专利名称：生产伽马-羧化的蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码需要伽马-羧化作用的蛋白的核酸分子和相连的包含第一启动子的表达控制序列，和编码Y-谷氨酰羧化酶的核酸分子和相连的包含第二启动子的表达控制序列。本发明进一步涉及以高产量生产需要Y-羧化作用的蛋白的方法。
背景技术：
出血是常见的临床问题。它是疾病、外伤、手术和药物治疗的结果。机械性地阻止出血是必要的。由于出血的位置或由于从许多(小)脉管散开，这是非常困难的或甚至是不可能的。因而出血的病人可能需要用支持止血的试剂治疗。这可以是血液衍生产品(血治疗，heamotherapy)、引起内源止血剂的释放的试剂、重组凝结因子(F)或延迟血液凝块分解的试剂。通常从地方医院获得的血液衍生产品之中第一线的治疗(first line treatment)是用于容量置换和支持止血的全血，包装的红细胞用于改善氧转运容量，血小板浓缩物以提高血小板数量(如果数量低或有缺陷)和新鲜的冷冻血浆用于支持止血(血液凝结和血小板聚集)。支持止血的第二线的血浆衍生产品是血浆冷沉淀物、凝血酶原复合物浓缩物、活化的凝血酶原复合物浓缩物和纯化的凝结因子。作为人类重组蛋白，无活性的 (凝结因子VIII和IX)和活化的(凝结因子Vila)，一些凝结因子当今是可获得的。血友病是遗传的或后天的出血失调，有异常的或缺陷的凝结因子或抑制促凝血功能的针对凝结因子的抗体。最常见的血友病是血友病A(缺乏凝结因子VIII)和血友病 B(因子IX)。提纯的或重组的单独的凝结因子是血友病病人的主要治疗手段。有抑制性抗体的病人遇到了治疗难题，因为抗体也可以中和向该病人施用的凝结因子。通过降解活化的凝结因子Va和Villa，蛋白C的活性形式(APC)是血浆凝结的抑制物。已经显示重组的APC是败血症病人中不适当的血浆凝结的有效治疗手段。尽管纯化过程并不简单和需要许多步骤，某些步骤目的在于消除污染的病毒，用于治疗用途的凝结因子可以从人类血浆获得。但是尽管有血液衍生产品的大量的安全性测量和测试，也无法排除感染性病毒或朊病毒的污染。由于这种风险，非常期望从无动物衍生成分的培养基中生长的重组细胞中产生人类治疗性蛋白。这不总是简单的，因为许多蛋白需要哺乳动物宿主来以完全功能性的形式产生，即，被正确地翻译后修饰。在重组细胞中商业化生产的凝结因子有FVII (NovoSeven)、FVIII (Kogenate，Recombinate, Refacto)和 FIX (BeneFix)(Roddie and Ludlam. Blood Rev. 11 :169-177，1997)和 Active Protein C(Xigris)。在获取大量的全功能重组人凝结因子时的一个主要障碍在于FII、FVII, FIX、FX和蛋白C中存在的Gla结构域。这个结构域含有通过添加羧基基团翻译后修饰的谷氨酸残基。这些因子的生产受到如下事实的妨碍，即它们的过量表达引起羧化不足，由此产生无活性的蛋白。Gla修饰是被称为Y-谷氨酰羧化酶(GGCX)的维生素K依赖性酶的作用的结果。许多科学家，特别是那些致力于凝结因子研究的科学家已经对这个酶进行了广泛的研究(W0-A-8803^6 ;Wu et al. Science 254 (5038) 1634-1636，1991 ； Rehemtulla et al. , Proc Natl Acad Sci USA 90 :4611-4615,1993 ；Stanley J. Biol. Chem. 274(24) : 16940-16944，1999 ；Vo et al.，FEBSletters 445 :256-260,1999 ；Begley et al. ,The Journal of Biological Chemistry 275(46) :36245-36249,2000 ；Walker et al., The Journal of Biological Chemistry 276 (11) :7769-7774,2001 ；Bandyopadhyay, et al. Proc Natl Acad Sci USA 99(3) : 1264—1269，2002 ；Czerwiec et al. ,EurJ Biochem 269 :6162-6172,2002 ；Hallgren et al. , Biochemistry 41 (50) :15045-15055,2002 ； Harvey et al. , The Journal of Biological Chemistry 278(10) :8363-8369,2003)。