专利名称：一种新型冠状病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型病毒，具体地说涉及一种引起严重急性呼吸系统综合征的新型冠状病毒。
发明内容
本发明公开了一种新型冠状病毒，该病毒属于冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属(Coronavirus)，为SARS冠状病毒。该病毒的四个毒株分别从广州地区和北京地区非典型肺炎死亡病例肺组织标本，北京地区非典型肺炎患者鼻咽拭子标本以及北京地区非典型肺炎死亡病例肝与淋巴结混合组织标本中分离，分别命名为GZ01，BJ01，BJ02，BJ03株，已经于2003年6月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)保藏，四株病毒的保藏登记号分别为CGMCC NO.0939，CGMCC NO.0936，CGMCC NO.0937，CGMCC NO.0938。
该病毒颗粒多呈球形或椭圆形，外周有冠状排列的纤突，突起末端呈球状，纤突之间有较宽的间隙，病毒直径在80～120nm之间，纤突长20～40nm。见图2a。此外，也见到短杆状、肾形和不规则形的病毒颗粒，长120-220nm，宽50-90nm，纤突长20～40nm，单排或双排，呈花瓣状。该病毒颗粒主要分布在感染细胞细胞质的内质网池、高尔基体、空泡内和细胞外，有时在胞质中也见散在的病毒颗粒。成熟的病毒颗粒外周可见清晰的双层膜结构。病毒颗粒呈空心和实心两种状态，而且同一形状的病毒颗粒经常出现于同一病毒包涵体中，在有的包涵体和细胞外亦可见到有纤突的病毒颗粒。病毒包涵体多为球形或椭圆形，其形态、大小差异较大，包涵体内病毒排列紧密。可以看到病毒以胞饮或膜融合形式进入细胞内，病毒释放出细胞外是出芽生殖。感染病毒的细胞线粒体肿胀，部分线粒体外膜和嵴溶解，内质网扩张，细胞核染色质凝聚，边集。
本发明所述冠状病毒的4株病毒基因组全序列在美国NIH GenBank的登录号分别为AY278489，AY278488，AY278487和AY278490。
序列分析表明，本发明的病毒株与已知人及动物冠状病毒的同源性均小于70％。系统发生树图表明所分离的病毒，无论是与人冠状病毒还是与动物冠状病毒的亲缘关系均较远。因此，所分离的病毒是一种新的、已发生变异的冠状病毒。
本发明的发明人通过血清流行病学调查和中和试验，证明本发明的病毒与目前流行的非典型肺炎关系密切，是引起这次流行的非典型肺炎的主要病原体。
发明人利用新冠状病毒感染乳鼠，引起乳鼠不规律的发病和死亡，并从感染鼠肺标本中观察到冠状病毒颗粒，结合新冠状病毒的分离鉴定、病原关系的血清学研究，充分证明引起此次非典型肺炎的病原体是新冠状病毒。
本发明对病原体的分离鉴定有以下方法1、标本处理病人组织标本和血液标本取尸解肺组织标本研成匀浆，加入适量的病毒稀释液，离心后取上清用于接种细胞培和动物；鼻咽拭子标本将抗生素加入标本中，4℃过夜后离心，上清液用于接种。
2、病原体分离培养乳鼠接种法在无菌条件下，用微量注射器乳鼠脑内接种或同时腹腔接种，观测发病情况，若未发病，则取乳鼠脑、肺组织研磨成悬液，接种乳鼠，连续盲传3代。
细胞培养法将处理好的标本接种细胞培养瓶，观察细胞变化，若不出现CPE进行盲传，连续盲传3代。
3、电镜形态观察电镜负染色检查收集分离病原体感染的细胞培养液，固定，负染，透射电镜观察。超微结构检查取感染的细胞，经过戊二醛固定，等渗缓冲液洗涤，锇酸固定，梯度乙醇脱水，包埋，常规超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色，透射电镜观察。
