专利名称：一种用于增强乙肝疫苗免疫效应的佐剂及制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于增强乙肝核酸疫苗免疫效应的佐剂及制备方法。
背景技术：
乙型病毒性肝炎(Viral hepatitis B)是目前危害我国人民身体健康最为严重的感染性疾病。据调查，我国慢性乙肝病毒感染者多达1.2亿以上，其中慢性乙肝患者达2000万以上。携带者及慢性肝炎患者中部分病例可发展为重症肝炎、肝硬化甚至肝癌，每年死于肝炎及其相关性疾病的患者不下30万例。据估算，每年因为肝炎及其相关性疾病导致的经济支出高达300-500亿元。乙肝病毒感染至今尚无特效治疗方法。目前临床上应用的慢性乙肝治疗药物均存在疗效不尽如人意、副作用多等多方面的缺陷，远不能满足乙肝病毒感染防治的需要，这给乙肝的防治带来了巨大困难。因此，开发高效的抗乙肝病毒药物，具有迫切的临床需要。
核酸疫苗及治疗性核酸疫苗是国际上20世纪90年代以后发展起来的新兴生物技术，在预防和治疗慢性乙肝病毒感染方面具有广阔的发展前景。
乙肝治疗性核酸疫苗与传统药物相比具有以下优越性(1)传统药物仅能可逆性地降低HBV DNA复制水平，部分清除HBeAg，而对清除HBsAg基本无效；从理论上讲，治疗性核酸疫苗可望发展为HBV感染的根治药物，不但能清除HBV基因表达产物(HBsAg、HBeAg)，而且可以大幅度降低或清除HBV DNA，使治疗更为完全、彻底。(2)Davis、Hui等通过转基因小鼠动物模型研究发现，治疗性核酸疫苗应用过程中不会导致肝功能指标的升高，不引起肝脏病理损害，这一特点也明显优越于现有的抗病毒药物。(3)乙肝治疗性核酸疫苗表达载体为质粒载体，无病毒性载体的安全性顾虑，疫苗接种方法简单、易行，可重复注射，目的基因表达持续时间不长，但足以介导良好的免疫应答，且目的基因不需要精确调控。(4)由于治疗对象均为HBV感染者，且目的基因片段并不含有完整的病毒颗粒，在机体染色体DNA上随机整合率低、应用较为安全。
目前乙肝核酸疫苗研发中遇到的主要问题是免疫效果还不能满足临床需要，国内外相关机构正在进行多方面的改进和完善，有关研究主要集中在以下方面1.目的基因片段的选择多项研究显示，HBV S基因为诱导HBsAg特异性CTL活性所必需，而preS1或preS2基因的加入可增强机体的免疫应答。Davis等在HBV基因疫苗诱导CTL活性的研究中发现，基因疫苗可十分有效地诱导HBV特异性CTL应答，从而为开发新型乙肝治疗性核酸疫苗提供了强有力的理论依据。Davis等在随后的研究中采用包含HBV DNA S及preS2基因的质粒pCMV-S2S免疫HBsAg转基因小鼠，观察到部分小鼠早在DNA疫苗注射后2周，血清HBsAg即消失，不经加强注射持续至12周以上，而另外一些小鼠，HBsAg水平明显下降且维持在较低水平。同时，血清中抗HBs产生。所有小鼠均未见肝脏出现明显的坏死及炎症病理变化。Hui等构建了包含HBV S基因及preS121-47位多肽编码基因的重组质粒pCMV-SS1，用于免疫HBsAg转基因小鼠，结果发现pCMV-SS1给药导致80％的转基因小鼠循环中HBsAg的清除或水平明显下降(下降至用药前的1/1000水平)，明显高于pCMV-S(40％)，而空载质粒无效，非空载质粒给药组均观察到较高的抗HBs水平，而pCMV-SS1质粒组还观察到抗preS1的产生。这亦为核酸疫苗清除慢性乙肝病毒感染提供了强有力的实验依据。采用HBe/cAg抗原编码基因片段构建核酸疫苗的研究亦见诸报道，但Matti等的研究表明，包含HBe/cAg基因的表达质粒并无清除HBV慢性感染大猩猩体内病毒的作用。目前国内外已经采用的乙肝核酸疫苗基因片段及组合方式主要有S基因、S+preS121-47位多肽编码基因、preS2S、C、SC、preS1preS2S等基因片段，相关专利如下
表1 乙肝核酸疫苗基因片段选择相关专利专利号申请日期发明人 基因片段 载体1 US05024938 1991.07.18 Nozaki，et al.(SC)3PSHB32 US06025341 2000.02.15 Jack R，et al.S1/S2/S+HCV corepcDNA33 WO00016802 2000.03.20 Shan LU，et alC(35nts deleted) PJW43034 CN1108306 1995.09.13李光地 SS1V.V5 CN175585A 1998.03.13李光地 C(AA1-144)(AA1-44/69) pcDNA36 CN1209340A 1999.03.03饶伟华 S1/S2/S7 CN1316518A 2000.06.19陈光明 S2S+GM-CSF/IL-2 IFN-γ pcDNA3.18 CN1324661A 2001.05.23孙树汉 S2S+CpG pVAX2.表达载体的选择和载体构建方法核酸疫苗常以高效哺乳动物细胞表达质粒为载体或采用逆转录病毒载体。质粒载体必须是能在大肠杆菌中高拷贝扩增，哺乳动物细胞内高效表达，而不能复制，同时也不含有在宿主细胞基因中整合的序列。目前常用于构建核酸疫苗的表达质粒主要包括(1)pcDNA3Invitrogen公司开发的商品化质粒载体，是常用的克隆与表达目的基因载体，含CMV立即早期启动子、多克隆位点及牛生长激素多聚腺苷酸信号序列，采用新霉素抗性基因进行抗性筛选。
