Sars冠状病毒刺突糖蛋白的可溶性片段的制作方法

专利名称：Sars冠状病毒刺突糖蛋白的可溶性片段的制作方法
技术领域：
本发明总的来说涉及到与严重急性呼吸道综合征(SARS)病原学相关联的冠状病毒(这里为SARS-CoV)所编码的刺突糖蛋白。本发明进一步涉及到具有与SARS-CoV的刺突糖蛋白片段一致的氨基酸序列的多肽、核酸和它们的保守性变异体。本发明也涉及到用这些核酸、多肽、变异体和片段产生识别SARS-CoV刺突糖蛋白的抗体，并用其生产抗SARS-CoV的疫苗。发明的另一个方面涉及到抑致SARS-CoV与动物细胞融合的刺突蛋白片段。
背景技术：
严重急性呼吸道综合征(SARS)是一种最近在32个国家和地区的病人中确认的感染性非典型性肺炎。病原不明的非典型性肺炎最早在中国的广东省发现。随后，香港、越南、新家坡、加拿大和北京相继报告了这种在家庭成员和医务工作者中传播的严重的发热性呼吸道疾病。该疾病后来被世界卫生组织(WHO)命名为“严重急性呼吸道综合征(SARS)”。到2003年5月19日，29个国家共向WHO报告了7864例SARS病例。总死亡报告为643例(病死率为8.2％)。
世界各地的研究者们对来自全球不同地区的SARS病原病毒的基因组进行了序列测定，该病毒被归类到冠状病毒。冠状病毒根据其抗体的交叉反应和基因数据被分为3类。两种先前已知的人类病毒与SARS-CoV在不同的组中。引起SARS的冠状病毒不同于已知的任何族群。而是自身形成一个新族群。对预测的病毒蛋白的系统发生学分析提示，该病毒与任何已知的三类冠状病毒都不密切相似。大多数冠状病毒或引起呼吸道疾病或引起粪-口途径传播的肠道疾病。
SARS的潜伏期为2到7天。感染特征为发热、干咳、气短和轻微的听诊异常和胸片实化。淋巴细胞减少、白细胞减少、血小板减少、肝酶增高和肌酐激酶增高在大多数病例中也存在。与胃肠道相关的症状在SARS病人中也可看到。
对广东、香港、北京、新加坡的死于SARS病人的病理学研究显示，肺部的浸润性肺泡损坏是最明显特征。在那些因病情严重而死亡的个体中，散在的II型肺泡细胞显示出明显的细胞学变化，包括多核化、巨细胞化、巨核化、核染色质澄清(clearing)和突出的核仁。虽然这些变化很严重，但仍在其他浸润性肺泡损坏的上皮细胞变化的范围内。鉴别的形态学变化包括支气管上皮细胞剥蚀、纤毛丧失和鳞状上皮化生。其他发现包括病灶肺泡内出血、吞噬血细胞作用、小气道坏死性炎性碎片、机化性肺炎或继发性细菌性肺炎。
该病的病理机制还有待确定，然而，急性肺损伤的机理可能涉及到病毒攻击内皮或上皮细胞而对肺泡壁产生的直接损害。选择性地，病毒可感染炎性细胞通过细胞因子、白介素或肿瘤坏死因子α介导引起损伤。也有可能SARS造成的组织损伤与病毒对组织的感染无直接关系，而是病毒在肺组织以外的邻近组织诱导的细胞因子和其他因子的继发效应。
对死亡病例的病理学评价显示肝细胞脂肪变性、肝浊肿、凋亡和点状坏死，伴有Kupffer增生和门脉淋巴细胞浸润。在病人的胃肠道壁有局部出血、血管充血和淋巴细胞浸润。
由于SARS-CoV能够经空气途径传播，所以它对整个世界的广大人群造成了特殊威胁，因此，迫切需要有感染前免疫、诊断感染、感染过程中免疫和治疗SARS-CoV感染者的方法问世。
发明概述这些需要及其他需要在这里描述的发明中得到了解决。本发明提供多肽、肽片段、病毒融合抑制剂、偶联蛋白、免疫肽、免疫组合物、仿多肽类药物、核酸片段、表达盒、核酸构建体、重组病毒、病毒性疫苗、肽疫苗、微生物疫苗、DNA疫苗、抗体、适体、药用组合物、免疫动物的方法、治疗严重急性呼吸道综合征(SARS)的方法、诊断SARS的方法和试剂盒。
本发明提供具有的氨基酸序列与SARS病原学相关的多肽一致的多肽。优选多肽来自SARS-CoV的刺突蛋白，能够抑制SARS与动物细胞的融合和/或在动物体内引发免疫反应。在一些实施方案中，多肽是来自SARS-CoV的刺突蛋白的可溶性多肽。在另一些实施方案中，多肽包括来自SARS-CoV的刺突蛋白的17-757位氨基酸。在一些实施方案中，多肽包括来自SARS-CoV的刺突蛋白的762-1189位氨基酸。在其他实施方案中，多肽包括来自SARS-CoV的刺突蛋白的17-757位氨基酸。在一些实施方案中，多肽包括来自SARS-CoV的刺突蛋白的17-276位氨基酸。