至少两个科学团队已经进行了通过与凝结因子FIX共表达GGCX来提高产量的尝试，但是没有成功(Rehemtulla, et al. 1993, ibid ；Hallgren et al. 2002，ibid)。考虑到在 Y _ 羧化蛋白方面的巨大兴趣，可以推测有更多的共表达试验失败了并因此没有被报道。对于人类FII (凝血酶原)，为了获得全功能的凝血酶原，10个Glu残基中的至少 8 个必需被正确地修饰(Malhotra，et al.，J. Biol. Chem. 260 :279-287,1985 ；Seegers and Walz' Prothrombin and other vitamin K proteins' , CRC Press, 1986)。获得 rhFII的高生产水平的广泛的努力已经利用了几种不同的系统，例如，CHO细胞、BHK细胞、 293细胞和牛痘病毒表达系统，但是都失败了或产生了羧化不足的产物，因而是功能上无活性的凝血酶原 ΦΕΘηβΘη et al.，J.Biol· Chem. 262 :6729-6734,1987 ；Russo et al.， Biotechnol Appl Biochem 14(2) :222-233,1991 ；Fischer et al.,J Biotechnol 38(2) 129-136,1995 ；Herlitschka et al. Protein Expr. Purif. 8(3) :358-364,1996 ；Russo et al.,Protein Expr. Purif. 10 :214-225,1997 ；Vo et al. 1999,ibid；Wu and Suttie Thromb Res 96(2) :91-98,1999)。较早报道的羧化的重组人类凝血酶原的生产能力很低；突变凝血酶原 20mg/L (Cote et al.，J. Biol. Chem 269 :11374-11380,1994)，在 CHO 细胞中表达的人类凝血酶原0. 55mg/L(完全羧化的，J(trgensen et al. 1987，同上)，在CHO细胞中的 25mg/L(羧化的程度未显示，Russo et al. 1997，同上)。WO 92/19636公开了人类和牛的维生素K依赖性羧化酶的克隆和序列鉴定。该申请建议在适合的宿主细胞中共表达维生素K依赖性羧化酶和维生素K依赖性蛋白来制备维生素K依赖性蛋白。没有例举羧化酶和维生素K依赖性蛋白的共表达。需要改进的方法来以高产量生产活化的凝血因子。本发明要解决这种需求。
发明内容
根据本发明的第一个方面，提供了包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码需要伽马-羧化作用的蛋白的核酸分子和相连的(associated)包含第一启动子的表达控制序列，和编码Y-谷氨酰羧化酶的核酸分子和相连的包含第二启动子的表达控制序列，其中所述第一启动子比所述第二启动子更强，足以使得需要伽马-羧化作用的蛋白和 Y-谷氨酰羧化酶以至少10 1的比例表达。
根据本发明的另一个方面，提供了细胞，其被工程化以表达(i)需要伽马-羧化作用的蛋白，和(ii) Y-谷氨酰羧化酶，其中所述蛋白(i)和( )以10 1到500 1之间的比例表达。根据本发明的另一个方面，提供了遗传地修饰的真核宿主细胞，其包含(i)编码Y-谷氨酰羧化酶蛋白的多核苷酸序列，其中所述Y-谷氨酰羧化酶蛋白编码序列可操作地与表达控制序列连接，所述表达控制序列允许所述细胞表达Y-谷氨酰羧化酶蛋白；和(ii)编码需要所述Y-谷氨酰羧化酶蛋白的羧化作用的蛋白的多核苷酸，可操作地与表达控制序列连接，所述表达控制序列允许所述细胞表达所述需要羧化作用的蛋白；其中所述细胞能够以至少1 10的比例表达所述Y-谷氨酰羧化酶蛋白和所述需要羧化作用的蛋白。