肥胖。临 床研究表明，妊娠过程中体内激素的变化，是造成产后肥胖的主要原因。
围产期疾病是遗传易感性和环境因素相互作用的结果。围产期疾病的遗传易感基闵主要为血管紧张素 转换酶基因(ACE)、 5， 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、 G蛋A P 3亚单位基因(GNB3)和肿瘤坏 死因子基因(TNF-a)。
血管紧张素转换酶(ACE)基因与围产期妊高征密切相关。ACE基因编码血管紧张素转化酶，在人体内具 有多种功能。ACE基因多态性是冠心病、心肌病、高血压等多种围产期疾病发病的独立危险因素。BedirA 在土耳其人群中的研究发现ACE的I/D基因型影响着ACE的活性，其中DD基因型的活性较高而II基因型 的活性较低。而在髙血压中ACE的血清水平明显比非高血压个体的水平为高，因此认为ACE的DD基因型 与高血压相关，并可能是严重高血压的重要标记和髙血压的独立危险因子。2006年，陈柏坤等人对92例 妊娠高血压综合征患者及85名正常妊娠者的ACE基因多态性进行研究。结果显示，妊娠高血压综合征组 ACE基因3种基因型频率分别为DD型44. 6%、 ID型33. 7%、 II型21. 7%;对照组ACE基因3种基因型频率 分别为DD型18.战、ID型40. 0%、 II型41. 2%。两组的DD基因型及D等位基因频率比较差异有显著性 (P<0.05)。结果显示ACE基因的缺失多态性(DD)可能为妊高征发病的重要遗传因素之一。
5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因与妊娠期高血压综合征密切相关。MTHFR为亚甲基四氢叶酸 还原酶蛋白编码基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5, 10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸盐。MTHFR基因的缺陷可以导致机体多个必需生化途径的紊乱，包括细胞周期调控、DNA合 成和甲基化修饰等，并进而引发各类心脑血管疾病、癌症和神经管缺陷等多种疾病。2006年，王素敏等人 对同型半胱氨酸代谢酶一甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性在妊高征发病中的作用地位进行研究。 结果显示，病例组MTHFR C677T C/T基因型频率显著高于正常对照组，T等位基因频率显著高下'对照组(P < 0.05)。 MTHFR C677T基因突变是妊高征发生的遗传风险因素，可作为妊髙征预后的检测指标。
肿瘤坏死因子(TNF-a )基因与围产期妊糖密切相关。TNF-a基因编码的蛋白是一种多功能的细胞因 子，它能显著诱导巨噬细胞以抑制细菌生长，诱导多种细胞因子产生间接调节免疫细胞的活性，增强特异 性免疫保护功能，在调节机体组织的糖、脂肪代谢中也起重要作用。国内外的众多研究表明TNF-a基因上 的多态现象与胰岛素、过氧化脂质、血脂、血糖、瘦素等因素相关。TNF-a基因的缺陷可以直接导致炎症, 并大大提髙骨疾病、肿瘤、冠心病、糖尿病等的患病机率。2005年，杨柳等人研究东北汉族妊娠糖尿病(GDM) 孕妇肿瘤坏死因子-a (TNF-a)基因多态性的分布频率及其在GDM发病中的作用。以120例GDM的孕妇作 为病例组，120例糖耐量正常的孕妇作为对照组，检测TNF -a基因-308和-238位点等位基因和基因型的分布频率。结果GDM组和正常妊娠对照组-308多态性位点A等位基因频率(0.1375和0. 0583)及GA + M
基因型频率(0.2417和O. H67)显著高于正常妊娠对照组，差异有统计学意义(P < 0. 05)。结果显示， 我国东北汉族孕妇人群中TNF-a基因-308G—A变异可增加孕妇患妊娠期糖尿病的危险性。
G蛋白亚单位基因(GNB3)与产后肥胖密切相关。GNB3为G蛋白e 3亚单位编码基因。国内外多项 研究表明，该基因上的多态现象与高血压及其用药、肥胖、胰岛素抗性等都有相关性。Siffert等发现825T 等位基因频率在超重者和肥胖者中显著增加。正常、超重和肥胖三个BMI组中825T等位基因频率分别为 德国人29.5%， 39.3 % ， 47. 7 %;中国人46. 8 % ， 53. 9 % , 58. 6 %;南非人83. 1 % ， 87. 7 % ， 90. 9%。三个种族中825T等位基肉与肥胖均显著相关。楼晓明等人的实验结果显示GNB3 825位基因型 可能与肥胖的发生相关，825TT组在体重、体重指数、脂肪含量方面都显著高于825TC和825CC组。
发明内容
根据国家生物基因检测技术应用评估认证中心颁布的《中国人口健康服务基因位点认证规程》，对与 围产期疾病遗传易感风险相关基因位点的支持文献、分子生物学机理研究、中国人群适用性等进行综合分 析评估后，血管紧张素转换酶基因(ACE)上rs4646994号SNP位点、5， 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因 (MTHFR)上rsl801133号SNP位点、G蛋白3亚单位基因基因(GNB3)上rs5443号SNP位点、肿瘤坏死因 子基因(TNF-a )上rs 1800629号SNP位点通过国家生物基因检测技术应用评估认证中心认定，可用于检测 评估围产期疾病遗传易感风险。
基于ACE、 MTHFR、 GNB3、 TNF-a基因上这4个位点的多态性可用来评估个体围产期疾病遗传易感风 险的基础上，本发明提供一种检测个体围产期疾病遗传易感风险的试剂盒。
该试剂盒包括
