生物可分解载体、其制备方法及包含其的医药组合物的制作方法
【专利摘要】本发明有关于一种可任意调整界面电荷与粒径大小的生物可分解载体、其制备方法及包含其的医药组合物，其中该制备方法是先准备一可生物分解的第一高分子溶液，根据载体所需的界面电荷，配制一可生物分解的第二高分子溶液并将其加入至第一高分子溶液中，通过电荷异性相吸的作用力形成载体结构，使得载体具有上述所需的界面电荷，然后，再根据载体所需的粒径大小，以等比例调整第一高分子溶液与第二高分子溶液的溶质摩尔数；因此，使得载体能以人为操作的方式任意地改变其表面带电性以及粒径大小。
【专利说明】生物可分解载体、其制备方法及包含其的医药组合物
【技术领域】
[0001]本发明有关于一种可任意调整界面电荷与粒径大小的生物可分解载体、其制备方法及包含其的医药组合物，尤其是指一种能以人为操作的方式任意地改变载体表面带电性以及粒径大小，不仅可符合受载物所需的应用策略，且所形成的载体其粒径大小与界面电荷较为均一，使得包含有载体的医药组合物更容易通过渗透或被巨噬细胞吞噬，有效发挥受载物的功效者。
【背景技术】
[0002]目前，许多研究已指出可利用生物性高分子作为药物载体，进行药物包覆及释放；一般而言，药物载体是指能承载分子级药物或蛋白质，以解决许多传统医学无法处理的疑难杂症；例如以脂质体(liposome)传送系统作为载体，已经用于多种化合物，包括药理活性化合物、诊 断物质与化妆品，是目前最具有潜力的药物传输载体之一；而上述的脂质体为一具有一层或多层脂质双层膜的空心圆球，圆球内部为一亲水性核心，可包覆亲水性物质，且脂质双层膜的疏水构造，可包覆疏水性物质，该脂质双层膜成份与生物体细胞的细胞膜相似，并具有生物兼容性与生物可分解性，所以脂质体常被广泛应用于药物传输载体；举例而言，佐剂应用在疫苗发展上已超过60年，主要的作用机制一般包括有:(a)增加疫苗抗原的生物或免疫性储存生命；(b)帮助抗原被输送至抗原呈现细胞；(c)改善抗原呈现细胞的抗原处理；以及(d)诱导免疫调节细胞活素的产生等；其中佐剂的类型又可分为无机盐类、传送系统、细菌产物以及自然媒介物，而除了铝盐(氢氧化铝及磷酸铝)确实可以使用在人体上，就属脂质体最为热烈地应用于人体及癌细胞株的各项试验，其原因是脂质体可以并入几乎所有任何构造分子，且甚至有许多的人体试验已应用于多种癌症、艾滋病(AIDS)、病毒及细菌感染疾病、多发性骨髓瘤、卡波西氏肉瘤、念珠球菌性脑膜炎、抗霉菌效应以及做为人类造红血球生成素(erythropoitin)及药物的传送系统上。
[0003]上述的脂质体应用与发展无论在生物学或者制药医学上都有着相当高的发展价值；然而，一般利用现有的脂质体制备方法所获得的脂质体并无法精准地控制其成型的粒径大小及表面的电荷量，导致粒径与电荷的分布范围较大，造成脂质体易产生聚集及融合两现象，聚集是脂质体因分子间的引力而倾向发生聚集的现象；而融合是脂质体因聚集现象的延伸，当脂质体发生聚集后，两脂质体的接触位置会发生不稳定而产生缺陷，此缺陷会促进数脂质体的脂质混合成一大粒子(多数为粒径较大的脂质体融合粒径较小的脂质体)，使得脂质体粒径变大，导致不容易被细胞吸收，而降低作为药物载体的实用性，进而影响脂质体的应用发展；再者，脂质体的制备方法发展至今，已可利用薄膜水合法、有机溶剂注射法、清洁剂透析法等方法来制备，但是不论上述何种方法，都须经过繁琐的溶剂蒸发以及水合作用等步骤，使得制备成本大为提高；此外，脂质体由于具有一层或多层的脂质双层，导致保存上必须以悬浮液(suspension)的方式保存较佳，而不易以干粉的型态保存，造成运送成本的增加。
【发明内容】
[0004]本发明的发明人即是鉴于上述现有的高分子(药物、蛋白质等)载体在实际实施时仍具有多处的缺失，于是本着孜孜不倦的精神，并通过其丰富的专业知识及多年的实务经验所辅佐，而加以改善，并据此研创出本发明。