4、间接免疫荧光染色分离物感染细胞片的制备在玻片上将细胞接种分离物细胞培养液，吸附后培养。待细胞出现病变，培养使细胞贴壁。漂洗除去未贴壁细胞，凉干后固定密封保存。间接免疫荧光抗体染色方法将病人血清标本稀释灭活，再适当稀释后滴加到细胞抗原片上，37℃作用后冲洗凉干，再加羊抗人FITC标记荧光抗体，37℃湿盒中作用后冲洗凉干，荧光显微镜观察染色结果。
5、微量细胞培养中和试验(固定病毒—稀释血清抗体法)取冠状病毒培养液液，测定TCID50，将非典型肺炎患者抗体阳性血清及正常人对照血清稀释后灭活，混合病毒与血清，置37℃温箱中作用后将病毒—血清混合物接种敏感细胞培养。计算半数保护量(PD50)。
6、RT-PCR扩增制备待检标本中总RNA，进行反转录PCR扩增，琼脂糖电泳观察结果。
7、序列测定、同源性比较和进化树分析将RT-PCR产物纯化后测序，进行Blast同源性比较，根据Genbank登记的已知冠状病毒基因序列，使用DNAstar软件的MegAlign模块，采用JotunHein法进行多株冠状病毒相应序列比较并绘制系统发生树。
本发明的病毒可以用于SARS的诊断试剂、抗SARS疫苗的制备等方面。本发明的申请人已经采用此病毒制备了冠状病毒抗体检测试剂盒(专利申请号为03124299.5)。
图1b为肺组织标本接种3天的Vero-E6细胞。
图2a为北京地区死亡病例尸解肺组织标本接种Vero-E6细胞培养液中的SARS冠状病毒颗粒，负染色，透射电镜。
图2b为广州地区标本感染乳鼠肺组织中的病毒颗粒，超薄切片。
图2c为北京地区死亡病例尸解肺组织标本感染Vero细胞中的病毒颗粒。
图2d为广州地区死亡病例尸解肺组织标本感染Vero细胞中的病毒颗粒。
图3为非典型肺炎患者血清与分离的病毒免疫荧光染色反应。
图4为新分离冠状病毒基于部分基因序列的系统进化分析图。
2、血清标本非典型肺炎患者血清，来自广州和北京地区医院收治的确诊病人；正常人血清，采自北京和广州地区血站献血员。
3、细胞Vero-E6、MDCK、Hep-2、Hela、BHK-21和LLC-MK-2等细胞系，均为市购的细胞株。
4、培养基RPIM 1640、DMEM，Gibco/BRL公司产品；小牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司产品；青霉素、链霉素为华北制药厂产品。
5、实验动物BALB/C和昆明种小白鼠乳鼠3-5日龄，均为本院实验动物中心繁殖供应。
6、RT-PCR和扩增产物纯化试剂、引物用于RNA制备的RNeasy MiniKit，购于QIAGEN公司；反转录酶SuperScript II，Taq DNA聚合酶购自Invitrogen公司；核酸凝胶回收试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit购自QIAGEN公司，引物由北京三博远志生物技术公司合成。二、方法1、标本处理病人组织标本取尸解肺组织标本，在预冷的乳钵中研成匀浆，加入适量的病毒稀释液(含500u/ml青霉素、500u/ml链霉素的1640培养基，pH7.0)，3000rpm离心20min，取上清用于接种细胞培和动物。血液标本病人血液凝块在预冷的乳钵中研磨成匀浆，加入适量的病毒稀释液，使之研磨成10-20％的悬液，2000rpm离心20min，上清液用于接种；鼻咽拭子标本按1000u/ml青霉素、1000μg/ml链霉素加入标本中，4℃过夜，3000rpm离心30min，上清液用于接种。
2、病原体分离培养乳鼠接种法选择健康的3-5日龄乳鼠，在无菌条件下，用0.25mL的微量注射器脑内接种，每份样品接种一窝(至少5只)，每只乳鼠脑内接种0.02mL，或同时腹腔接种0.03mL/只。每日观测小鼠的发病情况，一般观察7-14天。观察期内若未出现乳鼠发病，将乳鼠解剖取脑、肺组织，研磨成10％的组织悬液，接种乳鼠，连续盲传3代。
