专利名称：具有生物相容性的SA/CS－CaCl的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有生物相容性的SA/CS-CaCl2/PMCG微胶囊制备方法。籍此可以进行微生物细胞的培养。
背景技术：
生物微胶囊技术是为器官移植所带动并发展起来的高新技术。用细胞移植来治疗诸如荷尔蒙或蛋白质缺乏等各种人类疾病还很有限，因为所移植的细胞很快会被受体免疫系统摧毁。要克服此障碍，就要使分泌荷尔蒙或蛋白质的细胞包裹在半透膜中以免受受体免疫系统的攻击，但同时又允许对细胞功能或生存有重要作用的小分子(如氧和氮等)的进入及所需的细胞产物的排出。而生物微胶囊的半透膜就具有此免疫隔离的功能。因此，生物微胶囊的制备及其应用已成为生物医药工程、蛋白质化学、内分泌学等领域的研究热点之一。同时，作为细胞固定化技术的重要组成部分，其应用领域已涉及生物学、酶工程、生化工程、高分子化学、催化化学、医疗诊断、环境净化及能源生产等多个领域。因此，对生物微胶囊技术进行研究，其重要性不言而喻。
到目前为止，已经开发了一些可以把生物物质固定化的微囊体系，譬如由Lim和Sun于1980年发明的海藻酸钠/聚L-赖氨酸/海藻酸钠胶囊(APA胶囊)体系，但是APA胶囊是一种脆弱的多电解质复合体，其机械强度相对较差，而且聚L-赖氨酸的价格昂贵等，其它还有如甲基丙烯酸乙基酯/甲基丙烯酸甲酯(HEMA/MMA)以及海藻酸钙等体系，但是在其应用时受各种条件的影响，带来了许多不便。另一个重要的微胶囊体系是20世纪80年代发展起来的纤维素硫酸钠(NaCS)和聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDMDAAC))微胶囊，这是两种聚合物电解质，通过简单的制备方法可以制得由一层20-100mm多孔膜包围的中空的微胶囊体系，目前已经有一些成功的应用实例。上述的微胶囊体系是目前最有代表性的例子。这些体系均为双组分体系，所有的膜参数都与其中一种化合物有关，若优化其中一个参数，将会影响其它参数，这种不能独立调整胶囊参数(如机械强度或通透性)的性质严重限制了这些体系的实际应用。至今为止，尚未出现既具有良好的生物相容性和足够的机械强度，同时又能克服以上局限性的理想体系。
本世纪初曾出现过一种多组分的微胶囊体系，由海藻酸钠(SA)/纤维素硫酸钠(CS)-氯化钙(CaCl2)/聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)四组分构成的胶囊，但是文献没有报道其具体的制备过程，同时由于组成物质的不纯或组分搭配的不当，使得所得到的微胶囊对微生物等具有毒性，因此无法作为生物微胶囊用于细胞培养。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有生物相容性的SA/CS-CaCl2/PMCG微胶囊制备方法。
它的步骤如下1)将无水乙醇、异丙醇和丙酮等有机溶剂分别与PMCG水溶液以0.5∶1～3∶1的配比充分混合，静止25～80分钟，将混合液在4000～8000rpm下离心5～20min，收集沉淀，并用相应的有机溶剂洗涤2～4次，再将沉淀物进行冷冻干燥，以除掉残留的有机溶剂及其它小分子杂质，最后将沉淀物在真空干燥箱中于37～70℃下干燥24～72小时，得到除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)；2)将0.5％～4％的海藻酸钠(SA)与0.5％～5％的纤维素硫酸钠(CS)充分混合，两者的比例为0.2～5，该混合物即为本体系的聚阴离子溶液，将聚阴离子溶液通过注射器滴入0.5％～5％氯化钙溶液中进行固化，固化时间为5～80分钟，得到实心的预胶囊，用去离子水洗涤实心预胶囊，再将其转入1％～5％除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)溶液中反应，反应时间为3～35分钟，所得胶囊经后处理即可，后处理步骤如下用去离子水洗涤后，转入0.5M的柠檬酸钠溶液中放置5～30分钟，取出胶囊，再次用去离子水洗涤后，在0.9％氯化钠溶液中保存。