[0005]本发明的主要目的为提供一种制备可任意调整界面电荷与粒径大小的生物可分解载体的方法，其主要包含有下述步骤:首先，准备一可生物分解的第一高分子溶液，其中第一高分子可为带有负电的肝素或聚谷氨酸中的一种；接着，根据载体所需的界面电荷，配制一可生物分解的第二高分子溶液并将其加入至第一高分子溶液中，通过电荷异性相吸的作用力形成载体结构，使得载体具有上述所需的界面电荷，其中第二高分子可例如为带有正电的几丁聚糖或胶原蛋白中的一种；然后，再根据载体所需的粒径大小，以等比例调整第一高分子溶液与第二高分子溶液的溶质摩尔数，其中载体的粒径大小是正相关于混合溶液的溶质摩尔数，以使载体具有该粒径大小；最后，过滤混合溶液，以得出一生物可分解载体；因此，以先固定载体所需的界面电荷，再调整混合溶液的浓度来达到所需粒径的载体制备方法，使得载体能以人为操作的方式任意地改变其表面带电性以及粒径大小，以便针对不同的受载物所需的物理化学性质有不同的应用策略。
[0006]具体而言，本发明提供一种可任意调整界面电荷与粒径大小的生物可分解载体的制备方法，其包括如下步骤:
[0007]步骤一:准备一可生物分解的第一高分子溶液，其中该第一高分子带有第一电性；
[0008]步骤二:根据载体所需的界面电荷，配制一可生物分解的第二高分子溶液并将其加入至该第一高分子溶液中，其中该第二高分子带有第二电性，且该第一电性与该第二电性为电荷相反，通过电荷异性相吸的作用力形成载体结构，并使该载体具有该界面电荷；
[0009]步骤三:根据载体所需的粒径大小，以等比例调整该第一高分子溶液与该第二高分子溶液的溶质摩尔数，其中该载体的粒径大小是正相关于混合溶液的溶质摩尔数，以使该载体具有该粒径大小；以及
[0010]步骤四:过滤得自步骤三的混合溶液，以得出一种生物可分解载体。
[0011]本发明所制备的生物可分解载体其粒径大小与界面电荷较为均一，可使得载体于混合溶液中具有较佳的分散性，于干燥过程不会发生聚集现象，因而能以干粉的型态保存，解决现有的脂质体必须以悬浮液的方式保存的不便，进而减少运送上的成本费用。
[0012]此外，在上述的制备步骤中，可在第一高分子溶液或第二高分子溶液中，加入一受载物，使得过滤混合溶液所得到的载体包覆受载物；其中，受载物可选自核酸物质、短肽、蛋白质药物、小分子化合物、病毒、细菌，以及细胞所构成的群组，且受载物的电性较佳的相同于想要加入的溶液电性。
[0013]本发明的另一目的是提供一种可任意调整界面电荷与粒径大小的生物可分解载体，其是通过本发明所述的方法制备的。其中，载体的粒径大小可介于微米至纳米等级，较佳的粒径大小介于10 μ m至40nm,且载体的界面电荷可控制介于+35mv至_35mv ;此外，上述的生物可分解载体可用以包覆一受载物。
[0014]本发明的又一目的为提供一种医药组合物，其包含如上所述的可任意调整界面电荷与粒径大小的生物可分解载体、被包覆于载体内的受载物，以及一或多种医药学上可接受的载剂。其中，受载物可选自核酸物质、短肽、蛋白质药物、小分子化合物、病毒、细菌，以及细胞所构成的群组；因此，由于载体能通过人为操作轻易地改变其表面带电性以及粒径大小，不仅能操控受载体的释放时效，也使得医药组合物能通过刺激特定形式的免疫反应，加强免疫系统针对特定抗原的免疫反应，达成增加疫苗保护效力的功效；此外，由于本发明所制备的生物可分解载体其粒径大小与界面电荷较为均一，可避免如现有脂质体因粒径与电荷的分布范围较大所产生聚集及融合现象，使得本发明包含有载体的医药组合物更容易通过渗透或被巨噬细胞吞噬，并因生物可分解性而释放出受载物，从而发挥受载物的作用。
[0015]如上所述的医药组合物，其较佳是用于制造治疗或预防出血性登革热或登革休克症候群疾病的疫苗或药剂。
