筛选抗SARS冠状病毒药物用非感染性病毒重组基因SARS－CoV－EGFP的制作方法

专利名称：筛选抗SARS冠状病毒药物用非感染性病毒重组基因SARS－CoV－EGFP的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是一种可用于筛选抗SARS冠状病毒药物及病毒学基础研究的非感染性病毒重组基因SARS-CoV-EGFP。
众所周知，正链RNA病毒复制形式为RNA-RNA，不形成DNA的中间体，所以无法直接进行基因组操作。如果采用感染性克隆技术将RNA逆转录成cDNA，并进行克隆，cDNA克隆转染细胞后，通过诱导转录成为相应的病毒RNA，并重新获得病毒，这样通过cDNA一环节，就可以对RNA病毒在基因水平上进行操作。该技术已经应用于RNA病毒的复制、表达、致病机制的理论研究以及应用于研制新型疫苗、新型病毒载体、药物筛选等。
表达噬菌体T7 RNA聚合酶的复制缺陷型重组腺病毒，已经成功地应用于诱导感染性克隆pHCV-GFP质粒表达重组丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)。其具体做法是将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因插入到HCV编码核心蛋白的C基因中，构建成HCV-GFP，然后在HCV-GFP基因组3’端依次连接丁型肝炎病毒(Hepatitis delta virus，HDV)反义基因组核酶碱基序列和T7末端终止序列，再将重组的全长基因组cDNA克隆到原核表达载体pUC19-T7pro的T7启动子的下游，构建成pHCV-GFP质粒。使用时，先将表达噬菌体T7 RNA聚合酶的复制缺陷型重组腺病毒感染肝癌Huh7细胞，2小时后，将pHCV-GFP质粒经脂质体介导转染该Huh7细胞，在细胞内，复制缺陷型重组腺病毒表达的T7 RNA聚合酶诱导pHCV-GFP的T7启动子开始转录，由于T7 RNA聚合酶只识别T7末端终止序列而到此终止转录，继而在HDV反义基因组核酶催化下自身切割为HCV-GFP RNA，该RNA含有重组病毒复制装配所需要的一切信息，可在细胞中自行进一步复制、转录、翻译、加工，包装成使细胞在荧光镜下发绿色荧光的重组HCV-GFP病毒。若在转染pHCV-GFP质粒的同时加入不同浓度的抗病毒药物，如干扰素，若药物有效，则在荧光镜下荧光强度减弱或不发荧光(Qi ZT et al.Arch Virol，2003；148449-467)；若药物无效，则药物作用细胞的荧光强度同未受药物作用细胞的荧光强度。这样就可根据重组病毒感染细胞所发荧光的强弱很方便地对抗病毒药物进行筛选。

发明内容
本发明根据重组丙型肝炎病毒HCV-GFP筛选抗病毒药物的原理，提供一种用于筛选抗SARS冠状病毒(SARS-CoV)药物或病毒学基础研究的非感染性重组病毒SARS-CoV-EGFP。由于它的非感染性，因此不必在BSL3级实验室展开工作，这就为抗SARS-CoV病毒药物筛选或病毒学基础研究带来极大的方便。
本发明是对SARS-CoV全基因组的一种改造。已知的SARS-CoV TOR2(GENEBANK numberAY274119)、CUHK-W1(GENEBANK numberAY278554)、HKU-39849(GENEBANK numberAY278491)、BJ01(GENEBANK numberAY278488)、BJ02(GENEBANK numberAY278487)、BJ03(GENEBANK numberAY278490)、BJ04(GENEBANK numberAY279354)、GZ01(GENEBANK numberAY278489)等株其基因组具有极高的同源性。它们的组织结构为5′-病毒酶(POL)-刺突糖蛋白(S)-包膜蛋白(E)-基质膜蛋白(M)-核衣壳蛋白(N)-polyA尾-3′。其中S蛋白突出于病毒包膜表面形成刺突，可特异性地与宿主细胞受体结合，使细胞和病毒发生膜融合，从而造成感染。S蛋白中氨基酸残基的改变能显著影响病毒的毒力和病毒对宿主细胞的亲嗜性。因此对S蛋白基因进行改造，构建重组非感染性SARS-CoV cDNA克隆，可以得到没有感染性而有复制装配特性(诱导产生)的重组病毒，这样，在非BSL3级实验室就能开展SARS冠状病毒的研究和药物筛选。