本发明的优点1)可独立调整膜参数；针对实际应用的不同要求，胶囊的特性参数，例如；胶囊尺寸，膜厚，机械强度和通透性，可以进行调整和优化；2)用提纯后的PMCG制备的多组分微胶囊的生物相容性明显改善，具有良好的生物相容性，适合于微生物的固定化培养。
3)在本发明条件下制备的微胶囊膜层很薄，而机械强度甚佳。
胶囊膜厚约为20～150mm，一般可承受3～7牛顿的正面压力，有的甚至可承受高达10牛顿的正面压力。这样的机械强度足可以抵抗生物反应器中由于搅拌而产生的剪切力，使胶囊不至于破损。
4)胶囊的化学性质稳定本发明的胶囊不被柠檬酸、磷酸等对钙离子有螯合作用的物质溶解，也不溶于大部分的有机溶剂(如乙醇、丙酮等)。对酸碱度变化也不明显。
5)制备条件温和，原料价格便宜，便于应用与推广。
图1是用提纯的PMCG和未提纯的PMCG制备的微胶囊固定化大肠杆菌培养与游离培养的比较示意图，图中○游离培养 ■固定化培养(提纯后PMCG)▲固定化培养(市售PMCG)图2是用提纯的PMCG和未提纯的PMCG制备的微胶囊固定化酿酒酵母培养与游离培养的比较示意图，图中○游离培养 ■固定化培养(提纯后PMCG)▲固定化培养(市售PMCG)具体实施方式
为了克服上述局限性，本发明在海藻酸钠(SA)/纤维素硫酸钠(CS)-氯化钙(CaCl2)/聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)微胶囊的基础上，分析了其中可能带入有毒物质的原因，开发了一套行之有效的提纯工艺，对具有严重毒性的成囊原料进行了纯化，并进行了组分间的合理搭配，不仅制得了具有较好生物相容性的微胶囊，用于微生物细胞的培养，而且由此制得的胶囊可以独立调整其参数，例如；胶囊尺寸、膜厚、机械强度和传递特性。针对实际应用的不同要求，胶囊的特性可以调整和优化。为达到上述目的，本发明采取下列步骤1)将无水乙醇、异丙醇和丙酮等有机溶剂分别与PMCG水溶液以0.5∶1～3∶1的配比充分混合，静止25～80分钟，将混合液在4000～8000rpm下离心5～20min，收集沉淀，并用相应的有机溶剂洗涤2～4次，再将沉淀物进行冷冻干燥，以除掉残留的有机溶剂及其它小分子杂质，最后将沉淀物在真空干燥箱中于37～70℃下干燥24～72小时；2)将0.5％～4％的海藻酸钠(SA)与0.5％～5％的纤维素硫酸钠(CS)充分混合，两者的比例为0.2～5，该混合物即为本体系的聚阴离子溶液，将聚阴离子溶液通过注射器滴入0.5％～5％氯化钙溶液中进行固化，固化时间为5～80分钟，得到实心的预胶囊，用去离子水洗涤预胶囊，再将其转入1％～5％的提纯后的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)溶液中反应，反应时间为3～35分钟，所得胶囊经后处理即可，后处理步骤如下用去离子水洗涤后，转入0.5M的柠檬酸钠溶液中放置5～30分钟，取出胶囊，再次用去离子水洗涤后，在0.9％氯化钠溶液中保存。
下面结合实例对本发明作详细说明1)将无水乙醇、异丙醇和丙酮与PMCG水溶液以1∶1～2.5∶1的配比充分混合，静止30～60分钟，将混合液在5000～7000rpm下离心10～15min，收集沉淀，并用相应的有机溶剂洗涤2～3次。再将沉淀物进行冷冻干燥，以除掉残留的有机溶剂及其它小分子杂质，最后将固体在真空干燥箱中于40～60℃下干燥30～48小时，备用。
2)将1.5％～3％的海藻酸钠(SA)与1.5％～4％的纤维素硫酸钠(CS)充分混合，两者的比例为0.4～3，该混合物即为本体系的聚阴离子溶液，将聚阴离子溶液通过注射器滴入2.5％～4％氯化钙溶液中进行固化，固化时间为10～40分钟，得到实心的预胶囊，用去离子水洗涤预胶囊，再将其转入1.5％～3％的提纯后的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)溶液中反应，反应时间为5～30分钟，所得胶囊经后处理即可，后处理步骤如下用去离子水洗涤后，转入0.5M的柠檬酸钠溶液中放置8～15分钟，取出胶囊，再次用去离子水洗涤后，在0.9％氯化钠溶液中保存。