[0016]由上述的说明可知，本发明与现有技术相较之下，本发明具有以下优点:
[0017] 1.本发明可依照不同应用层面调整第一、二高分子不同浓度的混合比例，以此控制混合所形成的载体其界面电荷以及粒径大小，因此能够针对不同的受载物其所需的物理化学性质以人为操作的方式任意地改变载体表面带电性以及粒径大小，以符合受载物所需应用的策略。
[0018]2.本发明所制备的生物可分解载体其粒径大小与界面电荷较为均一，可避免如现有脂质体因粒径与电荷的分布范围较大所产生聚集及融合现象，使得本发明包含有载体的医药组合物更容易通过渗透或被巨噬细胞吞噬，并因生物可分解性而释放出受载物，从而发挥受载物的作用。
[0019]3.本发明的载体由于粒径大小与界面电荷较为均一，使得载体在混合溶液中具有较佳的分散性，在干燥过程不会发生聚集现象，因而能以干粉的型态保存，解决现有的脂质体必须以悬浮液的方式保存的不便，进而减少运送上的成本费用。
[0020]4.本发明的包含载体的医药组合物因载体能通过人为操作轻易地改变其表面带电性以及粒径大小，不仅能操控受载体的释放时效，也使得医药组合物能通过刺激特定形式的免疫反应(例如:第一型和第二型T细胞反应)，加强免疫系统针对特定抗原的免疫反应，达成增加疫苗保护效力的功效。
[0021]5.本发明的生物可分解载体制备仅需调整高分子浓度的简易工艺即可制备所需粒径大小与界面电荷的载体，无须如现有脂质体需通过繁琐的溶剂蒸发以及水合作用等步骤，使得制备成本大为降低。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本发明较佳实施例的生物可分解载体制备方法步骤流程图；
[0023]图2为本发明具体实施例的几丁聚糖与聚谷氨酸混合溶液于不同浓度(IX~10X)与载体平均粒径的趋势关系图；
[0024]图3为本发明具体实施例的几丁聚糖与聚谷氨酸混合溶液于不同浓度(20X~40X)与载体平均粒径的趋势关系图。
[0025]主要组件符号说明:
[0026]SI步骤一 S2步骤二
[0027]S3步骤三S4步骤四【具体实施方式】
[0028]本发明的目的及其结构功能上的优点，将依据下图所示的结构，配合具体实施例予以说明，以使人们能对本发明有更深入且具体的了解。
[0029]首先，请参照图1所示，为本发明的可任意调整界面电荷与粒径大小的生物可分解载体制备方法其较佳实施例的步骤流程图，主要包括有如下步骤:
[0030]步骤一(SI):准备一可生物分解的第一高分子溶液，其中第一高分子带有第一电性；且第一高分子可为带负电的肝素(heparin，HP)或聚谷氨酸(Y-PGA)中的一种；
[0031]步骤二(S2):根据载体所需的界面电荷，配制一可生物分解的第二高分子溶液并将其加入至第一高分子溶液中，其中第二高分子带有第二电性，且第一电性与第二电性为电荷相反，通过电荷异性相吸的作用力形成载体结构，且载体具有上述所需的界面电荷；而上述的第二高分子可例如为带正电的几丁聚糖(chitosan, CS)或胶原蛋白(collagen)中的一种；
[0032]步骤三(S3):根据载体所需的粒径大小，再以等比例调整第一高分子溶液与第二高分子溶液的溶质摩尔数，其中载体的粒径大小是正相关于第一高分子溶液与第二高分子溶液的混合溶液的溶质摩尔数，以使载体具有所需的粒径大小；以及
[0033]步骤四(S4):最后，过滤得自步骤三(S3)的混合溶液，以得出一种可任意调整界面电荷与粒径大小的生物可分解载体；其中，载体的粒径大小可介于微米至纳米等级，较佳的粒径大小介于10 μ m至Onm,且载体的界面电荷可控制介于+35mv至_35mv。
