专利名称：Sars冠状病毒的干扰rna及其应用的制作方法
背景技术：
非典型肺炎(SARS)是由一种新发现的冠状病毒(severe acute respiratorysyndrome associated coronavirus，Nidovirales；Coronaviridae；Coronavirus；Group2 species)所引起。病毒的基因组由一条单链RNA组成，其中包含有14个开放式阅读框(ORF)。目前已知病毒编码的蛋白质包括脂双层膜及其上的棒状膜蛋白S、包膜蛋白E、膜糖蛋白M、以及膜内部衣壳蛋白N，以及一些蛋白酶和复制酶，然而大多数的ORF是否编码蛋白质，以及他们的功能都不清楚(Rota PA，Oberste MS，The genome sequence of the ARS-associatedcoronavirus.Science.2003 May 30；300(5624)1399-404)。
ORF3a是最近研究比较集中的SARS病毒基因之一。ORF3a编码了一个全长274个氨基酸的全新病毒蛋白，已有研究人员通过免疫印迹和蛋白质质谱的方法证明了这一病毒蛋白的存在，并推测其很可能是病毒的结构蛋白。通过生物信息学分析，该蛋白具有3个跨膜区，与其他已知蛋白的同源性很低(吴家睿，曾嵘等，申请号200310108604.X)。虽然通过很多不同的实验方法都证明了3a蛋白的存在，但是关于这一蛋白功能的研究还很少，而现有的文献都没有能够阐明该蛋白在病毒周期中的作用。(Naoto Ito，Eric C.Mossel，Krishna Narayanan，Vsevolod L.Popov，et al.，Severe acute respiratory syndromecoronavirus 3a protein is a viral structural protein，2005，J.Virol.79，3182-3186)。
通过和其他现有的冠状病毒(229E，OC43)对应的蛋白比较可以发现，只有SARS冠状病毒具有全长表达的3a蛋白，其余两种病毒蛋白缺少了蛋白C段的大部分氨基酸。而只有SARS病毒具有极高的致死率。因此，推测ORF3a基因与病毒的致病性密切相关，而充分研究ORF3a基因的功能必将为设计研发全新的抗SARS药物提供新的靶点。也可以为治疗其他冠状病毒引起的疾病具有提示作用。
发明内容
所要解决的技术问题本发明需要解决的技术问题是提供SARS冠状病毒的干扰RNA及其应用，以克服现有技术中未能阐明致病性机理，因而未能利用干扰RNA作用于SARS冠状病毒ORF3a基因从而抑制病毒的缺陷。
技术方案本发明的技术方案之一是提供SARS冠状病毒的干扰RNA，其碱基序列选自SEQ ID NO1，2或3；或者SEQ ID NO1，2或3核苷酸序列经过一个或多个碱基的取代、缺失或添加而形成的，且能与SARS病毒基因组同源性结合，作用于ORF3a基因的衍生RNA序列。
所说的SEQ ID NO1，2和3序列分别为SEQ ID NO15’UGCAUCAACGCAUGUAGAA 3’，即si-001SEQ ID NO25’AGAUACAAUUGUCGUUACU 3’，即si-002SEQ ID NO35’CAGCUUGAGUCUACACAAA 3’，即si-003上述的SARS冠状病毒的干扰RNA的一种优选方案为，当所说的干扰RNA SEQ ID NO3的作用浓度为25nM时，对病毒释放的抑制率为30％。
上述的SARS冠状病毒的干扰RNA的一种优选方案为，当所说的干扰RNA SEQ ID NO3的作用浓度为50nM时，对病毒释放的抑制率为60％。
上述的SARS冠状病毒的干扰RNA的一种优选方案为，当所说的干扰RNA SEQ ID NO3的作用浓度为100nM时，对病毒释放的抑制率为90％。
上述的SARS冠状病毒的干扰RNA SEQ ID NO3，其病毒抑制率的检测方法包括如下步骤a.将不同浓度的干扰RNA与空白的对照分别转染FRhK-4细胞；b.将SARS-CoV病毒(MOI＝10)加到经转染的FRhK-4细胞中；c.取病毒感染细胞的上清，分别检测上清中的病毒滴度；d.计算病毒释放抑制率＝(1-上清中的病毒拷贝数/对照组上清中的病毒拷贝数)×100％。
这些步骤并不是一成不变的，本领域的普通技术人员可以根据实际情况进行合理的修改使之符合检测应用的要求。比如根据要求选择病毒靶细胞的种类，选择是否将干扰RNA和病毒靶细胞、SARS-CoV病毒共同培养，选择使用PCR方法、还是免疫印迹方法来滴定上清中的病毒滴度，以及增加病毒扩增培养的步骤以使检测更为灵敏等等。或者，采用如下步骤a.转染SARS-CoV病毒到靶细胞FRhK-4中；b.将不同浓度的干扰RNA与空白的对照分别处理经转染的FRhK-4细胞；c.取病毒感染细胞的上清，分别检测上清中的病毒滴度；d.计算病毒释放抑制率＝(1-上清中的病毒拷贝数/对照组上清中的病毒拷贝数)×100％。
本发明的技术方案之二是提供一种SARS冠状病毒的干扰RNA抑制SARS病毒的方法，其特征在于，用技术方案之一所说的干扰RNA处理病毒感染细胞。优选的干扰RNA的核苷酸序列为SEQ ID NO3。
上述的SARS冠状病毒的干扰RNA抑制SARS病毒的方法的一种优选方式为，所说的干扰RNA SEQ ID NO3的作用浓度范围为25-100nM，相应的病毒释放抑制率为30％-90％。