细胞培养法将处理好的标本接种于长成单层细胞的10mL细胞培养瓶中，每份标本接种两瓶，37℃吸附1h，然后吸出标本液、加含有2％小牛血清的细胞维持液，置37℃CO2培养箱培养。每天观察细胞变化，连续观察10天。若不出现CPE进行盲传，连续盲传3代。
3、电镜形态观察电镜负染色检查收集分离病原体感染的Vero-E6细胞培养液，以6.1％、pH 7.2的戊二醛固定液与培养液按1∶1比例混合固定后，以3％磷钨酸溶液负染色，透射电镜观察。超微结构检查取感染乳鼠肺组织、肺组织标本和尸解肺组织标本感染的Vero-E6细胞，用3.1％、pH 7.2戊二醛固定，1/15mol·L，pH7.2磷酸盐等渗缓冲液洗涤3次，1％锇酸固定后，梯度乙醇脱水，Epon812包埋，常规超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色，透射电镜观察。
4、间接免疫荧光染色分离物感染细胞片的制备将培养成单层的VERO-E6细胞用Hank’s液洗一次，然后接种分离物细胞培养悬液，1mL/瓶，放37℃孵箱中吸附1h，加入细胞维持液，放37℃继续培养。待细胞刚刚出现病变时，取感染细胞滴片，将滴好的玻片放37℃CO2孵箱中继续培养8h使细胞贴壁。取出玻片，放入0.005M pH7.2 PBS中漂洗，除去未贴壁的悬浮细胞，凉干。放入冷丙酮内，-20℃固定30min，凉干，-20℃密封保存备用。
间接免疫荧光抗体染色方法将病人血清标本1∶10稀释后，56℃作用30min，然后再适当稀释后分别滴加到细胞抗原片上，置37℃湿盒中作用30min(若检测IgM抗体则作用90min)，冲洗，PBS振荡洗3次，凉干。然后加羊抗人FITC标记荧光抗体，置37℃湿盒中作用30min，冲洗同前，凉干，在荧光显微镜下观察染色结果。
5、微量细胞培养中和试验(固定病毒—稀释血清抗体法)取试验用新分离冠状病毒培养液液，测定出病毒液的TCID50滴度，备用。将非典型肺炎患者抗体阳性血清及正常人对照血清1∶5稀释后于56℃、30min灭活。
根据测定的病毒悬液的TCID50滴度，用病毒稀释液(DMEM+2％小牛血清)将病毒进行稀释，稀释成400 TCID50/100μL病毒悬液，备用。同时，用生理盐水将灭活的患者血清及对照血清进行系列倍比稀释，即取0.1mL血清加等体积的生理盐水，依次系列稀释。
首先，混合病毒与血清，分别取不同稀释度的血清各0.15mL，将400TCID50/100μL病毒悬液分别加入稀释的血清管中，0.15mL/管，使各管病毒浓度均为200 TCID50/100μL，充分混匀后置37℃温箱中作用1h。
病毒—血清混合物接种敏感细胞，将病毒—血清混合物接种到微量培养板培养的VERO-E6细胞中，每个浓度接种4孔，50μL/孔，再补加细胞维持液100μL，放入37℃含5％CO2孵箱中培养。
同时设病毒对照将病毒稀释成2000、200、20、2 TCID50/100μL，每个稀释度接种4细胞培养孔，每孔加入病毒悬液50μl；阴性血清对照除用阴性血清代替试验血清外，其它均同试验组；正常细胞对照设4孔正常细胞对照，每孔加稀释液50μL。
逐日观察细胞病变，并记录。培养到第3-4天换细胞维持液一次。观察一周。
半数保护量(PD50)计算根据细胞病变情况，按Reed-Muench方法计算50％血清中和终点。先按下列公式计算出距离比例，距离比例＝(50％-＜50％的死亡率)/(＞50％的死亡率-＜50％的死亡率)，再将＜50％死亡率血清稀释度的对数(Log)+距离比例乘稀释系数的对数，即得出半数保护量(PD50)。
6、RT-PCR扩增待检标本中总RNA的制备，按RNeasy Mini Kit试剂盒说明书，由非典型肺炎患者的尸解肺组织、感染小鼠肺组织及其肝脾等脏器混合物，以及鼻咽拭子接种的Vero E-6细胞及其培养上清中提取总RNA。