检测ACE基因上rs4646994号I/D多态性基因型的电泳检测引物对； 检测MTHFR基因上rsl801133号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测GNB3基因上rs5443号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测TNF-a基因上rsl800629号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； PCR反应组件(包括Taq酵、dNTP混合液、MgCh溶液、PCR反应缓冲液、去离子水等)； 荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子 水等)。
本试剂盒中所述的电泳检测引物对是指针对ACE基因上rs4646994号I/D而设计，能通过电泳技术特 异性扩增检测出这个位点基因型的电泳检测引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。 优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 1和2所示序列的电泳检测引物对。电泳检测引物对可用常规的 合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的电泳检测引物对不限于这对引物，所有可用于 电泳技术检测这个位点的电泳检测引物对均在本发明范围内。
本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对MTHFR基因上rsl801133号SNP位点、GNB3基因上rs5443 号SNP位点、TNF- a基因上rsl800629号SNP位点这3个SNP位点，能特异性扩增出包含这3个SNP位点 的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ IDNO: 3和4、 5和6、 7和8所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域 的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这三对引物。
本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是指针对MTHFR基因上rsl801133号SNP位点、GNB3基因上 rs5443号SNP位点、TNF- a基因上rsl800629号SNP位点这3个SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技 术特异性检测出这3个SNP位点基因型的T叫腿n探针对。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成 的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 9和10、 11和12、 13和14所示序列的Taqman探针对。特 异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光 Taqman探针对不限于这三对探针，所有可用于荧光定量PCR法检测这3个SNP位点的探针均在本发明范围 内。
本发明试剂盒的组分和含量包括1. 荧光定量PCR反应套装
10 X荧光定量PCR反应缓冲液3nl， 25raM dNTP混合液0.3pl. 25mM MgC12溶液1. 8|il， 5units/nl Taq DNA聚合酶0.75^1， 20MM特异性引物对每条引物各0.225^1， IOPM特异性荧光探针对每条探针各0.25nl， 去离子水15.975nl。
2. 电泳检测套装
10X PCR反应缓沖液2.5nl， 25mM dNTP混合液0.2^1, 25mM MgCl2溶液1. 5^1， 5units/nl Taq DNA聚合酶0. 125pl， 20nM ACE基因电泳检测引物对每条引物各0.25nl， 去离子水19. 175nl, 本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2:电泳检测分型
使用检测试剂盒中的电泳检测套装，其中，含有下列引物对
有义引物5' - CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT -3' (SEQ ID NO: 1) 反义引物5' - GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT -3' (SEQ ID NO: 2) 反应的体系为总体积25nl，包含浓度为12.5ng/nl的DNA模板lpl、10X PCR反应缓冲液2.5nl，25mM dNTP混合液0.2nl, 25mMMgC12溶液1.5^1, 5units/nl Taq DNA聚合酶0.125^1， 20nMACE基因电泳检 测引物对每条引物各0.25nl，去离子水19.175^1。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为94'C、 12分钟，进行30个循环的94'C、 30秒，60 'C、 30秒，72°C、 30秒，然后进行72'C、 IO分钟。
然后利用电泳技术，进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带数量。
步骤3:荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，其中，含有下列引物对和荧光探针对 有义引物l: 5' - AAAGCTGCGTGA -3' (SEQ ID NO: 3)