根据本发明的进一步的方面，提供了载体，所述载体包含编码需要伽马-羧化作用的蛋白的核酸分子和相连的包括第一启动子的表达控制序列，和编码Y-谷氨酰羧化酶的核酸分子和相连的包含第二启动子的表达控制序列，其中所述第一启动子比所述第二启动子更强，足以使得需要伽马-羧化作用的蛋白和Y-谷氨酰羧化酶以至少10 1的比例表达。根据本发明的又另一个方面，提供了生产伽马-羧化的蛋白的方法，包括(i)培养细胞，所述细胞被改造(adapted)来以至少10 1的比例表达需要伽马-羧化作用的蛋白和Y-谷氨酰羧化酶，在适合于表达这两种蛋白的条件下培养，和(ii)分离伽马-羧化的蛋白。在一个实施方式中，该方法用于生产伽马-羧化的人类因子IX，在另一个实施方式中该方法用于生产伽马-羧化的人类凝血酶原。在另一个实施方式中，所述生产的伽马-羧化的蛋白是人类伽马-羧化的因子X。根据本发明的另一个方面，提供了在哺乳动物细胞系中生产伽马-羧化的蛋白的方法，包括在所述哺乳动物细胞系中使所述需要伽马-羧化作用的蛋白与Y-谷氨酰羧化酶共表达的步骤，其中表达的需要伽马-羧化作用的蛋白的数量至少是表达的Y-谷氨酰羧化酶的数量的10倍，和(ii)分离伽马-羧化的蛋白。在一个实施方式中，该方法用于生产伽马-羧化的人类因子IX，在另一个实施方式中该方法用于生产伽马-羧化的人类凝血酶原。在另一个实施方式中，所述生产的伽马-羧化的蛋白是人类伽马-羧化的因子X。根据本发明的进一步的方面，提供了根据上述方法生产的分离的伽马-羧化的蛋白，根据上述方法生产的分离的伽马-羧化的蛋白在凝结治疗中的用途，或根据上述方法生产的分离的伽马-羧化的蛋白用于制造用于凝结治疗(coagulation therapy)的药物的用途。根据本发明的再进一步的方面，提供了生产适合于诱导血液凝固或促进增加的或减少的凝结的药物组合物的方法，包括纯化从宿主细胞表达的活性羧化的蛋白，所述宿主细胞被改造来以10 1到500 1之间的比例表达需要伽马-羧化作用的蛋白和γ-谷氨酰羧化酶，和将所述纯化的羧化蛋白与一种或多种药学上可接受的载体(carrier)或赋形剂混合，以及可从该方法获得的药物组合物。在一个实施方式中，所述活性羧化的蛋白是伽马-羧化的人类因子IX，在另一个实施方式中所述活性羧化的蛋白是伽马-羧化的人类凝血酶原。在另一个实施方式中，所述活性羧化的蛋白是人类伽马-羧化的因子X。
附图Ia说明了 PN32 (凝血酶原+GGCX)共表达载体的质粒图。附图Ib表示了 Ptext5 (凝血酶原)表达载体的质粒图。附图2表示了 PP6 (凝血酶原+GGCX)共表达载体的质粒图。附图3a表示了 F9NopA(因子IX+GGCX)共表达载体的质粒图。附图北表示了 F9hglx(因子IX+GGCX)共表达载体的质粒图。
具体实施例方式我们设计了高水平表达适当羧化的重组维生素K依赖性凝血因子的不同方法，包括以不同的比例共表达维生素K依赖性凝结因子和Y-谷氨酰羧化酶(GGCX)。作为一个实例，我们表达了人类凝血酶原(rhFII)和人类GGCX。与其他人(Rehemtulla et al.，1993， 同上；Hallgren et al.，2002，同上)已经尝试的对rhFII和GGCX都使用强启动子不同，我们使用一种策略，旨在强表达FII结合弱或极弱表达GGCX，使得表达的GGCX的数量是表达的rhFII的1/10以下。出乎我们意料，这种策略引起了高水平的、分泌的正确修饰的rhFII 和宿主细胞的良好生存力，即使是细胞在无动物成分的化学成分明确的培养基中生长时。我们已经以这样的方式将GGCX和人类凝血酶原克隆到表达载体中，以使凝血酶原mRNA水平超过GGCX mRNA水平的至少9倍。这引起了与GGCX蛋白相比产生大量过剩的凝血酶原蛋白。作为进一步的实例，我们使用相同的GGCX共表达载体表达了 rhFIX。这产生了细胞系，在一种情况中细胞系产生因子IX mRNA的水平超过GGCX mRNA水平的至少9倍。在另一个细胞系中，因子IX GGCX mRNA比例大约4-5 1。仅有产生至少10 1的比例的细胞系显示了显著提高的rhFIX生产力(表1)。表1.生产力和羧化的蛋白GGCX mRNA比例的总览
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权利要求