上述的SARS冠状病毒的干扰RNA在制备抗SARS病毒的药物中的应用，比如本发明的干扰RNA可以以药物组合物的形式进行作用，所说的药物组合物含有治疗有效量的上述干扰RNA为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％-99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5％-95％的活性成分。
本发明的干扰RNA和药物组合物可用于制备预防或者治疗SARS冠状病毒感染的药物。
上述所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如稀释剂、赋形剂、填充剂、黏合剂、湿润剂、崩解剂、促进吸收剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。另外，还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明的干扰RNA可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方实施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成颗粒剂、片剂或者胶囊；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是注射剂，特别优选肌肉注射剂。
本发明的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。
本发明的化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，干扰RNA的中位治疗浓度范围可以为25-100nM，优选80-100nM。可以一次或多次施用。
有益效果应用干扰RNA的方法将SARS病毒感染过程中的3a蛋白基因表达抑制之后，发现SARS病毒的释放受到了抑制，上清中的病毒数量急剧减少。说明SARS病毒3a蛋白控制了病毒的释放。从而首次发现了SARS病毒的新的药物靶点。
而设计筛选的3个干扰RNA靶点都可以有效的抑制3a蛋白的表达，具有极高的药物应用价值。
图1是采用三种不同的siRNA序列干扰抑制FRhK-4细胞中转染的3a蛋白的表达，并采用免疫印记的方法检测抑制效果。
图2是选择了抑制效果最好的si-003先转染细胞后再用SARS-CoV病毒感染，在浓度分别为100nM，50nM，25nM，12.5nM的条件下，采用病毒N基因的引物，干扰RNA对细胞内病毒基因拷贝数的定量实时PCR检测结果(N拷贝数/β-actin的拷贝数)。
图3是选择了抑制效果最好的si-003先转染细胞后再用SARS-CoV病毒感染，在浓度分别为100nM，50nM，25nM，12.5nM的条件下，采用病毒P基因的引物，干扰RNA对细胞内病毒基因拷贝数的定量实时PCR检测结果(P拷贝数/β-actin的拷贝数)。
图4是选择了抑制效果最好的si-003先转染细胞后再用SARS-CoV病毒感染，在浓度分别为100nM，50nM，25nM，12.5nM的条件下，细胞上清中病毒的含量采用滴定的方法计算TCID50。
图5是选择了抑制效果最好的si-003先转染细胞后再用SARS-CoV病毒感染，在浓度分别为100nM，50nM，25nM，12.5nM的条件下，上清中的病毒含量采用定量实时PCR方法检测病毒拷贝数的结果。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂和Sigma公司。
实施例所用病毒株为SARS coronavirus GZ50；Viruses；ssRNApositive-strand viruses，no DNA stage；Nidovirales；Coronaviridae；Coronavirus；Group 2 species。GeneBank号为AAS00004。由香港大学郑伯建教授提供。
实施例1通过抑制ORF3a基因的表达来抑制SARS病毒的释放试验采用了RNA干扰技术。首先研究了3a蛋白的核酸序列，设计了三条干扰RNA靶点。(SEQ ID NO1UGCAUCAACGCAUGUAGAA，SEQ ID NO2AGAUACAAUUGUCGUUACU，and SEQ ID NO3CAGCUUGAGUCUACACAAA)。在细胞中验证后发现SEQ ID NO3具有最好的抑制ORF3a基因表达的效果。所以应用该干扰RNA进行病毒实验。
采用不同浓度的SEQIDNO3(100nM，50nM，25nM，12.5nM)以及一组空白对照组，先转染干扰RNA FRhK-4细胞中，8小时后，再用SARS-CoV病毒感染转染的细胞。24小时后，取病毒感染细胞的上清，分别采用免疫印记的方法测定上清中的病毒滴度，并记录抑制效果。(图1)实施例2采用病毒N基因的引物进行定量实时PCR检测上清和被感染细胞中的病毒拷贝数选择抑制效果最好的si-003先转染细胞后再用SARS-CoV病毒感染(其他方法同实施例1)，在浓度分别为100nM，50nM，25nM，12.5nM的条件下，采用病毒N基因的引物进行定量实时PCR检测干扰RNA对病毒基因拷贝数的抑制效果，结果发现RNA干扰后的细胞内病毒基因组中N的拷贝数没有变化(N基因拷贝数/β-actin对照的拷贝数)。