首先进行反转录，在管中加入5μL总RNA，1μL Superscript II反转录酶(200u)，1μL引物4Bm2(或CV2，3)，4μl 5×反应缓冲液，1μL RNA酶抑制剂和1μL 10mM dNTP以及2μL 0.1M DTT，最后用不含RNase的水补足体积至20μL。于42℃反应60min后，95℃灭活5min。然后进行PCR扩增，反应系统包括5μl 10×PCR反应缓冲液，1μL 10mM dNTP，2μL25mM MgCl2，1μL TaqDNA聚合酶(2.5u)，上下游引物各1μL(10μM)，用水补足至50μL。用2Bp/4Bm、CV1/CV2和BLF+/BLF-引物对分别扩增40和35个循环。反应完毕，将产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。
7、序列测定、同源性比较和进化树分析将RT-PCR产物纯化后，由军事医学科学院生物工程研究所中心仪器室测序；也可将纯化的片段克隆至T-easy载体，筛选阳性克隆测序。所测序列进行Blast同源性比较，根据Genbank登记的目前已知冠状病毒基因序列，使用DNAstar软件的MegAlign模块，采用Jotun Hein法进行多株冠状病毒相应序列比较并绘制系统发生树。三、结 果1、病原体分离培养细胞培养分离选择了Vero-E6、MDCK、Hep-2、Hela和BHK-21等5株传代细胞株接种病例标本，进行非典型肺炎病原体分离。利用Vero-E6、MDCK细胞分别从广州地区和北京地区尸解的肺组织及北京地区采集的鼻咽拭子标本中分离出病原体，见表1。标本接种Vero-E6细胞培养后3天出现明显的细胞病变(CPE)，见图1a，图1b，并且能够稳定传代，稳定传7代的分离物已作为毒种保存。在MDCK细胞上也观察到了明显的CPE，但出现的时间较晚，需要5天。用另外3株细胞没能分离出病原体。另外，我们还用Vero-E6分离的病原体接种LLC-MK-2细胞，在LLC-MK-2细胞上分离的病原体也能生长，但出现CPE的时间要到接种后7天。
表1、细胞培养分离病原体结果标本Vero-E6 MDCKHep-2 Hela BHK-211 + +- - -2 + +- - -3 + +- - -1号为广州地区死者尸解肺组织；2号为北京地区死者尸解肺组织；3号为北京地区患者鼻咽拭子标本。
结果中本发明的发明人分离得四株冠状病毒毒株GZ01株和BJ01株，分别分离自广州地区和北京地区非典型肺炎死亡病例肺组织标本；BJ02株，分离自北京地区非典型肺炎患者鼻咽拭子标本；BJ03株，分离自北京地区“非典型肺炎”死亡病例肝与淋巴结混合组织标本。
利用乳鼠分离 利用乳鼠进行病原体分离，脑内接种后第一代有乳鼠发病、死亡，但发病不规律。取发病的鼠脑继续传代，目前乳鼠仍能不规律地发病。
2、病原体的电镜形态学观察电镜负染色检查广州和北京地区尸解肺组织标本接种的Vero-E6细胞培养液中，负染均查见病毒颗粒，多呈圆形，外周有冠状排列的纤突，病毒直径在80-120nm之间，见图2a。
超微结构检查在广州血液标本接种发病的乳鼠肺上皮细胞中查见病毒颗粒，病毒散在分布于细胞浆中，呈圆形，直径多在90nm左右，见图2b。感染病毒的细胞线粒体肿胀，部分线粒体外膜或嵴溶解。在广州地区和北京地区的尸解肺组织标本感染的Vero-E6细胞中均查见大量的病毒颗粒，多呈圆形，直径在80nm左右。病毒颗粒主要分布在胞浆的内质网池、胞浆空泡内和细胞外见图2c、图2d，多聚集成堆。感染病毒的细胞可见内质网扩张，线粒体肿胀、嵴溶解，细胞核染色质凝聚，边集。
3、患者血液标本的血清学检测为了证实分离的病原体与流行的非典型肺炎的关系，我们将分离的病毒感染Vero-E6细胞，制备成感染细胞抗原片，用以检测病人血清中是否存在抗分离的病毒的抗体。从北京和广州地区采集了26份临床诊断为非典型肺炎的患者血清，间接免疫荧光染色证明23份患者血清标本中存在抗分离的病毒的抗体，见图3。而30份正常人血清全部阴性。血清抗体阳性率为88.5％，显示分离的病毒与这次流行的非典型肺炎关系密切。