[0034]此外，于上述的制备步骤中，可在第一高分子溶液或第二高分子溶液中，加入一受载物，使步骤三(S3)所形成的载体包覆受载物；其中，受载物可选自核酸物质(例如为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)等)、短肽、蛋白质药物、小分子化合物、病毒、细菌，以及细胞所构成的群组，且受载物的电性较佳是相同于所加入的溶液电性。
[0035]接着，通过下述具体实际实施例，制备出可任意调整界面电荷与粒径大小的生物可分解载体，并进一步证明本发明的工艺可实际应用的范围，但不以任何形式限制本发明的范围:
[0036]步骤一:首先，准备一可生物分解的第一高分子溶液，其中第一高分子是选自聚谷氨酸，其具体的制备方式是取适当重量的聚谷氨酸粉末加入去离子水后，以电磁搅拌器搅拌至完全溶解；接着，将完全溶解的聚谷氨酸溶液装至透析膜中，置于去离子水中透析，使得聚谷氨酸中的钠离子被透析至去离子水中并随着去离子水被移除，其透析过程是将去离子水及聚谷氨酸溶液保存于4°C冰箱中以避免聚谷氨酸长菌；然后，将透析完成的聚谷氨酸溶液置于_20°C冰箱中，待其完全结成冰晶以利进行冷冻干燥；接续，将结为冰晶的聚谷氨酸放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，以将溶液中的水份完全去除，此时聚谷氨酸呈结晶粉末状；再将此聚谷氨酸的结晶粉末保存于灭过菌的离心管中，并储藏于防潮箱中；最后，取出适当重量的聚谷氨酸结晶粉末加入去离子水，使聚谷氨酸溶液浓度达到所需的设定值，即完成一可生物分解且带负电的第一高分子溶液；然而必需注意的是，应了解上述第一高分子溶液的制备方法是为了方便说明一具体实施例，而非以本例所举为限，在阅读及了解本发明的教导后，相关的变化实施属于业界技能，因此，并不限定上述实施例第一高分子溶液的制备方式；
[0037]步骤二:根据载体所需的界面电荷，配制一可生物分解的第二高分子溶液并将其加入至第一高分子溶液中，其中第二高分子是选自几丁聚糖，其具体的制备方式是秤取5g的低粘性(low-viscous)几丁聚糖,并加入495ml的去离子水以及5ml的冰醋酸(Aceticacid glacial)，以电磁加热搅拌器搅拌直至几丁聚糖溶液呈现黄色澄清透明的状态；值得注意的，几丁聚糖在酸性的环境下(冰醋酸)其结构的-NH2会变为-NH3+,使得整条几丁聚糖高分子长链即带有正电荷；同时，几丁聚糖的乙酰度也会影响到长链上所带有正电的比例，举例而言，当几丁聚糖的乙酰度达100%时，几丁聚糖长链上就完全是-NH2，而当几丁聚糖的乙酰度〈100%时，高分子长链上就会出现一些乙酰的官能基，而这些官能基在酸性环境下并不会带正电，故会导致整条高分子链所带的正电总量下降，使得制备第二高分子溶液时需要加入更多的几丁聚糖才能使溶液中达到相同的正电量；接着，将上述溶液装至透析膜中，并置于去离子水中，以将几丁聚糖溶液中的冰醋酸透析至去离子水中，使得几丁聚糖溶液在透析后的pH值约在6.5左右；然后，将透析完成的几丁聚糖溶液以抽气过滤装置将其中的杂质滤掉；最后，置于加热搅拌器上，温度设置为135°C，以磁搅拌子搅拌直至几丁聚糖溶液浓度达到20~30mg/ml，即完成一可生物分解且带正电的第二高分子溶液；同样地，应了解上述第二高分子溶液的制备方法是为了方便说明一具体实施例，在阅读及了解本发明的教导后，相关的变化实施属于业界技能，在此并不限定上述实施例第二高分子溶液的制备方式；值得注意的，上述的第一、二高分子可例如分别为肝素或聚谷氨酸，以及几丁聚糖或胶原蛋白等天然高分子，也可为人工合成的可生物分解高分子；在此，是取步骤一制备的聚谷氨酸溶液5ml加入步骤二所制备的几丁聚糖溶液6ml中，使得混合总体积为11ml，并以磁石搅拌2分钟；其中聚谷氨酸与几丁聚糖两者的总重(干重)为2mg，并将上述混合溶液浓度设定为一倍浓度(IX)，而后续实验的倍数皆以此为基准提高浓度倍数；将Ilml的混合溶液过滤，以得出一种生物可分解载体，分析其界面电荷约为13mV，而粒径大小约为40nm;下表1所述即为本具体实施例其几丁聚糖(CS)与聚谷氨酸(Y-PGA)的电荷比、重量比与混合所形成载体的粒径、界面电荷(Zeta