(2)pVAX1Invitrogen公司开发的商品化质粒载体，为FDA批准唯一用于核酸疫苗的表达载体，含CMV和T7启动子、BGH多腺苷酸信号尾和Kan抗性基因。
(2)pRC/CMVClontech公司开发的商品化质粒载体，广泛用于研究，含CMV立即早期启动子，外源基因有较高的表达效率，注射后可产生较高的体液免疫及细胞免疫应答。
(3)pCIPromega公司开发的商品化质粒载体，含CMV立即早期启动子、多克隆位点、SV40晚期多聚腺苷酸信号序列及能够提高目的基因表达水平的嵌合型内含子。
载体的选择和构建方法对于提高核酸疫苗的免疫效应至关重要。其影响因素主要包括(1)目的基因片段的优化和连接方法核酸疫苗本身不带目的基因的蛋白合成系统，完全依赖于宿主细胞调控。将外源基因优化为宿主细胞偏好的密码子，可改善目的蛋白的合成，从而增强免疫效果。对于多个片段组成的共表达形式，各个片段之间的连接方式亦非常重要。目前大多数学者主张采用Gly4Ser1编码基因的2-4次重复序列作为不同基因片段之间的连接序列，以利于蛋白质更好地表达及生物学活性的稳定。此外，目的基因转录翻译起始区应含有核糖体结合位点，以提高基因转录和蛋白质的表达效率。
(2)外源基因转录启动子/增强子序列一类是致病性的病毒启动子，在多数哺乳动物细胞中具有较高水平的转录起始能力，目前认为hCMV启动子较SV40及MPSV启动子能更好地发挥作用。另一类是哺乳动物启动子，适合在人体或动物中使用，如来自哺乳动物的MHC I启动子/增强子BL3-60prmtr(Harms JS，et al.Braz J Med Biol Res1999，32155-62)，人肌肉特异性肌酸激酶启动子(Baztlett et al.，1996)；鼠金属硫蛋白基因启动子、免-β心肌重链及轻链1/3增强子；β-actin启动子与CMV增强子合用等(Niwa et al.，1991)。
(3)内含子序列载体中插入的内含子序列有利于抗原的高效表达，可能因为RNA聚腺苷酸化和/或核转录连接的RNA剪切速率提高的缘故。Brinster等研究表明，内含子可提高转基因鼠的外源基因转录效率10-100倍。内含子序列位于抗原基因编码区的上游才能较好地促进外源基因的表达，增强免疫应答。目前已有载体本身包含了能增强外源基因转录翻译的内含子序列，如pCI载体中含有嵌合型内含子序列。
(4)聚腺苷酸化(poly A)信号聚腺苷酸化信号序列定位于多克隆位点的下游，可提高转录RNA的稳定性及翻译效率，促进目的基因的有效加工。核酸疫苗载体中聚腺苷酸化终止序列常来源于牛生长激素或晚期SV40聚腺苷酸化信号，如pcDNA3.1mychis(BGH、SV40)、pCI(SV40)、VR1012(BGH)、pVAX1(BGH)等。
(5)其它免疫增强序列
Sato等报道，含Amp抗性基因的载体免疫应答较含Kan抗性基因的载体强，原因可能是Amp抗性基因中含有两个免疫刺激序列(ISS，5’-AACGTT-3’)，而Kan抗性基因中不存在ISS。
3.核酸疫苗的给药途径核酸疫苗的免疫途径有多种(见表2)，主要包括肌肉注射、基因抢接种、粘膜接种、静脉注射4种。肌肉注射仍是使用最广、效果较肯定的一种方式；粘膜免疫的优势在于较好地诱生分泌性IgA抗体；基因枪接种诱生的血清抗体水平最高，而细胞免疫应答略嫌不足；静脉注射易扩散至淋巴结甚至骨髓处，有可能转染分裂活跃的干细胞而导致细胞恶变，故难以应用到临床。因此根据核酸疫苗的类型和用途，采用相应的接种措施，才有可能取得最佳的免疫防护效果。
核酸疫苗进入机体后，能被机体细胞摄入并表达的外源基因终究是少数。近年来相继开发出了多种新型DNA导入方法。如基因枪技术(Yang Ns，et al.，1980)、阳离子脂质体(Gregoriadis et al.，1997)、Cochleate包被(Mannino RJ et al.，1997)、可降解微粒包裹(Jone et al.，1997)、某些细菌减毒株(Darji A et al.，1997)等。国外近年来开发的一些给药系统专利产品见表3。
表2核酸疫苗相关的免疫途径注射途径 报道作者肌肉注射Davis，et al.，1996皮下注射Yokeyama，et al.，1996；Liu et al.，1997皮内注射Gramzinski，et al.，1993；Condon et al.，1996腹腔注射Fynan et al.，1993静脉注射Fynan et al.，1993；Zhang GF，et al.，1999动脉注射Nabel，et al.，1993口腔粘膜Jones DH，et al.，1997；Chen SC.，et al.，1998鼻腔粘膜Fynan EF，et al.，1993；Sasaki S，et al.，1998支气管粘膜 Tsan MF，et al.，1995；Meyer KB，et al.，1995生殖道粘膜 Wang B，et al.，1997；Livingston JB，et al.，1998颊内注射Etchart et al.，1997；Hinkula et al.，1997乳腺内注射 Furth et al.，1992