SARS-CoV的S蛋白全长为1255个氨基酸残基，与病毒的致病性和毒力有关的外部结构域位于第20-1195位氨基酸残基，本发明将这段编码序列用增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluoresent protein，EGFP)基因置换。同时在SARS-CoV全基因组的5’-端引入T7启动子序列(T7 Pro)，在全基因组的3’-端依次引入丁型肝炎病毒反义基因组核酶序列(HDV Rz)、T7转录终止子序列(T7 Ter)。改造后的重组基因SARS-CoV-EGFP的组织结构为5’-T7 Pro-POL-EGFP S-E-M-N-polyA尾-HDV Rz-T7 Ter-3’。将此重组基因克隆于pUC19载体的多克隆位点中，构建成重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP。
使用时，先用携带T7 RNA聚合酶基因的复制缺陷型重组腺病毒感染Vero细胞，2小时后将非感染性重组病毒SARS-CoV-EGFP的重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP经脂质体介导转染该细胞，在细胞内，复制缺陷型重组腺病毒表达的T7 RNA聚合酶诱导T7启动子进行转录，由于T7 RNA聚合酶只识别T7末端终止序列，因此，在此之前的基因都可以被转录，并在丁型肝炎病毒反义基因组核酶催化下自身切割为SARS-CoV-EGFP RNA，该RNA含有重组病毒复制装配所需要的一切信息，可在细胞中自行进一步复制、转录、翻译、加工、包装成重组SARS-CoV-EGFP病毒，所产生的病毒能使被转染的细胞在荧光镜下发出绿色荧光。若在转染时，同时加入药物，就可根据荧光的有无、强弱，判断药物的作用效果。
本发明重组基因SARS-CoV-EGFP经诱导表达装配的重组病毒既无感染性，又能有示踪作用，故可在普通实验室进行抗SARS-CoV药物筛选和病毒学基础研究，给工作带来极大的方便。
本发明非感染性重组病毒SARS-CoV-EGFP的制备方法如下一、材料pCA13、pJM17载体和293A细胞株购于美国Microbix公司。含有全长T7 RNA聚合酶基因的复制缺陷型重组腺病毒AdexCAT7由日本Miyamura博士赠送。pUC19载体购于晶美生物公司。pMD-18T载体购于大连TAKARA公司。SARS-CoV TOR2株全基因序列克隆由加拿大国家微生物学实验室赠送。EGFP S基因的、SARS Ter-HDV Rz-T7 Ter基因以及引物为上海生工公司合成，其中EGFP S基因已经生工公司插入到pMD18-T载体中，成为质粒pMD/EGFP S；SARS Ter-HDVRz-T7 Ter基因已经生工公司插入到pMD18-T载体中，成为质粒质粒pMD/HT。工具酶等购自美国Biolabs公司。DMEM细胞培养基、Lipofectamine购自GIBCO公司。大肠杆菌DH5α购于上海申能博彩公司。Vero细胞株购于中国科学院上海细胞生物学研究所。胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购于美国QIAGEN公司。
二、非感染性重组病毒SARS-CoV-EGFP重组质粒的构建SARS-CoV TOR2株全基因组序列为29751bp，为便于对基因组进行改造，需要将其进行适当的酶切分段，弃去含S蛋白外部结构域的基因片段，代之以人工合成的EGFP S基因；同时在基因组5’端酶切片段的5’端，用PCR方法引入T7启动子(T7 Pro)；弃去基因组3’端的部分序列，代之以人工合成的SARS Ter-HDV Rz-T7 Ter基因，最后将各片段按5’-T7Pro-POL-EGFP S-E-M-N-polyA尾-HDV Rz-T7 Ter-3’的顺序依次连接起来克隆到pUC19载体的多克隆位点中，构建成重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP。
1.SARS-CoV TOR2株全基因组的酶切分段SARS-CoV TOR2株全基因组序列先用BamH I消化，分别回收26044bp(为基因组的5’端片段)和3707bp(为基因组的3’端片段，由编码E、M、N及其他功能未知蛋白的序列和polyA尾组成)两个片段。26044bp片段再用ClaI消化，分别回收677bp(为基因组的5’端片段，编码部分POL，此段用于引入T7 Pro)和25367bp(ClaI/BamHI，该片段编码部分POL、完整的S蛋白和其他功能未知蛋白)两个片段。
2.在SARS-CoV TOR2株基因组的5’端引入T7启动子(T7 Pro)