反义引物l: 5' - TGAAGGAGAAGGTG -3' 有义引物2: 5' - AGAGCATCATCTGCGGCAT -3' 反义引物2: 5' - GGCGGCCACTGAGGG -3' 有义引物3: 5' - GAGGCAATAGGTTTTGAGGG -3， 反义引物3: 5' - GGACCCTGGAGGCTGAA -3' 带VIC荧光基团探针1: 5' - ATCGgCTCCC -3' 带FAM荧光基团探针1: 5' - TCGaCTCCCGC -3'
(SEQ ID NO: 4) (SEQ ID NO: 5)
(SEQ ID NO: 6) (SEQ ID NO: 7)
(SEQ ID NO: 8)
(SEQ ID NO: 9) (SEQ ID NO: 10)带VIC荧光基团探针2: 5， - ACGTCcGTGGCC -3' (SEQ ID NO: 11) 带FAM荧光基团探针2: 5' - ACGTCtGTGGCCT -3' (SEQ ID NO: 12) 带VIC荧光基团探针3: 5' - CATGaGGACGG -3' (SEQ ID NO: 13) 带FAM荧光基团探针3: 5' - CATGgGGACG -3' (SEQ ID NO: 14)有义引物l，反义引物l、带VIC荧光基团探针1、带FAM荧光基团探针l特异地针对检测MTHFR基因 上rsl801133号SNP位点多态性；有义引物2，反义引物2、带VIC荧光基团探针2、带FAM荧光基团探针2特异地针对检测GNB3基因 上rs5443号SNP位点多态性；有义引物3，反义引物3、带VIC荧光基团探针3、带FAM荧光基团探针3特异地针对检测TNF- a基 因上rsl800629号SNP位点多态性；3个SNP位点分别进行3次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体积10nl，包含浓度为 20ng/nl的DNA模板2jil、 1^1 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0. l^il 25mM dNTP混合液、0. 6^1 25mMMgCl2 溶液、0.025nl (5units/nl) Taq DM聚合酶、20一的有义引物和反义引物各0. 225pl、 lOpM的带VIC 荧光探针和带FAM荧光探针各0. 25nl，去离子水5. 325^1。在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50'C、 2分钟，95°C、 IO分钟，进行60个循环的 95'C、 30秒，60'C、 l分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤4:基因型分析熟悉电泳检测技术的本领域技术人员能够通过辨识电泳图上DNA条带的数量来确定所检测的SNP位点 的基因型。熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根 据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。实施例2.对人们进行个体围产期疾病遗传易感风险检测的服务 步骤l: DNA提取由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DM抽提。步骤2:基因分型检测使用本发明提供的试剂盒.对被检测者基因组DNA的ACE基因上rs4646994号I/D位点进行电泳检测， 对MTHFR基因上rsl801133号SNP位点、GNB3基因上rs5443号SNP位点、TNF- a基因上rsl800629号SNP 位点进行荧光定量PCR检测，确定这4个位点的基因型。步骤3:个体围产期疾病遗传易感风险的分析通过对被检测者SNP基因型的分析，出具个体围产期疾病遗传易感风险的分析报告单。报告中详细说 明了被检测者围产期疾病遗传易感风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体围产期疾病遗传易 感风险分析报告单。序歹lj表<110〉上海主健生物工程有限公司〈120〉 一种检测围产期疾病遗传易感风险的试剂盒<歸14<210〉 1 <211〉 24 <212> DM <213〉人工序列<220><223>引物 <400> 1CTGGAGACCA CTCCCATCCT TTCT 24<210> 2 <211〉 25 <212> DNA <213>人工序列<220><223>引物 〈400> 2GATGTGGCCA TCACATTCGT CAGAT 25<210> 3 <211> 12 <212> DNA <213〉人工序列<220><223〉引物 <400〉 3AAAGCTGCGT GA 12<210> 4 <211> 14 <212> DNA <213〉人工序列<220〉<223〉引物 <柳〉4TGAAGGAGAA GGTG 14<210> <211> <212> <213>519 丽人工序列<220><223>引物 〈400> 5AGAGCATCAT CTGCGGCAT 19<210> <211> 〈212〉 <213>615DNA人工序列<220><223〉引物 <400> 6GGCGGCCACT GAGGG 15<210> 〈211> <212> 〈213>720 腿人工序列<220><223>引物 〈400〉 7GAGGCAATAG GTTTTGAGGG 20<210> 8 <211〉 17 〈212>腿 <213>人工序列<220><223〉引物<formula>formula see original