专利名称：重组的sars病毒n蛋白羧基端肽段与gst的融合蛋白及方法
技术领域：
本发明涉及人类医学卫生领域，尤其涉及一种重组的SARS病毒N蛋白羧基端肽段与GST的融合蛋白及方法。
背景技术：
2002年底在世界各地爆发了一种急性呼吸道传染病，世界卫生组织(WTO)称其为重症急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，中文俗称“非典型性肺炎”，简称非典。该病起病急、传播快，病死率高达5-10％。目前涉及到世界近30个国家和地区，全球患者已达8000多例，并造成多人死亡，发病人数仍有不断增加的趋势。
2003年4月16日，世界卫生组织宣布，经过全球10个国家和地区13个实验室的通力合作，确认在全球多个国家快速传染的非典型肺炎(英文名称为SARS，下文简称“非典”)的病原体是一种冠状病毒，以前从未在人体中发现过。非典型肺炎病原，即SARS病毒的分离和确证，对于该病的临床诊断、治疗及预防至关重要，这也是本发明所要解决的问题。
为筛选具有抗原性的冠状病毒特异的蛋白或多肽片断，我们用“非典”病人血清筛选了病毒蛋白的多肽库，发现有些片段呈明显的阳性反应，其中冠状病毒N蛋白(nucleocapsid protein)的羧基端，简称C末端，集中了二个阳性较强的肽段。为进一步调查该片段的抗原性，我们克隆了覆盖该片段的编码序列，并用酵母表达系统进行了体外表达，获得了融合蛋白。用来自病人的血清作Western检测，发现该融合蛋白呈阳性反应，进一步用ELISA检测，融合蛋白与正常人血清呈阴性反应，而与“非典”病人血清呈阳性反应。表明该蛋白可以作为检测SARS病毒的抗原蛋白，用于SARS病人的检测，也可以是作为抗SARS病毒的疫苗的候选蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组的SARS病毒N蛋白羧基端肽段与GST的融合蛋白及方法。
重组的SARS病毒N蛋白羧基端肽段与GST的融合蛋白具有Seq.No.1的序列的多肽。
其方法具体步骤为
1)PCR扩增获得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆；2)转化酵母宿主细胞；3)诱导转化后的酵母细胞进行蛋白质表达；4)回收纯化与GST融合的重组蛋白。
本发明的优点是通过基因重组的方法，利用酵母细胞表达了SARS病毒N蛋白C端的融合蛋白，该融合蛋白能与非典病人的血清呈阳性反应，而与正常人血清呈阴性反应。这表明该融合蛋白可作为SARS病毒检测的抗原体，并能作为疫苗的候选蛋白，同时，我们还建立了表达纯化该融合蛋白的实验体系。
图1是PCR扩增冠状病毒N蛋白的C末端编码区示意图，图中，箭头所示为500bp大小的扩增产物；图2是用EcoRI酶切鉴别重组克隆示意图，图中，pEGH为没有重组的质粒，pEGH-NC为含有SARS病毒N蛋白C端的重组质粒；图3是用Anti-Histag抗体检测重组蛋白的表达示意图；图4是用GST树脂纯化重组蛋白示意图；图5是用SARS病人血清检测重组蛋白的抗原性示意图，图中，A，B分别为两个病人的检测结果，箭头所示为重组的融合蛋白；图6是用ELISA检测不同的抗血清与重组蛋白的反应示意图，图中，1、2、3、4位确诊SARS病人的检测结果，5、6、7、8位正常人对照。
具体实施例方式
一、PCR扩增获得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆提取病毒RNA，以此为模板反转录合成为cDNA后，通过PCR扩增获得含N蛋白C端编码区的产物，克隆到pGEM-T载体(Promega公司)中。以含该片段的质粒DNA为模板，利用含酵母表达载体序列的一对引物将目标片段再次用PCR扩增，获得的产物用1％的琼脂糖电泳检测，所获得的片段符合预计的长度。A.扩增N蛋白C末端所用的引物序列5’-AAAGGACAAAAAGAAAAAGACTG -3’5’- AATTTTACACATTAGGGCTCTTC-3’B.含酵母表达载体序列的引物5′-GGCAGATCGTCAGTCAGTCACGATGAAAATTTTACACATTAGGGCTCTTC-3′5′-GCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGTAAGGACAAAAAGAAAAAGACTG-3′C.扩增的片段序列如发明内容的Seq.No.1所述的多肽片断。
二、转化酵母宿主细胞1.表达载体DNA的线性化本实验所用的酵母表达载体为pEGH(参见Zhu Heng等，Naturegenetics，2000)，将pEGH质粒DNA用HindIII和XbaI酶切后备用。