1.一种包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码需要伽马-羧化作用的蛋白的核酸分子和相连的包含第一启动子的表达控制序列，和编码Y-谷氨酰羧化酶的核酸分子和相连的包含第二启动子的表达控制序列，其中所述第一启动子比所述第二启动子更强，足以使得需要伽马-羧化作用的蛋白和Y-谷氨酰羧化酶以至少10 1的比例表达。
2.如权利要求1中所要求的宿主细胞，其中所述核酸分子在单个表达载体中。
3.如权利要求1或2中所要求的宿主细胞，其中所述第一启动子是人类巨细胞病毒 (hCMV)即时-早期启动子，和所述第二启动子是SV40早期启动子。
4.一种细胞，其被工程化以表达(i)需要伽马-羧化作用的蛋白，和(ii) Y-谷氨酰羧化酶，其中所述蛋白(i)和(ii)以10 1到500 1之间的比例表达。
5.如权利要求1到4中任何一个所要求的细胞，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白选自由凝结因子VII、凝结FVII、凝结因子IX、凝结FIX、凝血酶原、凝结因子II、凝结FII、 凝结因子X、凝结FX、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨Gla蛋白、基质Gla蛋白、生长停滞-特异性蛋白6和Acanthophiinae FXa-样蛋白构成的组。
6.如权利要求1到4的任何一个所要求的细胞，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是维生素K依赖性凝结因子。
7.如权利要求1到6的任何一个所要求的细胞，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是因子IX。
8.如权利要求1到6的任何一个所要求的细胞，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是因子X。
9.如权利要求1到6的任何一个所要求的细胞，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是凝血酶原。
10.如权利要求1到9的任何一个所要求的细胞，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是人类蛋白。
11.如权利要求1到10的任何一个所要求的细胞，其中Y-谷氨酰羧化酶是人类蛋白。
12.如权利要求1到11的任何一个所要求的细胞，其中所述细胞选自由哺乳动物细胞、 酵母细胞或昆虫细胞构成的组。
13.如权利要求12所要求的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
14.一种遗传修饰的真核宿主细胞，包括(i)编码Y-谷氨酰羧化酶蛋白的多核苷酸序列，其中所述Y-谷氨酰羧化酶蛋白编码序列可操作地与表达控制序列连接，所述表达控制序列允许所述细胞表达Y-谷氨酰羧化酶蛋白；和(ii)编码需要所述Y-谷氨酰羧化酶蛋白的羧化作用的蛋白的多核苷酸，可操作地与表达控制序列连接，所述表达控制序列允许所述细胞表达所述需要羧化作用的蛋白；其中所述细胞能够以至少1 10的比例表达所述Y-谷氨酰羧化酶蛋白和所述需要羧化作用的蛋白。
15.一种载体，包含编码需要伽马-羧化作用的蛋白的核酸分子和相连的包含第一启动子的表达控制序列，和编码Y-谷氨酰羧化酶的核酸分子和相连的包含第二启动子的表达控制序列，其中所述第一启动子比所述第二启动子更强，足以使得需要伽马-羧化作用的蛋白和Y-谷氨酰羧化酶以至少10 1的比例表达。
16.如权利要求3中所要求的载体，其中所述第一启动子是人类巨细胞病毒(hCMV)即时-早期启动子，和所述第二启动子是SV40早期启动子。
17.如权利要求3或4中所要求的载体，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白选自由凝结因子VII、凝结FVII、凝结因子IX、凝结FIX、凝血酶原、凝结因子II、凝结FII、凝结因子 X、凝结FX、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨Gla蛋白、基质Gla蛋白、生长停滞-特异性蛋白6和 Acanthophiinae FXa-样蛋白构成的组。