本发明新型生物微胶囊的制备所用材料如下1)纤维素硫酸钠(CS)，由浙江大学生物工程研究所制备。
2)海藻酸钠(SA)，购自上海生化所。
3)聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)，购自美国Scientific Polymer Products公司，其它试剂如氯化钙等均为市售的分析纯试剂。
下面给出不同的实例来说明本发明实施例11)在常温下，将无水乙醇与PMCG水溶液以2∶1的配比充分混合，静止30分钟，将混合液在6000rpm下离心15min，收集沉淀，并用无水乙醇洗涤3次，再将沉淀物进行冷冻干燥，以除掉残留的乙醇及其它小分子杂质。最后将沉淀物在真空干燥箱中于50℃下干燥48小时，备用；2)将2％的海藻酸钠(SA)与3.5％的纤维素硫酸钠(CS)充分混合，两者的比例为1.5，该混合物即为本体系的聚阴离子溶液，将聚阴离子溶液通过注射器滴入3％氯化钙溶液中进行固化，固化时间为15分钟，得到实心的预胶囊，用去离子水洗涤预胶囊，再将其转入2％的提纯后的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)溶液中反应，反应时间为15分钟，所得胶囊经后处理后即可，后处理步骤如下用去离子水洗涤后，转入0.5M的柠檬酸钠溶液中放置10分钟，取出胶囊，再次用去离子水洗涤后，在0.9％氯化钠溶液中保存。
由此制得的胶囊平均粒径为2.5mm，机械强度约达7牛顿，膜厚约为100mm。
实施例21)将无水乙醇与PMCG水溶液以0.5∶1的配比充分混合，静止25分钟，将混合液在4000rpm下离心5min，收集沉淀，并用相应的有机溶剂洗涤2次，再将沉淀物进行冷冻干燥，以除掉残留的有机溶剂及其它小分子杂质，最后将沉淀物在真空干燥箱中于37℃下干燥24小时，得到除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)；2)将0.5％的海藻酸钠(SA)与0.5％的纤维素硫酸钠(CS)充分混合，两者的比例为0.2，该混合物即为本体系的聚阴离子溶液，将聚阴离子溶液通过注射器滴入0.5％氯化钙溶液中进行固化，固化时间为5分钟，得到实心的预胶囊，用去离子水洗涤实心预胶囊，再将其转入1％除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)溶液中反应，反应时间为3分钟，所得胶囊经后处理即可，后处理步骤如下用去离子水洗涤后，转入0.5M的柠檬酸钠溶液中放置5分钟，取出胶囊，再次用去离子水洗涤后，在0.9％氯化钠溶液中保存。
实施例31)将无水乙醇、异丙醇和丙酮等有机溶剂分别与PMCG水溶液以3∶1的配比充分混合，静止80分钟，将混合液在8000rpm下离心20min，收集沉淀，并用相应的有机溶剂洗涤4次，再将沉淀物进行冷冻干燥，以除掉残留的有机溶剂及其它小分子杂质，最后将沉淀物在真空干燥箱中于70℃下干燥72小时，得到除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)；2)将4％的海藻酸钠(SA)与5％的纤维素硫酸钠(CS)充分混合，两者的比例为5，该混合物即为本体系的聚阴离子溶液，将聚阴离子溶液通过注射器滴入5％氯化钙溶液中进行固化，固化时间为80分钟，得到实心的预胶囊，用去离子水洗涤实心预胶囊，再将其转入5％除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)溶液中反应，反应时间为35分钟，所得胶囊经后处理即可，后处理步骤如下用去离子水洗涤后，转入0.5M的柠檬酸钠溶液中放置30分钟，取出胶囊，再次用去离子水洗涤后，在0.9％氯化钠溶液中保存。