上述677bp片段用引物1(5’-gcgaattcgcggccgctaatacgactcactatagggatattaggtttttacctacc-3’)和引物2(5’-gcatcgatgccatagctatgaccacc-3’)进行PCR扩增引入T7启动子序列。扩增产物用T4 DNA连接酶直接克隆于pMD-18T载体，得到重组质粒pMD-T7，测序鉴定插入片段与设计完全一致。用EcoRI和ClaI消化pMD-T7，回收引入了T7启动子的703bp(EcoRI/ClaI)的片段。片段序列为 atattaggtttttacctacccaggaaaagccaaccaacctcgatctcttgtagatctgttctctaaacgaactttaaaatctgtgtagctgtcgctcggctgcatgcctagtgcacctacgcagtataaacaataataaattttactgtcgttgacaagaaacgagtaactcgtccctcttctgcagactgcttacggtttcgtccgtgttgcagtcgatcatcagcatacctaggtttcgtccgggtgtgaccgaaaggtaagatggagagccttgttcttggtgtcaacgagaaaacacacgtccaactcagtttgcctgtccttcaggttagagacgtgctagtgcgtggcttcggggactctgtggaagaggccctatcggaggcacgtgaacacctcaaaaatggcacttgtggtctagtagagctggaaaaaggcgtactgccccagcttgaacagccctatgtgttcattaaacgttctgatgccttaagcaccaatcacggccacaaggtcgttgagctggttgcagaaatggacggcattcagtacggtcgtagcggtataacactgggagtactcgtgccacatgtgggcgaaaccccaattgcataccgcaatgttcttcttcgtaagaacggtaataagggagccggtggtcatagctatgg 其中，下加单划线的序列为T7启动子序列，共20bp；5’末端的 为EcoRI酶切位点， 为NotI酶切位点；3’末端的 为ClaI酶切位点3.将25367bp片段(ClaI/BamHI，该片段编码部分POL、完整的S蛋白和其他功能未知蛋白)用AgeI消化，回收20844bp片段(ClaI/AgeI，该片段编码部分POL及S蛋白的第1-19位氨基酸残基)。弃去4523bp片段，该片段含S蛋白中与病毒的致病性和毒力有关的外部结构域——第20-1195位氨基酸残基的编码序列S蛋白外部结构域的编码序列，用人工合成的EGFP S基因取代。
EGFP S基因序列为 tatgtttggctcggcttcattgctggactaattgccatcgtcatggttacaatcttgctttgttgcatgactagttgttgcagttgcctcaagggtgcatgctcttgtggttcttgctgcaagtttgatgaggatgactctgagccagttctcaagggtgtcaaattacattacacataaacgaacttatggatttgtttatgagattttttactcttagatcaattactgcacagccagtaaaaattgacaatgcttctcctgcaagtactgttcatgctacagcaacgataccgctacaagcctcactccctttcggatggcttgttattggcgttgcatttcttgctgtttttcagagcgctaccaaaataattgcgctcaataaaagatggcagctagccctttataagggcttccagttcatttgcaatttactgctgctatttgttaccatctattcacatcttttgcttgtcgctgcaggtatggaggcgcaatttttgtacctctatgccttgatatattttctacaatgcatcaacgcatgtagaattattatgagatgttggctttgttggaagtgcaaatccaagaacccattactttatgatgccaactactttgtttgctggcacacacataactatgactactgtataccatataacagtgtcacagatacaattgtcgttactgaaggtgacggcatttcaacaccaaaactcaaagaagactaccaaattggtggttattctgaggataggcactcaggtgttaaagactatgtcgttgtacatggctatttcaccgaagtttactaccagcttgagtctacacaaattactacagacactggtattgaaaatgctacattcttcatctttaacaagcttgttaaagacccaccgaatgtgcaaatacacacaatcgacggctcttcaggagttgctaatccagcaat 该合成基因的设计主要兼顾SARS-CoV TOR2株原有的限制性酶切位点，其中5’端的 为AgeI酶切位点，3’端的 为BamHI酶切位点。下加双划线的序列为EGFP序列。虽然SARS-CoV TOR2株的S基因止于原基因的25259nt处，但由于此处没有合适的酶切位点，故适当延长到原序列固有的BamHI酶切位点处。将携带合成的EGFP S基因的质粒pMD/EGFP S用AgeI和BamHI消化，回收1683bp(AgeI/BamHI)的EGFP S基因片段。