18.如权利要求15到17的任何一个所要求的载体，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是因子IX。
19.如权利要求15到17的任何一个所要求的载体，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是因子X。
20.如权利要求15到17的任何一个所要求的载体，其中所述需要伽马-羧化作用的蛋白是凝血酶原。
21.—种生产伽马-羧化的蛋白的方法，包括(i)培养细胞，所述细胞被改造来以至少 10 1的比例表达需要伽马-羧化作用的蛋白和Y-谷氨酰羧化酶，在适合于表达这两种蛋白的条件下培养，和(ii)分离伽马-羧化的蛋白。
22.—种在哺乳动物细胞系中生产伽马-羧化的蛋白的方法，包括在所述哺乳动物细胞系中使所述需要伽马-羧化作用的蛋白与Y-谷氨酰羧化酶共表达的步骤，其中表达的需要伽马-羧化作用的蛋白的数量至少是表达的Y-谷氨酰羧化酶的数量的10倍，和(ii) 分离伽马-羧化的蛋白。
23.根据权利要求21或22中要求的方法生产的分离的伽马-羧化的蛋白。
24.根据权利要求21或22生产的分离的羧化的蛋白在凝结治疗中的用途。
25.根据权利要求21或22生产的分离的羧化的蛋白在制造用于凝结治疗的药物方面的用途。
26.—种生产适合于诱导血液凝固或促进增加的或减少的凝结的药物组合物的方法， 包括纯化从宿主细胞表达的活性羧化的蛋白，所述宿主细胞被改造来以10 1到500 1 之间的比例表达需要伽马-羧化作用的蛋白和Y-谷氨酰羧化酶，和将所述纯化的羧化蛋白与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合。
27.可从权利要求沈的方法获得的药物组合物。
28.—种生产伽马-羧化的人类因子X的方法，包括(i)培养细胞，所述细胞被改造来以至少10 1的比例表达人类因子X和人类Y-谷氨酰羧化酶，在适合于表达这两种蛋白的条件下培养，和(ii)分离伽马-羧化的因子X。
29.根据权利要求观生产的分离的因子X在凝结治疗中的用途。
30.根据权利要求观生产的分离的因子X在制造用于凝结治疗的药物方面的用途。
31.包含可从权利要求观的方法获得的伽马-羧化的人类因子X的药物组合物。
32.—种生产伽马-羧化的人类因子IX的方法，包括(i)培养细胞，所述细胞被改造来以至少10 1的比例表达人类因子IX和人类Y-谷氨酰羧化酶，在适合于表达这两种蛋白的条件下培养，和(ii)分离伽马-羧化的因子IX。
33.根据权利要求32生产的分离的因子IX在凝结治疗中的用途。
34.根据权利要求32生产的分离的因子IX在制造用于凝结治疗的药物方面的用途。
35.包含可从权利要求32的方法获得的伽马-羧化的人类因子IX的药物组合物。
36.一种生产伽马-羧化的人类凝血酶原的方法，包括(i)培养细胞，所述细胞被改造来以至少10 1的比例表达人类凝血酶原和人类Y-谷氨酰羧化酶，在适合于表达这两种蛋白的条件下培养，和(ii)分离伽马-羧化的凝血酶原。
37.根据权利要求36生产的分离的凝血酶原在凝结治疗中的用途。
38.根据权利要求36生产的分离的凝血酶原在制造用于凝结治疗的药物方面的用途。
39.包含可从权利要求36的方法获得的伽马-羧化的人类凝血酶原的药物组合物。
40.一种在受试者中促进提高或降低的凝结的方法，包括向有此需要的病人施用药理学有效量的、通过权利要求21或22的方法获得的分离的伽马-羧化的蛋白。
全文摘要
本发明涉及生产大量的伽马-羧化的蛋白的方法和工具，包括(i)培养细胞，所述细胞被改造来以至少10∶1的比例表达需要伽马-羧化作用的蛋白和γ-谷氨酰羧化酶，在适合于表达这两种蛋白的条件下培养，和(ii)分离伽马-羧化的蛋白。
文档编号C12N9/64GK102443548SQ20111024138
公开日2012年5月9日 申请日期2004年10月12日 优先权日2003年10月14日
发明者A·勒夫格伦, A·特林, C·芬格 申请人:阿斯特拉曾尼卡有限公司