在其他实施方案中，多肽包括来自SARS-CoV的刺突蛋白的303-537位氨基酸。在一些实施方案中，多肽包括来自SARS-CoV的刺突蛋白的317-517位氨基酸。在其他实施方案中，多肽包括来自SARS-CoV的刺突蛋白的272-537位氨基酸。在一些实施方案中，多肽包括来自SARS-CoV的刺突蛋白的17-537位氨基酸。在其他实施方案中，多肽包括来自SARS-CoV的刺突蛋白的17-1189位氨基酸(与SEQ ID NO1有关)。本发明的多肽能抑制SARS-CoV与动物细胞的融合。本发明的核酸和多肽接种动物能引发免疫反应。在一些实施方案中，本发明的核酸和多肽接种动物后引发细胞免疫反应。在其他实施方案中，本发明的核酸和多肽接种动物后引发体液免疫反应。动物可以是爬行动物。在某些实施方案中，动物可以是禽类。在某些实施方案中，动物是哺乳动物，有时是人。
本发明提供来自SARS-CoV刺突蛋白的肽片段，优选肽片段在水溶液中可溶。本发明的肽片段可以是SARS-CoV完整刺突蛋白的氨基酸序列但有一个氨基酸残基缺失。在一些实施方案中，肽片段长度至少为3个氨基酸。在其他实施方案中，肽片段长度至少为10个氨基酸。在一些实施方案中，肽片段长度至少为20个氨基酸。在其他实施方案中，肽片段长度至少为30个氨基酸。在一些实施方案中，肽片段长度至少为40个氨基酸。在其他实施方案中，肽片段长度至少为50个氨基酸。在一些实施方案中，肽片段长度至少为60个氨基酸。肽片段也可以是单个氨基酸单位添加到一个一定长度的片段中，例如，肽片段长度可以是3、4、10、11、21、22、31或32个氨基酸。本发明的肽片段能够抑制SARS CoV与动物细胞的融合或用于接种动物体后可引发免疫反应。接种动物后能够引发免疫反应的例子包括，例如序列为DVQAPNYTQHTSSMRGC(SEQ ID NO58)的D24肽和序列为PSSKRFQPQQFGRDC(SEQ ID NO59)的D540肽。在某些实施方案中，本发明的肽片段用于接种动物后引发细胞免疫反应，在其他实施方案中，本发明的肽片段用于接种动物后引发体液免疫反应。动物可以是爬行动物。在某些实施方案中，动物可以是禽鸟类。在其他实施方案中，动物可以是哺乳动物。在进一步的实施方案中，动物可以是人。
本发明提供偶联蛋白，该偶联蛋白包括一个连接到第二多肽上的载体蛋白。优选地，该载体蛋白是可溶性的。在一些实施方案中，当用于接种动物后，该载体蛋白增强对偶联蛋白的第二多肽的免疫反应。在其他实施方案中，当用于接种动物后，该载体蛋白诱导对偶联蛋白的第二多肽的细胞免疫反应。在一些实施方案中，当用于接种动物后，该载体蛋白诱导对偶联蛋白的第二多肽的体液免疫反应。该第二多肽可以是本发明的多肽或肽片段，或其保守性变异体。动物可以是爬行动物。在某些实施方案中，动物可以是禽鸟类。在其他实施方案中，动物可以是哺乳动物。在进一步的实施方案中，动物可以是人。
本发明提供包括本发明的多肽或肽片段或其保守性变异体并被连接到乙酰基、间三硝苯基、对氨基苯砷酸、对氨基苯磺酸上的免疫肽。在一些实施方案中，免疫肽被连接到乙酰基或间三硝苯基上。在其他实施方案中，免疫肽被连接到对氨基苯砷酸或对氨基苯磺酸上。优选地，免疫肽是可溶性的。优选地，免疫肽用于接种病人后引发免疫反应。在其他实施方案中，用于接种动物后，免疫肽能引发体液免疫反应。在一些实施方案中，用于接种动物后，疫肽能引发细胞免疫反应。动物可以是爬行动物。在某些实施方案中，动物可以是禽鸟类。在其他实施方案中，动物可以是哺乳动物。在进一步的实施方案中，动物可以是人。
本发明提供本发明中多肽和肽片段和其保守变异体的肽模拟物，其肽键被非肽键取代。在一些实施方案中，肽模拟物能抑制SARSCo-V与动物细胞融合。在其他实施方案中，用于接种动物后，肽模拟物能引发免疫反应，例如，用于接种动物后，肽模拟物能引发细胞免疫反应。可选性地，用于接种动物后，肽模拟物能引发体液免疫反应。动物可以是爬行动物。在某些实施方案中，动物可以是禽鸟类。在其他实施方案中，动物可以是哺乳动物。在进一步的实施方案中，动物可以是人。
本发明提供含有佐剂和本发明的核酸、多肽、肽片段或肽模拟物的组合物，在一些实施方案中，组合物能抑制SARS-CoV与动物细胞的融合。在其他实施方案中，用于接种动物后，组合物引发免疫反应。在一些实施方案中，用于接种动物后，组合物引发细胞免疫反应。在其他实施方案中，用于接种动物后，组合物引发体液免疫反应。动物可以是爬行动物。在某些实施方案中，动物可以是禽鸟类。在其他实施方案中，动物可以是哺乳动物。在进一步的实施方案中，动物可以是人。