4.将3707bp片段(为基因组的3’端片段，由编码E、M、N及其他功能未知蛋白的序列和polyA尾组成)用PvuI消化，回收3566bp片段(BamHI/PvuI，编码E、M、N及其他功能未知蛋白的序列)。弃去3’端的141bp片段(主要为SARS-CoV TOR2株全基因组的polyA尾)用人工合成的SARS Ter-HDV Rz-T7 Ter基因取代。
SARS Ter-HDV Rz-T7 Ter基因序列为 agggtacagtgaataatgctagggagagctgcctatatggaagagccctaatgtgtaaaattaattttagtagtgctatccccatgtgattttaatagcttcttaggagaatgacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 该合成基因的设计也主要兼顾SARS-CoV TOR2株固有的限制性酶切位点，其中5’端 为PvuI酶切位点；3’端 为NotI酶切位点， 为XbaI酶切位点。下加虚划线的序列为HDV Rz序列，下加波纹划线的序列为T7 Ter序列。将携带SARS Ter-HDV Rz-T7 Ter基因的质粒pMD/HT用PvuI和XbaI消化，回收383bp(PvuI/XbaI)的SARS Ter-HDV Rz-T7Ter基因片段。
5.拼接SARS-CoV-EGFP序列并插入pUC19载体将pUC19载体用EcoRI和XbaI消化，并回收线性化的pUC19载体，与上述703bp(EcoRI/ClaI)片段、20864bp(ClaI/AgeI)片段、1683bp(AgeI/BamHI)片段、3566bp(BamHI/PvuI)片段和383bp(PvuI/XbaI)片段混合，在T4 DNA连接酶作用下连接，转化大肠杆菌，经质粒抽提、NotI酶切和测序鉴定，得到阳性重组质粒为pUC19/SARS-CoV-EGFP。SARS-CoV-EGFP的核苷酸序列祥见表1，其中下加单划线的序列为T7启动子序列，下加双划线的序列为EGFP序列，下加虚划线的序列为HDV反义基因组核酶序列，下加波纹划线的序列为T7终止子序列。
三、SARS-CoV-EGFP非感染性病毒的检测先用携带T7 RNA聚合酶基因的复制缺陷型重组腺病毒感染Vero细胞，再用非感染性病毒SARS-CoV-EGFP的重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP经脂质体介导转染该细胞，非感染性病毒表达的荧光蛋白可使转染细胞在荧光镜下呈现绿色荧光。若在转染时，同时加入药物，就可根据荧光的有无、强弱，判断药物的作用效果。


附图1为本发明重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP构建流程示意图。
附图2为本发明重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP的结构模式图
具体实施例方式一、重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP的构建1.SARS-CoV TOR2株全基因组的酶切分段SARS-CoV TOR2株全基因组DNA先用BamHI消化，反应条件为6μl全基因组(1μg/μl)，5μl 10×缓冲液[150mmol氯化钠，10mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.9)，10mmol氯化镁，1mmol二硫苏糖醇]，1μl BamHI(10个单位/μl)，补无菌水至50μl，37℃水浴消化4小时。用0.6％的低熔点琼脂糖电泳分离DNA片段，用QIAGEN公司的胶回收试剂盒分别纯化回收26044bp和3707bp两个DNA片段。
26044bp片段再用ClaI消化，反应体系为3μl 26044bp片段(800ng/μl)，3μl 10×缓冲液[50mmol醋酸钾，20mmol三(羟甲基)氨基甲烷·醋酸(pH7.9)，10mmol醋酸镁，1mmol二硫苏糖醇]，1μl ClaI(5个单位/μl)，补无菌水至30μl，37℃水浴消化4小时。用0.6％的低熔点琼脂糖电泳分离DNA片段，用QIAGEN公司的胶回收试剂盒分别回收677bp和25367bp(ClaI/BamHI)两个DNA片段。