4、RT-PCR扩增与序列分析从广州和北京的两例非典型肺炎病例的尸解肺组织标本中分离的病原体感染的细胞培养物中，用冠状病毒属的简并引物(2Bp/4Bm)[Poutanen SM，LowDE，Henry B，Finkelstein S，Rose D，Green K，Tellier R，Draker R，Adachi D，AyersM，Chan AK，Skowronski DM，Salit I，Simor AE，Slutsky AS，Doyle PW，Krajden M，PetricM，Brunham RC，and McGeer AJ.Ident ification of severe acute respiratory syndromein Canada.N Engl J Med.Low-1~low-11(at www.nejm.org on March 31，2003)]，通过RT-PCR扩增可获得一条单一的约250bp的DNA条带，其大小与预期一致。对该扩增片段核苷酸序列的测定结果表明，其与人冠状病毒OC43型同源性为67％，与禽传染性支气管冠状病毒和鼠肺炎冠状病毒的同源性分别为70％和69％。
用另外两对冠状病毒聚合酶基因保守区的引物[Stephensen CB，CaseBolt DB，and Gangopadhyay NN.Phylogenetic analysis of a highly conserved region of thepolymerase gene from 11 coronaviruses and development of a consensus polymerasechain reaction assay.Virus Res.1999，60181-189]，同样从分离的病原体中扩增出与预期大小相同的DNA片段，长度分别为289bp和207bp。其中289bp片段与冠状病毒科中人冠状病毒的同源性为53.3％，而与牛冠状病毒同源性为67.3％；207bp片段与人冠状病毒同源性为53.6％，而与鼠肝炎病毒同源性为60％。对其序列测定的结果表明，广州和北京非典型肺炎病例肺组织中分离的病原体的这段序列是相同的，提示两地引起非典型肺炎流行的可能是相同的病毒株。
与此同时，采用上述引物直接从两例非典型肺炎尸解肺组织进行RT-PCR扩增，可同样扩增出预期大小及核苷酸序列完全相同的DNA片段。结果表明，我们分离的病原体确实来自尸解肺组织。从北京地区非典型肺炎患者鼻咽拭子接种的Vero E-6细胞分离的病原体中，采用上述引物，同样均分别扩增出相应的、大小与序列都相同的DNA片段。
根据Genbank中目前已登记的冠状病毒基因序列，采用Jotun Hein法绘制系统发生树图，表明所分离的病毒，无论是与人冠状病毒还是与动物冠状病毒的亲缘关系均较远，其同源性均不超过70％，见图4。因此，所分离的病毒可能是一种新的、已发生变异的冠状病毒。本发明所述冠状病毒的4株病毒基因组全序列在美国NIH GenBank的登录号分别为AY278489，AY278488，AY278487和AY278490。
5、分离的新冠状病毒与流行的非典型肺炎的病原关系从广州地区的两家医院和北京地区四家医院共采集到临床诊断为非典型肺炎的患者血清113份，其中广州地区21份，北京地区92份。利用通过细胞培养分离出的4株新冠状病毒制备成细胞-病毒抗原片，通过间接免疫荧光法检测患者血清中的抗新分离的冠状病毒的抗体，患者血清中结果见表2。