potential)的关系比较表；其中N/A是因载体沉淀导致动态光散射仪(dynamic light scattering, DLS)无法测量确切的数据，此处的 DLS 是使用型号 Zetasizer Nano Serie (3000HS, Malvern Instruments,Worcestershire, UK);由表1可看发现在一倍浓度下,几丁聚糖溶液与聚谷氨酸溶液较佳是在电荷比CS:y-PGA=4:1情况下合成出来的载体结果呈现良好稳定的状态，其余电荷比CS: Y -PGA=3:1或2:1在两溶液混合完当下就立刻产生沉淀；
[0038]表1
【权利要求】
1.一种可任意调整界面电荷与粒径大小的生物可分解载体的制备方法，其包括如下步骤: 步骤一:准备一可生物分解的第一高分子溶液，其中该第一高分子带有第一电性； 步骤二:根据载体所需的界面电荷，配制一可生物分解的第二高分子溶液并将其加入至该第一高分子溶液中，其中该第二高分子带有第二电性，且该第一电性与该第二电性为电荷相反，通过电荷异性相吸的作用力形成载体结构，并使该载体具有该界面电荷； 步骤三:根据载体所需的粒径大小，以等比例调整该第一高分子溶液与该第二高分子溶液的溶质摩尔数，其中该载体的粒径大小是正相关于混合溶液的溶质摩尔数，以使该载体具有该粒径大小；以及 步骤四:过滤得自步骤三的混合溶液，以得出一种生物可分解载体。
2.根据权利要求1所述的生物可分解载体的制备方法，其中该第一高分子为肝素或聚谷氨酸中的一种，且该第一电性为负电。
3.根据权利要求2所述的生物可分解载体的制备方法，其中该第二高分子为几丁聚糖或胶原蛋白中的一种，且该第二电性为正电。
4.根据权利要求3所述的生物可分解载体的制备方法，其中在该第一高分子溶液或第二高分子溶液中，加入 一受载物，使步骤三所形成的载体包覆该受载物。
5.根据权利要求4所述的生物可分解载体的制备方法，其中该受载物选自核酸物质、短肽、蛋白质药物、小分子化合物、病毒、细菌，以及细胞所构成的群组。
6.根据权利要求5所述的生物可分解载体的制备方法，其中该受载物的电性相同于所加入的溶液电性。
7.—种可任意调整界面电荷与粒径大小的生物可分解载体，其特征在于，其是通过权利要求I所述的方法制备的。
8.根据权利要求7所述的可任意调整界面电荷与粒径大小的生物可分解载体，其中该载体的粒径大小介于微米至纳米等级。
9.根据权利要求8所述的可任意调整界面电荷与粒径大小的生物可分解载体，其中该载体的粒径大小介于10 μ m至40nm。
10.根据权利要求7所述的可任意调整界面电荷与粒径大小的生物可分解载体，其中该载体的界面电荷介于+35mv至-35mv。
11.一种医药组合物，其特征在于，其包含权利要求7所述的可任意调整界面电荷与粒径大小的生物可分解载体、被包覆于该载体内的受载物，以及一或多种医药学上可接受的载剂。
12.根据权利要求11所述的医药组合物，其中该受载物选自核酸物质、短肽、蛋白质药物、小分子化合物、病毒、细菌，以及细胞所构成的群组。
13.根据权利要求12所述的医药组合物，其是用于制造治疗或预防出血性登革热或登革休克症候群疾病的疫苗或药剂。
【文档编号】A61K47/34GK103910892SQ201310308965
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2013年7月22日 优先权日:2013年1月9日
【发明者】林以行, 陈毓宏 申请人:林以行