实施例41)将无水乙醇、异丙醇和丙酮等有机溶剂分别与PMCG水溶液以0.5∶1的配比充分混合，静止80分钟，将混合液在8000rpm下离心5min，收集沉淀，并用相应的有机溶剂洗涤3次，再将沉淀物进行冷冻干燥，以除掉残留的有机溶剂及其它小分子杂质，最后将沉淀物在真空干燥箱中于70℃下干燥24小时，得到除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)；2)将0.5％的海藻酸钠(SA)与5％的纤维素硫酸钠(CS)充分混合，两者的比例为5，该混合物即为本体系的聚阴离子溶液，将聚阴离子溶液通过注射器滴入0.5％氯化钙溶液中进行固化，固化时间为80分钟，得到实心的预胶囊，用去离子水洗涤实心预胶囊，再将其转入1％除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)溶液中反应，反应时间为35分钟，所得胶囊经后处理即可，后处理步骤如下用去离子水洗涤后，转入0.5M的柠檬酸钠溶液中放置30分钟，取出胶囊，再次用去离子水洗涤后，在0.9％氯化钠溶液中保存。
实施例51)将无水乙醇、异丙醇和丙酮等有机溶剂分别与PMCG水溶液以3∶1的配比充分混合，静止25分钟，将混合液在4000rpm下离心5min，收集沉淀，并用相应的有机溶剂洗涤4次，再将沉淀物进行冷冻干燥，以除掉残留的有机溶剂及其它小分子杂质，最后将沉淀物在真空干燥箱中于37℃下干燥72小时，得到除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)；2)将4％的海藻酸钠(SA)与0.5％的纤维素硫酸钠(CS)充分混合，两者的比例为0.2，该混合物即为本体系的聚阴离子溶液，将聚阴离子溶液通过注射器滴入5％氯化钙溶液中进行固化，固化时间为5分钟，得到实心的预胶囊，用去离子水洗涤实心预胶囊，再将其转入5％除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)溶液中反应，反应时间为3分钟，所得胶囊经后处理即可，后处理步骤如下用去离子水洗涤后，转入0.5M的柠檬酸钠溶液中放置5分钟，取出胶囊，再次用去离子水洗涤后，在0.9％氯化钠溶液中保存。
实施过程中实施条件对实验结果的影响如下1)提纯工艺中不同有机溶剂对PMCG提纯效果的影响实验中采用了无水乙醇、异丙醇和丙酮等多种有机溶剂，其中，乙醇的提纯效果最理想。若采用异丙醇或丙酮等其它有机溶剂，最终并不能完全去除PMCG中含有的杂质。具体表现在若用异丙醇或丙酮等有机溶剂提纯后的PMCG制备的胶囊进行固定化酿酒酵母等微生物培养，对微生物生长有明显的抑制作用。而用乙醇提纯后的PMCG制备的生物微胶囊进行微生物固定化培养时，微生物的生长与相应的游离培养过程类似。
2)原料PMCG的提纯工艺对微胶囊生物相容性的影响原料PMCG的提纯工艺是决定微胶囊生物相容性的至关重要的因素。若直接使用未经过提纯的PMCG制备该微胶囊，则所得微胶囊的生物相容性很差，具体表现在若用由未经过提纯的PMCG制备的微胶囊包埋诸如酿酒酵母、大肠杆菌等微生物进行固定化培养，这些微生物的生长受到严重抑制，几乎无法生长；而用提纯后的PMCG制备的生物微胶囊进行微生物固定化培养时，微生物的生长与相应的游离培养过程类似，说明该微胶囊具有很好的生物相容性。相应的实验结果分别见图1和图2。必须完整使用本提纯路线，才能最终获得性能良好的微胶囊。若仅用有机沉淀或冷冻干燥技术，无法使最终微胶囊具有良好的生物相容性。
3)纤维素硫酸钠(CS)的性质对胶囊外观及其制备过程的影响通过对不同取代度(DS)的纤维素硫酸钠(CS)(型号分别为A3、A4、A5、A6)的研究发现，在相同浓度下，取代度越大，其溶液粘度就越小，另外，CS溶液浓度的大小直接影响其溶液粘度的大小，而其溶液粘度大小是能否形成外观较好的微胶囊的决定性因素之一。若粘度过高，则球形度不好；反之，则胶囊膜达不到所需机械强度。最后选定的型号为A6纤维素硫酸钠作为本体系的原料，在较佳条件下，CS溶液的浓度为3.5％。
4)聚阴离子溶液的浓度及其组成聚阴离子溶液是由海藻酸钠(SA)与纤维素硫酸钠(CS)溶液组成，在较理想的组成中，两者的比例大约为1.5，聚阴离子溶液的总浓度为3％。增加SA的含量，致使胶囊机械强度降低，但胶囊的透明度及球形度会增加；相反，若增加CS的含量，对胶囊的透明度、球形度和光滑性有负面影响，但胶囊膜厚会增加，致使胶囊机械强度也相应增加。但CS的含量过高时，则又会导致机械强度的降低。实验结果表明，聚阴离子溶液中海藻酸钠(SA)与纤维素硫酸钠(CS)的较佳比例范围为0.4～3。