2.在SARS-CoV TOR2株基因组的5’端引入T7启动子(T7 Pro)677bp片段用引物1(5’-gcgaattcgcggccgctaatacgactcactatagggatattaggtttttacctacc-3’)和引物2(5’-gcatcgatgccatagctatgaccacc-3’)进行PCR扩增引入T7启动子序列。PCR反应体系为5μl 10×PCR反应缓冲液[500mmol氯化钾，100mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH8.3)，15mmol氯化镁]，677bp片段10ng，引物1和引物2各100nmol，4μl dNTP(各2.5mmol)，1μl Taq酶(2个单位/μl)，补无菌水至50μl。扩增条件为预变性94℃ 4分钟；94℃ 30秒，65℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环；72℃ 10分钟。
PCR扩增产物用QIAGEN公司的PCR产物回收试剂盒纯化，与pMD-18T载体连接，连接条件为5μl纯化的PCR产物(20ng/μl)，1μl pMD-18T载体(50ng/μl)，1μl 10×缓冲液[10mmol氯化镁，10mmol二硫苏糖醇，50mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.5)，1mmol ATP]，1μlT4 DNA连接酶(20个单位/μl)，补无菌水至10μl，16℃水浴连接过夜。将连接反应液与100μl DH5α感受态菌液(OD600＝0.2)混合，冰浴30分钟，42℃ 90秒，冰浴2分钟，加入900μlLB培养基(1.0％胰蛋白胨，0.5％酵母膏，1.0％氯化钠)，37℃ 150转/分钟活化培养45分钟，取100μl培养菌液涂布含100ng/μl氨苄青霉素的LB平皿，37℃培养过夜。
从平皿上挑取6个转化子，培养后用QIAGEN公司的质粒抽提试剂盒提取转化子质粒。用EcoRI和ClaI消化鉴定，反应条件为10μl质粒(100ng/μl)，2μl 10×缓冲液[50mmol醋酸钾，20mmol三(羟甲基)氨基甲烷·醋酸(pH7.9)，10mmol醋酸镁，1mmol二硫苏糖醇]，0.4μl ClaI(5个单位/μl)，0.2μl EcoRI(10个单位/μl)，补无菌水至20μl。37℃水浴消化4小时。经1％琼脂糖电泳分离，含703bp插入片段的为重组质粒pMD-T7。
对该阳性克隆进行正向和反向序列测定。序列符合设计要求。再用EcoRI和ClaI消化重组质粒pMD-T7，反应条件为10μl质粒(300ng/μl)，3μl 10×缓冲液[50mmol醋酸钾，20mmol三(羟甲基)氨基甲烷·醋酸(pH7.9)，10mmol醋酸镁，1mmol二硫苏糖醇]，1μl ClaI(5个单位/μl)，1μl EcoRI(10个单位/μl)，补无菌水至50μl，37℃水浴消化4小时。经1％低熔点琼脂糖电泳分离，用QIAGEN公司的胶回收试剂盒回收703bp片段(EcoRI/ClaI)。
3.将25367bp片段(ClaI/BamHI)用AgeI消化，反应条件为3μl 25367bp片段(500ng/μl)，3μl 10×缓冲液[10mmol双-三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.0)，10mmol氯化镁，1mmol二硫苏糖醇]，1μl AgeI(2个单位/μl)，补无菌水至30μl，37℃水浴消化4小时。经0.6％的低熔点琼脂糖电泳分离，用QIAGEN公司的胶回收试剂盒回收20844bp(ClaI/AgeI)片段。
4.质粒pMD-EGFP S含生工公司合成EGFP S基因，用AgeI和BamHI消化，反应体系为10μl质粒(300ng/μl)，3μl 10×缓冲液[150mmol氯化钠，10mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.9)，10mmol氯化镁，1mmol二硫苏糖醇]，1.5μl AgeI(2个单位/μl)，1μ1 BamHI(10个单位/μl)，补无菌水至50μl，37℃水浴消化4小时。经1％低熔点琼脂糖电泳分离，用QIAGEN公司的胶回收试剂盒回收1683bp(AgeI/BamHI)片段。
5.质粒pMD-HT携带生工公司合成HDV Rz-T7 Ter基因，用PvuI和XbaI消化，反应体系为10μl质粒(300ng/μl)，3μl 10×缓冲液[50mmol氯化钠，10mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.9)，10mmol氯化镁，1mmol二硫苏糖醇]，1μl PvuI(5个单位/μl)，1μl XbaI(20个单位/μl)，补无菌水至50μl，37℃水浴消化4小时。经1.5％低熔点琼脂糖电泳分离，用QIAGEN公司的胶回收试剂盒回收383bp(PvuI/XbaI)片段。