表3 国外开发的给药系统专利产品给药系统 开发/或专利拥有公司1.PowderJect system PowderJect vaccines Inc(Oxford，London and Madison，Wisconsin)2.Lipoplex-Biovector system BITVECTOR THERAPEUTICS SA(France)3.Biojector 2000jet Bioject Medical Technologies Incinjection delivery system (Vical，U.S.A)4.GeneswitchGene Medicine Inc(U.S.A)5.Bacfotection Institute of Human Virology(IVH，U.S.A)4.佐剂在核酸疫苗中的应用业已发现多种细胞因子具有免疫佐剂作用，可调节免疫应答的强度和方向。IL-2、IL-12及β趋化因子TCA3等以增强TH1型细胞免疫为主，对体液免疫促进作用较弱。IL-4、GM-CSF能明显加强体液免疫，导致抗体升高。其中IL-12在TH0向TH1的分化中起关键性作用，而IL-4能明显促进TH1向TH0转化。
近年来还发现多种具有免疫调节作用的分子，如Ross等报道C3d能提高核酸疫苗抗体应答的水平；Endresz V等观察到IFNα能使抗体水平中等度升高。Shiau等的研究表明胸腺素α1表达质粒与伪狂犬病毒糖蛋白的口服核酸疫苗联用，能显著增强后者的细胞免疫应答等。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种提高乙肝核酸疫苗特异性免疫应答的新型分子佐剂。
本发明公开的增强乙肝核酸疫苗效应的的佐剂为含有胸腺素α1(TA1)和干扰素α8(IFNα8)融合基因片段载体的制剂，该载体是通过将胸腺素α1和干扰素α8融合基因片段连接到各种非复制型哺乳动物细胞高效表达载体中，大量扩增纯化后获得的。
本发明所述的胸腺素α1和干扰素α8融合基因片段组合为TA1+linker+IFNα8，该序列全长为633bp(碱基序列见序列5，氨基酸序列见序列6)；其中TA1基因87bp为人工合成；连接部位linker为[(GGT)4TCT]n，n＝2-4，其编码aa为(Gly4Ser1)；下游IFNα序列与IFNα8完全一致，不含起始密码子，长501bp，起始密码子前3位为ACC，来自于中国健康成人的外周血白细胞。
本发明所述的制剂剂型包括生理上可以接受的液体制剂、乳液制剂、冻干制剂或胶体金颗粒包被等。
本发明所述的非复制型哺乳动物细胞高效表达载体为pcDNA系列、pRc/CMV、pCI或pVAX1等。
本发明所述解决的另一技术问题是公开上述增强乙肝疫苗免疫效应佐剂的制备方法。
本发明公开的含有胸腺素α1和干扰素α8融合基因片段载体的制剂(含TA1-IFNα8的佐剂)的制备方法包括下述步骤(1)IFNα基因的扩增从正常人外周血白细胞中获得IFNα，设计引物PF1(序列1)、PB1(序列2)，通过RT-PCR，逆转录并扩增IFNα基因片段，切胶回收备用；(2)IFNα基因与pGEM-T载体的连接将IFNα基因插入pGEM-T载体后测序证实；(3)TA1与IFNα基因的连接在IFNα基因的上游(除去起始密码子)，人工合成TA1的全部87个碱基(无终止密码子)以及连接部分[(GGT)4TCT]n，获得到融合基因TA1-IFNα片段；(4)TA1-IFNα表达质粒的构建将TA1-IFNα(简称TI)通过双酶切位点(Kpn I、Not I)连接到非复制型哺乳动物细胞高效表达载体中，获得表达质粒；(5)TA1-IFNα表达质粒的大规模生产将重组质粒及空载质粒转化感受态JM109，经大量扩增纯化、双酶切鉴定、紫外分光光度计定量后，无菌生理盐水稀释，即得乙肝核酸疫苗增效分子佐剂，分装后置-80℃冰箱保存。
本发明所要解决的再一技术问题是公开上述TA1-IFNα8佐剂在制备乙肝病毒免疫治疗药物及增强乙肝核酸疫苗免疫效应中的应用。
本发明佐剂单独应用具有针对乙肝病毒的免疫治疗作用；与现有的乙肝核酸疫苗联合应用，能增强后者的免疫预防和治疗效果。
本发明所述预防人群为经检测未受HBV感染群体或经常规HBV疫苗注射后无免疫应答的个体。所述治疗人群为HBV持续感染者包括HBV携带者、各种慢性乙肝患者、乙肝肝硬化及乙肝后肝癌而HBV DNA复制活跃者、HBV DNA呈整合状态者等。
所述的佐剂可采用一定的制剂形式如冻干、粉针、胶体金颗粒包被等，和乙肝核酸疫苗联合，通过相应的给药途径(肌肉、皮下注射，腹腔注射，口、鼻粘膜给药等)施用于生物体(人类，灵长类动物，大、小鼠等)，用于慢性乙肝病毒感染的预防与治疗。
本发明所述乙肝核酸疫苗系指HBV前S1、前S2、S、前C、C、P、X等基因或其各种组合的表达质粒。
用本发明分子佐剂TA1-IFNα表达质粒对核酸疫苗pVAX1-S2S接种小鼠后免疫效应的影响进行试验一.实验方法1.实验动物及分组健康雌性BALB/c(H-2d)小鼠(上海西浦尔-必凯公司)，6-8周龄，体重18-20g，清洁级，标准化环境饲养。
随机分组如下实验组①pVAX1-S2S+pVAX1-TI②pVAX1-S2S空白对照生理盐水阴性对照pVAX12.接种方式双侧胫前肌注射，总量100μg/只/次；2、4周后各加强接种1次。
空白对照组接种100μl生理盐水/只/次3.免疫应答的检测