权利要求
1.一种具有生物相容性的SA/CS-CaCl2/PMCG微胶囊制备方法，其特征在于，它的步骤如下1)将无水乙醇、异丙醇和丙酮等有机溶剂分别与PMCG水溶液以0.5∶1~3∶1的配比充分混合，静止25～80分钟，将混合液在4000～8000rpm下离心5～20min，收集沉淀，并用相应的有机溶剂洗涤2～4次，再将沉淀物进行冷冻干燥，以除掉残留的有机溶剂及其它小分子杂质，最后将沉淀物在真空干燥箱中于37～70℃下干燥24～72小时，得到除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)；2)将0.5％～4％的海藻酸钠(SA)与0.5％～5％的纤维素硫酸钠(CS)充分混合，两者的比例为0.2～5，该混合物即为本体系的聚阴离子溶液，将聚阴离子溶液通过注射器滴入0.5％～5％氯化钙溶液中进行固化，固化时间为5～80分钟，得到实心的预胶囊，用去离子水洗涤实心预胶囊，再将其转入1％～5％除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)溶液中反应，反应时间为3～35分钟，所得胶囊经后处理即可，后处理步骤如下用去离子水洗涤后，转入0.5M的柠檬酸钠溶液中放置5～30分钟，取出胶囊，再次用去离子水洗涤后，在0.9％氯化钠溶液中保存。
2.根据权利要求1所述的具有生物相容性的SA/CS-CaCl2/PMCG微胶囊制备方法，其特征在于，它的步骤如下1)将无水乙醇、异丙醇和丙酮与PMCG水溶液以1∶1～2.5∶1的配比充分混合，静止30～60分钟，将混合液在5000～7000rpm下离心10～15min，收集沉淀，并用相应的有机溶剂洗涤2～3次，再将沉淀物进行冷冻干燥，以除掉残留的有机溶剂及其它小分子杂质，最后将沉淀物在真空干燥箱中于40～60℃下干燥30～48小时，得到除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)；2)将1.5％～3％的海藻酸钠(SA)与1.5％～4％的纤维素硫酸钠(CS)充分混合，两者的比例为0.4～3，该混合物即为本体系的聚阴离子溶液，将聚阴离子溶液通过注射器滴入2.5％～4％氯化钙溶液中进行固化，固化时间为10～40分钟，得到实心的预胶囊，用去离子水洗涤预胶囊，再将其转入1.5％～3％除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)溶液中反应，反应时间为5～30分钟，所得胶囊经后处理即可，后处理步骤如下用去离子水洗涤后，转入0.5M的柠檬酸钠溶液中放置8～15分钟，取出胶囊，再次用去离子水洗涤后，在0.9％氯化钠溶液中保存。
3.根据权利要求1或2所述的具有生物相容性的SA/CS-CaCl2/PMCG微胶囊制备方法，其特征在于，它的步骤如下1)将无水乙醇与PMCG水溶液以2∶1的配比充分混合，静止30分钟，将混合液在6000rpm下离心15min，收集沉淀，并用无水乙醇洗涤3次，再将沉淀物进行冷冻干燥，以除掉残留的乙醇及其它小分子杂质，最后将沉淀物在真空干燥箱中于50℃下干燥48小时，得到除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)；2)将2％的海藻酸钠(SA)与3.5％的纤维素硫酸钠(CS)充分混合，两者的比例为1.5，该混合物即为本体系的聚阴离子溶液，将聚阴离子溶液通过注射器滴入3％氯化钙溶液中进行固化，固化时间为15分钟，得到实心的预胶囊，用去离子水洗涤预胶囊，再将其转入2％除去小分子杂质的聚亚甲基二胍·氯化氢(PMCG)溶液中反应，反应时间为15分钟，所得胶囊经后处理后即可，后处理步骤如下用去离子水洗涤后，转入0.5M的柠檬酸钠溶液中放置10分钟，取出胶囊，再次用去离子水洗涤后，在0.9％氯化钠溶液中保存。
全文摘要
本发明公开了一种具有生物相容性的SA/CS－CaCl
文档编号C12N11/00GK1468657SQ0312915
公开日2004年1月21日 申请日期2003年6月4日 优先权日2003年6月4日
发明者姚善泾, 张立央, 关怡新 申请人:浙江大学