(图2)实施例3采用病毒P基因的引物进行定量实时PCR检测上清和被感染细胞中的病毒拷贝数选择抑制效果最好的si-003，先转染细胞后再用SARS-CoV病毒感染(其他方法同实施例1)，在浓度分别为100nM，50nM，25nM，12.5nM的条件下，采用病毒P基因的引物进行定量实时PCR检测干扰RNA对病毒基因拷贝数的抑制效果(P基因拷贝数/β-actin对照的拷贝数)。结果显示P拷贝数没有变化。(图3)实施例4采用滴定的方法计算细胞上清中病毒的含量TCID50选择抑制效果最好的si-003先转染细胞后再用SARS-CoV病毒感染(其他方法同实施例1)，在浓度分别为100nM，50nM，25nM，12.5nM的条件下，采用滴定的方法计算细胞上清中病毒的含量TCID50。结果显示25nM的干扰RNA可以使得上清中的病毒减少了30％，50nM可以减少65％的病毒释放；100nM的干扰RNA使得上清中的病毒数只有对照组的10％(图4)实施例4采用定量实时PCR的方法检测上清中病毒的拷贝数选择抑制效果最好的si-003先转染细胞后再用SARS-CoV病毒感染(其他方法同实施例1)，在浓度分别为100nM，50nM，25nM，12.5nM的条件下，采用定量实时PCR方法检测上清中的病毒含量(病毒拷贝数)的结果。25nM的干扰RNA可以使得上清中的病毒基因拷贝数减少了30％，50nM可以减少65％；100nM的干扰RNA使得上清中的病毒基因拷贝数只有对照组的10％(图5)
核苷酸/氨基酸序列表SEQUENCE LISTING<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>SARS冠状病毒的干扰RNA及其应用<130>2006052903<160>3<170>Patentln version 3.3<210>1<211>19<212>RNA<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus<220>
<221>SiRNA<222>(1)..(19)<400>1ugcaucaacg cauguagaa19
<210>2<211>19<212>RNA<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus<220>
<221>SiRNA<222>(1)..(19)<400>2agauacaauu gucguuacu19<210>3<211>19<212>RNA<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus<220>
<221>SiRNA<222>(1)..(19)<400>3cagcuugagu cuacacaaa19
权利要求
1.SARS冠状病毒的干扰RNA，其特征在于，其碱基序列选自SEQ ID NO1，2或3；或者SEQ ID NO1，2或3的核苷酸序列经过一个或多个碱基的取代、缺失或添加而形成的，且能与SARS病毒基因组同源性结合，作用于ORF3a基因的衍生RNA序列。
2.根据权利要求1所述的SARS冠状病毒的干扰RNA，其特征在于，25nM的SEQ ID NO3干扰RNA对病毒释放的抑制率为30％。
3.根据权利要求1所述的SARS冠状病毒的干扰RNA，其特征在于，50nM的SEQ ID NO3干扰RNA对病毒释放的抑制率为65％。
4.根据权利要求1所述的SARS冠状病毒的干扰RNA，其特征在于，100nM的SEQ ID NO3干扰RNA对病毒释放的抑制率为90％。
5.根据权利要求2-4所述的SARS冠状病毒的干扰RNA，其病毒释放抑制率的检测方法包括如下步骤为a.将不同浓度的干扰RNA与空白的对照分别转染FRhK-4细胞；b.将SARS-CoV病毒加到经转染的FRhK-4细胞中；c.取病毒感染细胞的上清，分别检测上清中的病毒滴度；d.计算病毒释放抑制率＝(1-上清中的病毒拷贝数/对照组上清中的病毒拷贝数)×100％。
6.一种SARS冠状病毒的干扰RNA抑制SARS病毒的方法，其特征在于，用权利要求1所说的干扰RNA处理病毒感染细胞。
7.根据权利要求6所述的SARS冠状病毒的干扰RNA抑制SARS病毒的方法，其特征在于，所说的干扰RNA的核苷酸序列为SEQ ID NO3。
8.根据权利要求7所述的SARS冠状病毒的干扰RNA抑制SARS病毒的方法，其特征在于，所说的干扰RNA SEQ ID NO3的作用浓度范围为25-100nM。
9.根据权利要求8所述的SARS冠状病毒的干扰RNA抑制SARS病毒的方法，其特征在于，所说的干扰RNA SEQ ID NO3在作用浓度范围为25-100nM时，相应的病毒释放抑制率为30％-90％。
10.权利要求1所述的SARS冠状病毒的干扰RNA在制备抗SARS病毒的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及SARS冠状病毒的干扰RNA及其应用，其序列为SEQ ID NO1－3。干扰RNA所作用的ORF3a基因在病毒周期中起重要作用，是潜在的SARS治疗靶点。本发明还涉及干扰RNA对体外培养的SARS冠状病毒进行抑制的方法，在SARS预防和治疗领域具有重要应用前景。
文档编号A61P31/14GK101085986SQ20061002747
公开日2007年12月12日 申请日期2006年6月8日 优先权日2006年6月8日
发明者孙兵, 郑伯健, 吕伟, 徐可 申请人:中国科学院上海生命科学研究院