(1)接种部位的抗原表达乙肝核酸疫苗接种后第10天，处死部分小鼠，取接种部位肌肉组织，中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，制作单个组织蜡快。
将同批组织制成组织芯片，采用常规切片，免疫细胞化学技术检测接种部位肌肉组织的preS2Ag、HBsAg表达。I抗分别采用抗前S2单抗、抗HBs单抗。DAB显色。
(2)小鼠血清特异性抗体初次接种后3周、5周、8周、12周，采集小鼠眶静脉血，检测前S2抗体、抗-HBs。
试剂分别采用乙肝前S2抗体检测试剂盒(北医大肝炎试剂中心)、乙肝表面抗体检测试剂盒(华美)。
二.实验结果(一)接种部位的抗原表达常规免疫细胞化学方法检测显示实验组的S基因均得到高效表达，而前S2抗原表达较弱。对照组检测结果均为阴性。
(二)血清特异性抗体1.前S2抗体S2S核酸疫苗组的抗体阳转率达到66.7％，与TA1-IFNα表达质粒联合免疫组的抗体阳转率为50％，二者间差异不明显。S2S组的前S2抗体最高滴度仅1∶10；而联合免疫组达到1∶50以上。对照组血清前S2抗体检测全部阴性。
2.抗-HBsS2S组和联合免疫组的抗体阳转率均为50％；抗体最高滴度均为1∶50。对照组血清抗HBs检测全部阴性。
三.结论小鼠接种乙肝核酸疫苗后10天，接种部位出现目的抗原的表达。
联合免疫组和S2S组均诱生出前S2抗体。抗体阳转率差异不大，但抗体最高水平是S2S组的5倍以上。显示TA1-IFNα表达质粒能够增强核酸疫苗pVAX1-S2S的前S2抗体应答，这对于乙肝的预防和治疗具有重要意义。
联合免疫组和S2S组的抗-HBs诱生能力无明显差异。
用本发明TA1-IFNα表达质粒对HBV DNA转基因C57BL/6(H-2b)小鼠的治疗作用进行试验一.实验方法1.实验动物HBV DNA转基因C57BL/6(H-2b)小鼠，雌雄各半，3-5月龄，体重25-30g，SPF级，SPF标准环境下饲养。
2.动物分组实验组pVAX1-TI 对照组pVAX13.接种方式与BALB/c小鼠相同4.免疫效应的检测(1)血清HBV DNA水平采用HBV DNA定量PCR检测试剂盒，按说明书操作。
(2)肝组织中的抗原表达接种前3天和接种后3周、5周、8周，分别用1％戊巴比妥钠50mg/Kg体重腹腔内麻醉C57BL/6小鼠，无菌手术剖腹，切取0.5×0.5CM2大小的肝组织，中性福尔马林固定。手术后关闭腹腔继续观察饲养。同批小鼠肝组织制成组织芯片，常规切片及免疫细胞化学技术检测HBsAg、HBcAg。
二.实验结果1.肝组织中的抗原表达实验组接种前，小鼠肝组织均存在HBsAg及HBcAg的表达并主要分布于细胞浆内。接种后第5～8周时，抗原表达呈减弱趋势，部分小鼠抗原表达甚至完全消失。
与此同时，对照组小鼠肝组织中的上述抗原表达在接种前和接种后第5、8周比较无明显变化。
2.血清HBV DNA定量实验组小鼠血清HBV DNA水平似呈逐次降低的趋向；对照组的血清HBV DNA水平无明显变化。
三.结论转基因小鼠接种TA1-IFNα表达质粒后，HBV DNA水平有逐次降低的趋向，肝组织中HBsAg和HBcAg表达呈减弱趋势甚至完全消失。从而为HBV慢性感染者的治疗提供强有力的理论依据。
本发明实验中所使用的核酸疫苗pVAX1-S2S为本发明人在另一中国专利申请中公开的新型乙肝病毒感染的核酸疫苗。大部分乙肝核酸疫苗所使用的编码基因来源于前S/S区和C区，前S/S区的基因天然组合方式有S、preS2/S、preS1/preS2/S三种，分别编码乙肝病毒外膜抗原的主蛋白、中蛋白和大蛋白。本发明人采用了preS2/S方式，原因在于1)前S2与乙肝病毒的感染性、免疫逃避、宿主细胞核内整合等具有相关性。2)前S2、S抗原的免疫应答由不同的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)位点支配，用前S2抗原免疫可克服对S抗原的无应答性。因此采用preS2S基因片段的乙肝核酸疫苗从理论上讲具有更好的预防及治疗效应。本发明实施例中对该疫苗的制备有详细的描述。
上述试验结果证实本发明含有胸腺素α1和干扰素α8融合基因片段载体的制剂是效果确切的增强乙肝核酸疫苗效应的的佐剂。
图1 IFNα片断(PCR产物)电泳图其中1为IFNα的PCR产物；M为GeneRulerTM100bp DNA Ladder图2 重组质粒pVAX1-TI的构建示意3 pVAX1-TI测序图谱
具体实施例方式实施例1分子佐剂TA1-IFNα表达质粒的构建(见图2)1.IFNα基因的扩增离心收集健康成人的外周血细胞，加入红细胞裂解液(Qiagen)混匀，冰上放置10-15min；4℃ 400rpm离心10min。沉淀中加入白细胞裂解液震摇混匀，移入RNA吸附柱中，经反复洗涤后，加入50ul去RNA酶的纯水(经DEPC预处理)，8000g离心1min洗脱。洗脱液中含有白细胞总RNA，其中包括IFNα的mRNA。采用引物PF1、PB1，通过RT-PCR，逆转录并扩增IFNα基因片段，切胶回收备用。IFNα片断PCR产物电泳图见图1。
2.IFNα基因与pGEM-T Vector的连接取IFNα2ul，加入适量的pGEM-T Vector和T4 DNA连接酶混匀，室温连接1h。转化感受态菌JM109，并涂布于LB/Ap抗性平板(表面预先涂布IPTG/X-gal)，37℃培养过夜。挑取白色菌落转小样培养，提取重组质粒进行Not I酶切鉴定，经初步确认有目的基因插入的质粒送交测序。