2.转化酵母细胞混合线性化的pEGH质粒DNA和PCR产物，用PEG法转化酵母细胞，转化后的酵母细胞涂于SC-Ura-固体平板培养基，30度培养2天后，肉眼可见再生菌落。
酵母培养基SC-Ura-固体培养基、SC-Ura-/葡萄糖液体培养基、SC-Ura-/棉子糖液体培养基配制按《酵母遗传实验方法》(清华大学出版社2002年第一版)3.重组菌落的鉴别用苯酚法提取酵母的质粒DNA后，用电激法转化大肠杆菌感受态细胞，挑取再生菌落接种到LB液体培养基(含Ampicillin 60ug/ml)，37度培养过夜后，提取质粒DNA，用EcoRI限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳鉴别重组克隆，含有目标片段的质粒DNA产生的一条片段大于对照质粒DNA，见图2。对目标菌落测序，证明所获得的重组克隆含有来源于SARS病毒的N蛋白C末端。
4.将目标克隆转化酵母细胞将测序确认后的质粒DNA用PEG法转化酵母细胞，转化后的酵母细胞涂于SC-Ura-固体平板培养基，30度培养2-3天后获得再生菌落。
三、融合蛋白的诱导表达与检测接种再生菌落到5ml SC-Ura/葡萄糖液体培养基中，30度振荡培养过夜，取0.2ml过夜菌接种到50ml SC-Ura-/棉子糖培养基中，至OD600＝0.6-0.8后加入D-半乳糖(终浓度为2％)继续振荡培养4-5小时。离心收集培养物，无菌水洗2次。
四、回收纯化与GST融合的重组蛋白用裂解液重新悬浮酵母细胞，加入酸洗过的玻璃珠(Sigma，G-8772)，剧烈振荡3-5分钟，离心后回收上清，再加入裂解液悬浮，振荡，回收上清，合并两次上清，高速离心去掉不溶物，将上清转移到另一离心管中，加入GST树脂(Glutathione-uniflow resin，购自Clontech公司)，旋转混合1小时，离心回收GST树脂，用裂解液洗3次，再加入还原型谷胱苷肽(20mM)，旋转混合1小时，离心回收上清，即为纯化的重组蛋白，将获得的融合蛋白用SDS-PAGE分离后，考马斯亮兰染色，脱色后可见纯化的蛋白条带，考染的结果表明，获得的蛋白纯度较高，没有可见的杂蛋白污染，见图4。
五、Western检测融合蛋白本实验所用的酵母表达载体产生的是“GST-His-目标蛋白”的融合产物，为了检测表达产物，将酵母的细胞裂解液加入点样缓冲液，100度加热5分钟，用10％的SDS-PAGE分离，然后将蛋白样品转到PVDF膜上，用脱脂牛奶封闭1小时，“一抗”用anti-His tag抗体保温2小时，漂洗后加入“二抗”(anti-rabbitIgG，购自北京中山公司)，保温1小时后，用一步法检测试剂盒检测。实验结果如图3所示。表达目标蛋白的泳道的条带显然大于对照泳道中表达GST的条带，表明该系统产生了融合蛋白，从条带的大小及测序结果可以认定，该融合蛋白中含有SARS病毒N蛋白的C末端产物。
六、用Western鉴定融合蛋白的抗原性为了检测该融合蛋白的抗原性，我们将纯化后的融合蛋白经SDS分离后，Western转到PVDF膜上，分别用两份“非典”病人的血清作为“一抗”进行检测，Western检测试剂盒为Promega公司生产的NBT和BCIP。从图5可见，两份病人血清都可以检测到融合蛋白，由此证明了我们体外表达的N蛋白C末端具有SARS病毒的抗原性。
七、用ELISA检测融合蛋白的抗原性为进一步确认该融合蛋白的抗原性，并开发其实用价值，我们将融合蛋白包被在Elisa用的96孔板上，ELISA实验程序1、设空白对照、阳性对照1孔、阴性对照2孔。其余检测孔加入样品稀释液，每孔100μl，再加入待测样品10μl。充分混匀，贴上封口胶，置37□温育30分钟；2、将50倍浓缩洗板液用双蒸水50倍稀释后用于洗涤板孔。
3、弃去各孔中样品，每孔加满洗液，静置数秒后弃去，重复5次，拍干；4、除空白孔外，每孔加入酶标抗人IgG工作液100μl，贴上封口胶，置37□温育20分钟；5、弃去各孔中液体，用洗板液反复洗涤5次，拍干；6、每孔加入底物液A 50μl，再加入底物液B 50μl，轻拍混匀，置37□避光温育10分钟；7、显色完毕后，每孔加入终止液50μl，轻拍混匀，以空白孔调零，置酶标仪450nm波长下测定OD值(参考波长630nm)。