表2、IFA法对临床非典型肺炎病人血清IgG抗体检测结果医院编号 检测标本数阳性阴性阳性率(％)广州-17 5 2 71.4广州-214 11 3 78.6北京-139 39 0 100北京-214 10 4 71.4北京-39 7 2 77.8北京-430 27 3 90.0总数 11399 14 87.6从113份临床确诊的患者血清标本中检测出99份含有抗新型冠状病毒的抗体，血清抗体总阳性率为87.6％。各医院标本的检出阳性率有一定差异，高的达100％，低的也达71.4％。同时检测了84份正常人血清，其中北京地区30份、广州地区24份、其它地区30份，结果全部阴性。这些结果显示出新分离的冠状病毒与这次流行的非典型肺炎密切相关。
同时发现，不论自北京标本中分离的新冠状病毒毒株(BJ01，BJ02，BJ03)还是广州标本中分离的毒株(GZ01)，均可与这些血清产生良好的抗原-抗体反应。
患者血清中抗新分离冠状病毒抗体的变化先后收集了10位非典型肺炎病人的双份血清，其中北京地区和广州地区的各5位。第一份血清在发病5-12天采集，第二份血清于第一份血清采集后1-3周采集。双份血清抗体检测结果见表3。
表3.病人双份血清IFA检测抗体变化情况患者 采血时间 抗体效价抗体升高序号 (发病天数) (倍数)18 1∶20251∶2560 1282121∶40281∶2560 643101∶320261∶2560 847 1∶20241∶320165101∶160241∶2560 1665 1∶320231∶1280 477 1∶320201∶2560 88121∶20251∶160896 1∶20111∶160810 6 1∶80141∶6408
在一定阶段内，随着患者发病时间的延长，双份血清抗体都有明显的升高，最高的升高达128倍，低的也升高4倍。血清抗体的升高证明这些患者近期受到过新冠状病毒感染。
患者血清抗体对新分离冠状病毒的中和作用选择间接免疫荧光测定抗新分离的冠状病毒抗体阳性的非典型肺炎患者血清，北京地区和广州地区的各2份，以BJ01株病毒为代表，采取固定病毒-稀释血清的方法对新分离的冠状病毒进行中和试验。结果证明，4份血清对新冠状病毒BJ01株都有中和作用。根据方法中介绍的半数保护量计算公式计算，4份血清的半数保护量分别为北京地区1号血清1∶160；北京地区2号血清1∶452；广州地区1号血清1∶768；广州地区2号血清1∶783。这些结果显示出北京地区和广州地区的患者血清对BJ01株病毒都有较强的中和活性，表明引起这两地非典型肺炎的病毒毒株的中和抗原位点上没有太大的差异。
通过血清学方法，验证某一病原体与相应传染病的病原学关系，是确证一种新传染病病原体的重要手段之一。本发明通过对临床确诊的非典型肺炎患者血清中抗新分离的冠状病毒抗体的测定、双份血清抗体变化的比较和患者血清对新冠状病毒中和作用的观察，证明了新分离的冠状病毒是此次流行的非典型肺炎的病原体。
权利要求
1.一种新型冠状病毒，分别为SARS冠状病毒BJ01 CGMCC NO.0936，SARS冠状病毒BJ02 CGMCC NO.0937，SARS冠状病毒BJ03 CGMCCNO.0938，SARS冠状病毒GZ01 CGMCC NO.0939。
2.权利要求1所述的病毒在制备SARS诊断试剂、疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新型冠状病毒，该病毒多呈圆形，外周有冠状排列的纤突，直径在80－120nm，分布于胞浆中。该病毒从严重急性呼吸系统综合征患者标本中分离获得，接种敏感细胞可出现CPE，该病毒可与临床诊断为非典型肺炎的患者血清起特异反应，是一种SARS冠状病毒。
文档编号G01N33/569GK1468955SQ0313796
公开日2004年1月21日 申请日期2003年6月12日 优先权日2003年6月12日
发明者祝庆余, 秦鄂德, 王翠娥, 于曼, 司炳银, 范宝昌, 常国辉, 彭文明, 杨保安, 姜涛, 李豫川, 邓永强, 刘洪 , 甘永华 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所, 中国人民解放军军事医学科学院微生物