3.TA1与IFNα基因的连接在IFNα基因的上游(除去起始密码子)，人工合成TA1的全部87个碱基(无终止密码子)以及连接部分[(GGT)4TCT]3，获得到融合基因TA1-IFNα片段。
4.TA1-IFNα表达质粒的构建将TA1-IFNα(简称TI)通过双酶切位点(Kpn I、Not I)连接到pVAX1载体中，获得表达质粒pVAX1-TI。
序列分析证实TI全长633bp，其中TA1基因87bp，连接部位[(GGT)4TCT]3；下游IFNα序列与IFNα8完全一致，不含起始密码子，长501bp。起始密码子前3位为ACC，符合Kozak序列的要求。测序图谱见图3。
实施例2 分子佐剂TA1-IFNα表达质粒的大量制备方法将实施例1获得的重组质粒质粒pVAX1-TI及空载质粒转化感受态JM109，涂布LB平板(Amp或Kan抗性)孵育过夜；挑取单一菌落大量扩增，应用Qiagen Mega Endofree纯化系统，按说明书操作获得高纯度的质粒超螺旋部分不少于2/3，无RNA及蛋白质残留，无内毒素污染。经双酶切鉴定、紫外分光光度计定量后，无菌生理盐水稀释成1ug/ul，即为乙肝核酸疫苗或分子佐剂。分装后置-80℃冰箱保存。
实施例3核酸疫苗pVAX1-S2S的制备一、乙肝病毒基因片段preS2S的扩增1.HBV DNA模板的制备(1)标本来源慢性乙肝病毒感染者混合血清，由四川大学华西医院病毒性肝炎研究室提供。HBsAg(+)，抗HBc(+)，HBV DNA载量在105～109copies/mL之间。
(2)制备方法取上述血清200μl，加入含200μg/mL蛋白酶K的(临用时加)TNES(10mmol/L Tris.Cl PH8.0，150mmol/L NaCl，25mmol/L EDTAPH8.0，1％SDS(W/V))混匀，孵育4小时；再加入等体积酚充分混匀，10000r/min离心10分钟；取上清，加入等体积氯仿/异戊醇混匀，10000r/min离心10分钟；弃上清，沉淀中加入200μl 70％乙醇洗涤，12000r/min离心5分钟；去上清，沉淀晾干，溶于30ul TE中。
2.preS2S基因的扩增根据GenBank中已经报道的中国患者HBV感染主要型别(基因型B、C)基因序列设计通用引物，委托宝生物工程(大连)有限公司合成(PAGE纯化)，用纯水溶解稀释为10μmol/L浓度，分装贮存于-20℃。
取HBV模板5μl、dNTPmix200μmol/L、pyrobest polymerase0.5U/50μl及引物PF2(序列3)、PB2(序列4)进行PCR扩增。循环参数设置为预变性94℃5min；94℃45sec，55℃ 45sec，72℃45sec，循环35次；72℃延伸10min。反应结束后，取PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，切胶回收分子量约为870bp的目的条带(preS2S)，按Qiagen胶回收试剂盒说明书操作。最后用50μl纯水洗脱备用。
二、动物细胞表达载体核酸疫苗pVAX1-S2S的构建1.目的基因片段S2S与载体pVAX1的双酶切及连接Kpn I、Not I双酶切pVAX1质粒载体和DNA插入片段，37℃4h。分离纯化酶切后的载体和DNA插入片段，取插入片段4μl、载体(1∶5～20稀释)1μl混匀，加入等体积的sol I(Takara)，16℃保温1h或连接过夜。
2.连接产物转化感受态JM109及重组子筛选在连接反应的产物中，加入5mol/L NaCl至终浓度150mmol/L，再与新鲜制备的感受态菌JM109 60～80μl混匀，冰浴30min；37℃2min；立即冰浴2min。加入SOC培养基500μl混匀，37℃250rpm震摇1h。取200μl转化菌液，涂布于LB/Amp抗性平板上，37℃培养过夜。
3.重组质粒的筛选从LB/Amp抗性平板中央挑取15个菌落，分别置于5ml LB(含Amp100μg/mL)液体培养基中，37℃250rpm震摇8～16h。小样提取质粒，取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，以空载质粒为对照。如重组质粒分子量大于空载质粒，继续用Kpn I和Not I双酶切鉴定。当酶切后的载体和插入片段分子量大小与预期值相符时，继续测序分析。
经多克隆测序证实，得到了核酸疫苗哺乳动物细胞表达载体pVAX1-S2S质粒。
序列分析证实，pVAX1-S2S表达载体的S2S片段长度为846bp，根据S基因序列确定为基因型B、血清亚型adw2。起始密码子ATG上游为ACC，符合哺乳动物细胞表达载体Kozak序列的要求。
三、核酸疫苗pVAX1-S2S表达质粒的大量制备方法将重组质粒pVAX1-S2S及空载质粒转化感受态JM109，涂布LB平板(Amp或Kan抗性)孵育过夜；挑取单一菌落大量扩增，应用QiagenMega Endofree纯化系统，按说明书操作获得高纯度的质粒超螺旋部分不少于2/3，无RNA及蛋白质残留，无内毒素污染。经双酶切鉴定、紫外分光光度计定量后，无菌生理盐水稀释成1ug/ul，即为乙肝核酸疫苗或分子佐剂。分装后置-80℃冰箱保存。