实验结果如图6，表明，非典病人的血清呈阳性反应，而正常血清呈阴性反应。氨基酸序列表<110>杭州华大基因研发中心<120>用酵母表达SARS病毒N蛋白的C末端肽段<160>52<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>13<212>PRT<213>SARS-associated coronavirus(SARS-CoV)<400>1Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro Gln Arg1 5 10 15Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Met Asp20 25 30Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser Ala Asp35 40 45Ser Thr Gln Ala50
权利要求
1.一种重组的SARS病毒N蛋白羧基端(C端)肽段与GST的融合蛋白，其特征在于具有Seq.No.1的序列的多肽。
2.一种SARS病毒N蛋白羧基端肽段与GST的融合蛋白的重组方法，其步骤为1)PCR扩增获得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆；2)转化酵母宿主细胞；3)诱导转化后的酵母细胞进行蛋白质表达；4)回收纯化与GST融合的重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种重组的SARS病毒N蛋白羧基端肽段与GST的融合蛋白的方法，其特征在于所说的PCR扩增获得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆，其步骤为1)分离纯化体外培养的病毒颗粒，提取病毒RNA，以此为模板反转录合成为cDNA后，通过PCR扩增获得含N蛋白C端编码区的产物。扩增N蛋白C末端所用的引物序列5’-AAAGGACAAAAAGAAAAAGACTG-3’5’-AATTTTACACATTAGGGCTCTTC-3’2)PCR产物克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌。3)以含该片段的质粒DNA为模板，利用含酵母表达载体序列的一对引物将目标片段再次用PCR扩增。含酵母表达载体序列的引物5’-GGCAGATCGTCAGTCAGTCACGATGAAAATTTTACACATTAGGGCTCTTC-3’5’-GCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGTAAGGACAAAAAGAAAAAGACTG-3’。
4.根据权利要求2所述的一种重组的SARS病毒N蛋白羧基端肽段与GST的融合蛋白的方法，其特征在于所说的转化酵母宿主细胞，其步骤为1)分离，纯化酵母表达载体pEGH，用限制性核酸内切酶HindIII和XbaI酶切后备用。2)转化酵母细胞。混合pEGH质粒DNA和PCR产物，用PEG法转化酵母细胞，转化后的酵母细胞涂于SC-Ura-固体平板培养基，30度培养2天后，肉眼可见再生菌落。
5.根据权利要求2所述的一种重组的SARS病毒N蛋白羧基端肽段与GST的融合蛋白的方法，其特征在于所说的诱导转化后的酵母细胞进行蛋白质表达是接种再生菌落到5ml SC-Ura/葡萄糖液体培养基中，30度振荡培养过夜，取0.2ml过夜菌接种到50ml SC-Ura-/棉子糖培养基中，至OD600＝0.6-0.8后加入D-半乳糖(终浓度为2％)继续振荡培养4-5小时。离心收集培养物，无菌水洗2次。
6.根据权利要求2所述的一种重组的SARS病毒N蛋白羧基端肽段与GST的融合蛋白的方法，其特征在于所说的回收纯化与GST融合的重组蛋白是用裂解液重新悬浮酵母细胞，加入酸洗过的玻璃珠，剧烈振荡3-5分钟，离心后回收上清，再加入裂解液悬浮，振荡，回收上清，合并两次上清，高速离心去掉不溶物，将上清转移到另一离心管中，加入GST树脂，旋转混合1小时，离心回收树脂，用裂解液洗3次，再加入还原型谷胱苷肽(20mM)，旋转混合1小时，离心回收上清，即为纯化的重组蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种重组的SARS病毒N蛋白羧基端肽段与GST的融合蛋白及方法。融合蛋白具有Seq.No.1的序列的多肽。其方法步骤为1)PCR扩增获得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆；2)转化酵母宿主细胞；3)诱导转化后的酵母细胞进行蛋白质表达；4)回收纯化与GST融合的重组蛋白。该融合蛋白与非典病人的血清呈阳性反应，而与正常人血清呈阴性反应。
文档编号C12N15/81GK1468865SQ0312915
公开日2004年1月21日 申请日期2003年6月4日 优先权日2003年6月4日
发明者刘国振, 胡少晖, 胡咏武, 陈鹏, 殷剑宁, 方健秋, 文洁, 朱衡, 刘斯奇, 于军, 汪建, 杨焕明 申请人:杭州华大基因研发中心