6.将pUC19载体用EcoRI和XbaI消化，反应体系为2μl质粒(800ng/μl)，2μl 10×缓冲液[50mmol氯化钠，10mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.9)，10mmol氯化镁，1mmol二硫苏糖醇]，0.5μl EcoRI(10个单位/μl)，0.5μl XbaI(20个单位/μl)，补无菌水至20μl，37℃水浴消化4小时。经0.7％低熔点琼脂糖电泳分离消化片段，用QIAGEN公司的胶回收试剂盒回收线性化片段。
7.拼接SARS-CoV-EGFP序列并插入pUC19载体在T4 DNA连接酶作用下，经EcoRI/XbaI酶切线性化的pUC19载体与703bp(EcoRI/ClaI)片段、20844bp(ClaI/AgeI)片段、1683bp(AgeI/BamHI)片段、3566bp(BamHI/PvuI)片段和383bp(PvuI/XbaI)片段连接。连接反应条件为2μl线性化pUC19载体(50ng/μl)，1μl其他各片段(100ng/μl/每种片段)，1μl 10×缓冲液[10mmol氯化镁，10mmol二硫苏糖醇，50mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.5)，1mmol ATP]，1μl T4 DNA连接酶(20个单位/μl)，补无菌水至20μl，16℃连接过夜。将连接反应液与100μlDH5α感受态菌液(OD600＝0.2)混合，冰浴30分钟，42℃ 90秒，冰浴2分钟，加入900μl LB培养基，37℃ 50转/分钟活化培养45分钟，取100μl培养菌液涂布含100ng/μl氨苄青霉素的LB平皿，37℃培养过夜，挑取6个转化子，培养后用QIAGEN公司的小量质粒抽提试剂盒提取转化子质粒，用NotI酶切鉴定，反应条件为10μl质粒(100ng/μl)，2μl 10×缓冲液[100mmol氯化钠，50mmol三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸(pH7.9)，10mmol氯化镁，1mmol二硫苏糖醇]，0.2μl NotI(10个单位/μl)，补无菌水至20μl，37℃水浴消化4小时。经0.6％琼脂糖电泳分离，含27096bp插入片段的为阳性克隆pUC19/SARS-CoV-EGFP。阳性克隆经正向和反向序列测定，序列正确的为非感染性病毒SARS-CoV-EGFP的重组质粒，称为pUC19/SARS-CoV-EGFP。
二、SARS-CoV-EGFP非感染性病毒的检测在直径100mm的细胞培养皿中接种2×106个Vero细胞，细胞培养20小时后换500μl完全培养液(1.34％DMEM，2mmol L-谷氨酰胺，10％胎牛血清，用7.5％的碳酸氢钠调pH至7.0)，加入1μl感染复数(MOI)为10的AdexCAT7，置37℃5％CO2培养箱感染2小时后，6μl脂质体Lipofectamine介导转染10μg非感染性重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP，24小时后，用荧光镜观察细胞呈现绿色荧光，说明在细胞内复制缺陷型重组腺病毒表达的T7 RNA聚合酶诱导T7启动子开始转录，并经一系列病毒自身的复制、转录、翻译、加工，最终包装成非感染性重组病毒SARS-CoV-EGFP。
三、用非感染性病毒SARS-CoV-EGFP检测药物的抗病毒作用用Megagene公司的人IFN-α对该系统进行药物检测评估在3个直径100mm的细胞培养皿中分别接种2×106个Vero细胞，细胞培养20小时后换500μl完全培养液(1.34％DMEM，2mmol L-谷氨酰胺，10％胎牛血清，用7.5％的碳酸氢钠调pH至7.0)，分别加入1μl感染复数(MOI)为10的AdexCAT7，置37℃ 5％CO2培养箱感染2小时后，6μl脂质体Lipofectamine介导转染10μg非感染性重组质粒pUC19/SARS-CoV-EGFP，同时在1个培养皿中加入10个单位的人IFN-α；另1个培养皿中加入1个单位的人IFN-α；还有1个培养皿不加人IFN-α，作对照。置37℃ 5％CO2培养箱继续培养24小时。结果表明，加入10个单位的人IFN-α，24小时后无绿色荧光出现；加入1个单位的人IFN-α，荧光强度弱于未加人IFN-α的对照组。该结果说明一定浓度的人IFN-α能够有效地抑制SARS-CoV-EGFP非感染性病毒的产生，具有潜在的抗SARS-CoV的药用价值。