实施例4 pVAX1-S2S细胞转染及表达检测1.SP2/0细胞的传代培养及G418最低完全致死量测定
SP2/0细胞来源于BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系，培养液为RPMI 1640完全培养基。临用前加入20％FBS、L-谷氨酰胺2mmol/L、青霉素200u/mL、链霉素200u/mL、HEPES 25mmol/L、0.15％NaHCO3，调节pH至7.4。培养条件为37℃，5％CO2，95％相对湿度。每3-5d传代1次。
经采用MTT分析法，得出SP2/0细胞的G418最低完全致死量为400μg/mL。
2.重组质粒转染SP2/0细胞采用磷酸钙法，将重组质粒pVAX1-S2S及空载体稳定转染SP2/0细胞，共转染质粒采用pSV2-neo。
转染细胞经含G418抗性培养基持续作用约2周后，存活细胞采用有限稀释法，分离出单克隆细胞并继续培养并鉴定。
3.RT-PCR检测目的基因转录的mRNA转染细胞用PBS洗涤后，加入1mL Trizol混匀并静置5min。加入等体积氯仿混匀，室温放置2～3min；4℃12000g离心15min后取上清，加入等体积异丙醇混匀，室温静置10min；4℃12000g离心10min，沉淀用75％乙醇洗涤后晾干，加入DEPC处理水20μl溶解。此为转染细胞的总RNA，采用特异性的引物，通过RT-PCR扩增目的基因片段S2S，PCR产物电泳观察有无目的条带出现。
结果3种不同载体重组质粒转染SP2/0细胞，得到的克隆细胞株提取总RNA，RT-PCR分别扩增出与S2S分子量相符的DNA条带，而空载质粒转染细胞则为阴性。
4.ELISA检测HBsAg表达经RT-PCR证实存在目的基因转录的细胞株，收集细胞并加入适量的细胞裂解液，用20gauge注射器针头反复抽打至无粘液丝出现，冰上放置10min；4℃12000g离心10min。取上清，采用HBsAg的ELISA检测试剂盒，检测单克隆细胞株是否表达目的抗原蛋白。
结果提示3种不同载体重组质粒转染SP2/0细胞均获得了S2S检测阳性细胞株。
5.Western blot检测取ELISA检测结果阳性的细胞株裂解蛋白，进行SDS-PAGE电泳，以空载质粒转染细胞为阴性对照，以乙肝携带者血清(HBsAg阳性)为阳性对照。电泳结束后，将凝胶蛋白质电转移至PVDF膜，室温封闭1h。加入相应的I抗(HBs单抗1∶200；前S2单抗1∶100)，4℃过夜。经洗膜后再加入II抗(羊抗鼠IgG-AP，1∶1000)，室温3h；最后用NBT/BCIP显色。
结果ELISA检测HBsAg阳性株，经Western blot鉴定，表达的S2S蛋白呈约33KD大小条带，分子量与预期相符。
序列表<110>成都地奥 集团药物研究所<120>一种用于增强乙肝疫苗免疫效应的佐剂及制备方法<130>说明书、权利要求书<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>引物PF1<400>1tgtgatctgc ctcagactca c 21<210>2<211>20<212>DNA<213>引物PB1<400>2ttattcctta ctcttcaatc20
<210>3<211>36<212>DNA<213>引物PF2<400>3gcgggtacca tgcagtggaa ctccacaaca ttccac 36<210>4<211>38<212>DNA<213>引物PB2<400>4ggggcggccg cttaaatgta tacccaaaga caaaagaa 38<210>5<211>633<212>DNA<213>TA1-IFNα碱基序列<400>5atgagcgacg ccgccgtgga caccagcagc gagatcacca ccaaggacct gaaggagaag 60aaggaggtgg tggaggaggc cgagaacggt ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctggt 120ggtggtggtt cttgtgatct gcctcagact cacagcctgg gtaacaggag ggccttgata 180ctcctggcac aaatgcgaag aatctctcct ttctcctgcc tgaaggacag acatgacttt 240gaattccccc aggaggagtt tgatgataaa cagttccaga aggctcaagc catctctgtc 300ctccatgaga tgatccagca gaccttcaac ctcttcagca caaaggactc atctgctgct 360ttggatgaga cccttctaga tgaattctac atcgaacttg accagcagct gaatgacctg 420gagtcctgtg tgatgcagga agtgggggtg atagagtctc ccctgatgta cgaggactcc 480