document page 9</formula><210> 9 <211> 10 <212>丽 <213〉人工序列<220><223>探针<formula>formula see original document page 9</formula>人工序列<220><223>探针<400〉 10 TCGaCTCCCG C<210〉 <211> <212> 〈213〉1112 隠人工序列<220><223>探针備> 11 ACGTCcGTGG CC<210〉 <211> <212> <213〉1213 DNA人工序列<220><223〉探针 <400> 12<formula>formula see original document page 9</formula>〈210〉 13 〈211> 11 <212>腿 <213>人工序列<220><223>探针<400〉 13 CATGaGGACG G<210> 14 〈211〉 10 <212> DNA <213>人工序列〈220〉<223>探针<400> 14 CATGgGGACG
权利要求
1. 一种检测围产期疾病遗传易感风险的试剂盒，其特征在于包括检测血管紧张素转换酶基因(ACE)上rs4646994号I/D多态性基因型的电泳检测引物对、检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上rs1801133号SNP位点、G蛋白3亚单位基因基因(GNB3)上rs5443号SNP位点、肿瘤坏死因子基因(TNF-α)上rs1800629号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、PCR反应缓冲液、去离子水等。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述的电泳检测引物对是指针对ACE基因上rs4646994 号1/D而设计，能通过电泳技术特异性扩增检测出这个位点基因型的电泳检测引物对。
3. 根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于:所述的特异性引物对是指针对MTHFR基因上rs1801133 号SNP位点、GNB3基因上rs5443号SNP位点、TNF- a基因上rsl800629号SNP位点这3个SNP位点，能 特异性扩增出包含这3个SNP位点的DNA片段的引物对。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针对是指针对MTHFR基因上 rsl801133号SNP位点、GNB3基因上rs5443号SNP位点、TNF- a基因上rsl800629号SNP位点这3个SNP 位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这3个SNP位点基肉型的Taqman探针对。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在亍所含的电泳检测引物对选自具有SEQ ID NO: l和2 所示序列的引物对。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选自具有SEQIDNO: 3和4、 5 和6、 7和8所示序列的引物对。
7. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEQIDNO: 9和10、 11和12、 13和14所示序列的Taqman探针对。
8. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括-1) 荧光定量PCR反应套装10 X荧光定量PCR反应缓冲液3nl， 25raMdNTP混合液0.3nl， 25mMMgC12 溶液1.8^1， 5units/nlTaqDNA聚合酶0.75^1， 20MM特异性引物对每条引物各0.225pl， IO幽特异性 荧光探针对每条探针各0.25nl，去离子水15.975^1。2) PCR反应套装IOXPCR反应缓冲液2.5^1， 25mM dNTP混合液0.2pl， 25mM MgC12溶液1.5^1， 5units/nlT叫DNA聚合酶0.125|il, 20fiM特异性引物对每条引物各0.25pl，去离子水19.175pl。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
全文摘要
本发明公开了一种检测个体围产期疾病遗传易感风险的试剂盒。该试剂盒包括血管紧张素转换酶基因(ACE)上rs4646994号I/D多态性基因型的电泳检测引物对、检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上rs1801133号SNP位点、G蛋白3亚单位基因基因(GNB3)上rs5443号SNP位点、肿瘤坏死因子基因(TNF-α)上rs1800629号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件、PCR反应组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与围产期疾病遗传易感风险密切相关的ACE、MTHFR、GNB3、TNF-α基因上的多态性位点基因型来评估个体围产期疾病遗传易感风险。
文档编号C12N15/11GK101240323SQ20071003717
公开日2008年8月13日 申请日期2007年2月6日 优先权日2007年2月6日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司