表1。重组基因SARS-CoV-EGFP核苷酸序列表 1 atattaggtt tttacctacc caggaaaagc caaccaacct cgatctcttg tagatctgtt61 ctctaaacga actttaaaat ctgtgtagct gtcgctcggc tgcatgccta gtgcacctac121 gcagtataaa caataataaa ttttactgtc gttgacaaga aacgagtaac tcgtccctct181 tctgcagact gcttacggtt tcgtccgtgt tgcagtcgat catcagcata cctaggtttc241 gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agccttgttc ttggtgtcaa cgagaaaaca301 cacgtccaac tcagtttgcc tgtccttcag gttagagacg tgctagtgcg tggcttcggg361 gactctgtgg aagaggccct atcggaggca cgtgaacacc tcaaaaatgg cacttgtggt421 ctagtagagc tggaaaaagg cgtactgccc cagcttgaac agccctatgt gttcattaaa481 cgttctgatg ccttaagcac caatcacggc cacaaggtcg ttgagctggt tgcagaaatg541 gacggcattc agtacggtcg tagcggtata acactgggag tactcgtgcc acatgtgggc601 gaaaccccaa ttgcataccg caatgttctt cttcgtaaga acggtaataa gggagccggtClaI661 ggtcatagct atggc ctaaagtct tatgacttag gtgacgagct tggcactgat721 cccattgaag attatgaaca aaactggaac actaagcatg gcagtggtgc actccgtgaa781 ctcactcgtg agctcaatgg aggtgcagtc actcgctatg tcgacaacaa tttctgtggc841 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权利要求
1.一种非感染性病毒重组基因，由SARS-CoV全基因组改造而成，其特征在于在SARS-CoV全基因组的5’端引入启动子序列T7 Pro，将S蛋白中与病毒致病性和毒力有关的外部结构域的编码序列用编码绿色荧光蛋白基因取代，全基因组的3’端依次引入HDV反义基因组核酶序列HDV Rz、T7转录终止子序列T7 Ter。
2.按权利要求1所述的非感染性重组病毒基因，其特征在于所说的编码绿色荧光蛋白的基因为EGFP，所建成的非感染性病毒重组基因为SARS-CoV-EGFP。
3.权利要求1或2所述非感染性病毒重组基因的重组表达质粒，其特征在于由重组非感染性病毒基因插入原核表达载体构成。
4.按权利要求3所述的非感染性病毒重组基因的重组表达质粒，其特征在于所说的原核表达载体为pUC19。
5.权利要求1或2所述非感染性病毒重组基因用于筛选抗SARS冠状病毒药物的用途。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是一种可用于筛选抗SARS冠状病毒药物及病毒学基础研究的非感染性病毒重组基因SARS－CoV－EGFP。本发明在SARS冠状病毒全基因组的5’端引入启动子序列T7 Pro，将S蛋白中与病毒致病性和毒力有关的外部结构域的编码序列用编码增强型绿色荧光蛋白的EGFP基因取代，全基因组的3’端依次引入HDV反义基因组核酶序列HDV R2、T7转录终止子序列T7 Ter，建成重组基因SARS－CoV－EGFP，将其插入载体构建成重组质粒pUC19/SARS－CoV－EGFP，转染细胞后，经复制、转录、翻译、加工、包装成的重组病毒能使被转染的细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光。若在转染的同时加入抗病毒药物，就可根据荧光的有无、强弱，判断药物的作用效果，因而可用于筛选抗SARS冠状病毒的药物。
文档编号C12N15/63GK1454996SQ0312921
公开日2003年11月12日 申请日期2003年6月12日 优先权日2003年6月12日
发明者戚中田, 潘欣 申请人:中国人民解放军第二军医大学