atcctggctg tgaggaaata cttccaaaga atcactctat atctgacaga gaagaaatac540agctcttgtg cctgggaggt tgtcagagca gaaatcatga gatccttctc tttatcaatc600aacttgcaaa aaagattgaa gagtaaggaa tga 633<210>6<211>210<212>PRT<213>TA1-IFNα编码氨基酸序列<400>6Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp15 10 15Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Gly Gly20 25 30Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asp Leu Pro35 40 45Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln50 55 60Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe65 70 75 80Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala Gln85 90 95Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe100 105 110
Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu115 120 125Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ser Cys Val130 135 140Met Gln Glu Val Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser145 150 155 160Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr165 170 175Glu Lys Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile180 185 190Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys Arg Leu Lys Ser195 200 205Lys Glu stop210
权利要求
1.一种用于增强乙肝疫苗免疫效应的佐剂，其特征在于该佐剂为含有胸腺素α1和干扰素α8融合基因片段载体的制剂。
2.根据权利要求1所述的佐剂，其特征在于其中所述的载体是通过将胸腺素α1和干扰素α8融合基因片段连接到各种非复制型哺乳动物细胞高效表达载体中，大量扩增纯化后获得的。
3.根据权利要求1或2所述的佐剂，其特征在于其中所述的胸腺素α1和干扰素α8融合基因片段组合为TA1+linker+IFNα8，该序列全长为633bp，具有下述碱基序列和氨基酸序列1)TA1-IFNα碱基序列atgagcgacg ccgccgtgga caccagcagc gagatcacca ccaaggacct gaaggagaag60aaggaggtgg tggaggaggc cgagaacggt ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctggt 120ggtggtggtt cttgtgatct gcctcagact cacagcctgg gtaacaggag ggccttgata 180ctcctggcac aaatgcgaag aatctctcct ttctcctgcc tgaaggacag acatgacttt 240gaattccccc aggaggagtt tgatgataaa cagttccaga aggctcaagc catctctgtc 300ctccatgaga tgatccagca gaccttcaac ctcttcagca caaaggactc atctgctgct 360ttggatgaga cccttctaga tgaattctac atcgaacttg accagcagct gaatgacctg 420gagtcctgtg tgatgcagga agtgggggtg atagagtctc ccctgatgta cgaggactcc 480atcctggctg tgaggaaata cttccaaaga atcactctat atctgacaga gaagaaatac 540agctcttgtg cctgggaggt tgtcagagca gaaatcatga gatccttctc tttatcaatc 600aacttgcaaa aaagattgaa gagtaaggaa tga6332)TA1-IFN α编码氨基酸序列Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp1 5 10 15Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Gly Gly20 25 30Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asp Leu Pro35 40 45Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln50 55 60Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe65 70 75 80Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gln Phe Gln Lys Ala Gln85 90 95Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe100 105 110Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu115 120 125Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ser Cys Val130 135 140Met Gln Glu Val Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser145 150 155 160Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr165 170 175Glu Lys Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile180 185 190Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gln Lys Arg Leu Lys Ser195 200 205Lys Glu stop210
4.根据权利要求3所述的佐剂，其特征在于其中所述的胸腺素α1和干扰素α8融合基因片段组合中TA1基因87bp为人工合成。
5.根据权利要求3所述的佐剂，其特征在于其中所述的胸腺素α1和干扰素α8融合基因片段组合中连接部位linker为[(GGT)4TCT]n，n＝2-4，其编码aa为(Gly4Ser1)。
6.根据权利要求3所述的佐剂，其特征在于其中所述的胸腺素α1和干扰素α8融合基因片段组合中下游IFNα序列与IFNα8完全一致，不含起始密码子，长501bp，起始密码子前3位为ACC，来自于中国健康成人的外周血白细胞。
7.根据权利要求2所述的佐剂，其特征在于其中所述的非复制型哺乳动物细胞高效表达载体为pcDNA系列、pRc/CMV、pCI或pVAX1。
8.根据权利要求1所述的佐剂，其特征在于其中所述的制剂剂型包括生理上可接受的液体制剂、乳液制剂或冻干制剂等。
9.一种如权利要求1所述的用于增强乙肝疫苗免疫效应的佐剂制备方法，其特征在于该佐剂的制备包括下述步骤(1)IFNα基因的扩增从正常人外周血白细胞中获得IFNα，设计引物PF1、PB1，通过RT-PCR，逆转录并扩增IFNα基因片段，切胶回收备用；(2)IFNα基因与pGEM-T载体的连接将IFNα基因插入pGEM-T载体后测序证实；(3)TA1与IFNα基因的连接在IFNα基因的上游(除去起始密码子)，人工合成TA1的全部87个碱基(无终止密码子)以及连接部分[(GGT)4TCT]n，获得到融合基因TA1-IFNα片段；(4)TA1-IFNα表达质粒的构建将TA1-IFNα通过双酶切位点Kpn I、Not I，连接到非复制型哺乳动物细胞高效表达载体中，获得表达质粒；(5)TA1-IFNα表达质粒的大规模生产将重组质粒及空载质粒转化感受态JM109，经大量扩增纯化、双酶切鉴定、紫外分光光度计定量后，无菌生理盐水稀释，即得乙肝核酸疫苗增效分子佐剂，分装后置-80℃冰箱保存。
10.根据权利要求9所述佐剂的制备方法，其特征在于其中所述的引物PF1具有下述序列tgtgatctgc ctcagactca c
11.根据权利要求9所述佐剂的制备方法，其特征在于其中所述的引物PB1具有下述序列ttattcctta ctcttcaatc
12.一种如权利要求1所述的佐剂在制备乙肝病毒免疫治疗药物及增强乙肝核酸疫苗免疫效应中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于其中所述的乙肝核酸疫苗系指HBV前S1、前S2、S、前C、C、P、X等基因或其各种组合的表达质粒。
14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于其中所述的药物是用于HBV持续感染者的治疗，包括HBV携带者、各种慢性乙肝患者、乙肝肝硬化及乙肝后肝癌而HBV DNA复制活跃者、HBV DNA呈整合状态者的治疗。
全文摘要
本发明涉及一种用于增强乙肝核酸疫苗免疫效应的佐剂及制备方法。该佐剂为含有胸腺素α1(TA1)和干扰素α8(IFNα8)融合基因片段载体的制剂，所述载体是通过将胸腺素α1和干扰素α8融合基因片段连接到各种非复制型哺乳动物细胞高效表达载体中，大量扩增纯化后获得的。该佐剂与S
文档编号C12N15/85GK1552447SQ0312903
公开日2004年12月8日 申请日期2003年6月4日 优先权日2003年6月4日
发明者陈守春, 周陶友, 刘忠荣, 李伯刚, 阎娟, 陈毅荣 申请人:成都地奥集团药物研究所