本发明提供编码本发明的多肽和肽片段和它们的保守变异体的核酸片段。
本发明提供启动子被操作性地连接到本发明的核酸片段的表达盒。在一些实施方案中，启动子是组成性的。在其他实施方案中，启动子是可诱导的。
本发明提供含有载体和本发明的核酸片段的核酸构建体，核酸构建体可包括本发明的表达盒。在一些实施方案中，载体可以是病毒。在其他实施方案中，载体可以是质粒。在进一步的实施方案中，载体可以是表达载体。
本发明提供含有病毒载体和本发明的核酸片段的重组病毒。在一些实施方案中，病毒载体是疱疹病毒。在其他实施方案中，病毒载体是金丝雀痘病毒(canary pox virus)。在其他实施方案中，病毒载体是腺病毒。在进一步的实施方案中，病毒载体是牛痘病毒。
本发明提供含有病毒载体、本发明的核酸片段和药用载体的病毒性抗SARS疫苗。在一些实施方案中，病毒载体是疱疹病毒。在其他实施方案中，病毒载体是金丝雀痘病毒。在一些实施方案中，病毒载体是腺病毒。在进一步的实施方案中，病毒载体是牛痘病毒。优选地，药用载体是用于注射剂的。优选地，用于接种动物后，该病毒性疫苗引发免疫反应。在一些实施方案中，用于接种动物后，该病毒疫苗引发细胞免疫反应。在其他实施方案中，用于接种动物后，该病毒疫苗引发体液免疫反应。动物可以是爬行动物。在某些实施方案中，动物可以是禽鸟类。在其他实施方案中，动物可以是哺乳动物。在进一步的实施方案中，动物可以是人。
本发明提供含有本发明的肽模拟物、多肽和肽片段或其保守性变异体和药用载体的抗SARS肽类疫苗。优选地，药用载体被配制成注射剂。优选地，肽类疫苗被制成单位剂量形式。优选地，用于接种动物后，肽类疫苗引发免疫反应。在一些实施方案中，用于接种动物后，肽类疫苗引发细胞免疫反应。在其他实施方案中，用于接种动物后，肽类疫苗引发体液免疫反应。动物可以是爬行动物。在某些实施方案中，动物可以是禽鸟类。在其他实施方案中，动物可以是哺乳动物。在进一步的实施方案中，动物可以是人。
本发明提供含有表达本发明的多肽或肽片段、或它们的保守变异体的微生物及药用载体的抗SARS微生物疫苗。优选地，该微生物是减毒的。在一些实施方案中，微生物是沙门氏菌属(Salmonella)。在其他实施方案中，微生物是李斯特氏菌属(Listeria)。在一些实施方案中，微生物是单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)。在一些实施方案中，药用载体被配制成注射剂。在其它实施方案中，药用载体被配制成口服剂型。优选地，微生物疫苗被制成单位剂量形式。优选地，用于接种动物后，微生物疫苗引发免疫反应。在一些实施方案中，用于接种动物后，微生物疫苗引发细胞免疫反应。在其他实施方案中，用于接种动物后，微生物疫苗引发体液免疫反应。动物可以是爬行动物。在某些实施方案中，动物可以是禽鸟类。在其他实施方案中，动物可以是哺乳动物。在进一步的实施方案中，动物可以是人。
本发明提供含有插入有本发明的核酸片段的载体和药用载体的抗SARS DNA疫苗。该DNA疫苗可以含有佐剂。DNA疫苗可以含有肌肉坏死剂。例如，肌肉坏死剂可以是布比卡因。在其他实施方案中，肌肉坏死剂可以是心脏毒素。载体可以是，例如病毒。在一些实施方案中，载体是细菌嗜菌体。在进一步的实施方案中，载体是质粒。含有插入片段的载体可以在真核细胞内制备。在一些实施方案中，含有插入片段的载体可以在原核细胞内制备。例如，含有插入片段的载体可以在细菌中制备。在一些实施方案中，药用载体被用于制备粘膜给药剂。在其他实施方案中，药用载体被用于制备注射剂。优选地，DNA疫苗被制成单位剂量形式。优选地，用于接种动物后，该DNA疫苗引发免疫反应。在一些实施方案中，用于接种动物后，该微生物疫苗引发体液免疫反应。在其他实施方案中，用于接种动物后，该微生物疫苗引发细胞免疫反应。动物可以是爬行动物。在某些实施方案中，动物可以是禽鸟类。在其他实施方案中，动物可以是哺乳动物。在进一步的实施方案中，动物可以是人。
本发明提供与本发明的多肽或肽片段，或它们的变异体结合的抗体。在一些实施方案中，抗体是一种与抗原结合的抗体片段。在其他实施方案中，抗体为多克隆抗体。在进一步实施方案中，抗体是单链抗体。在其他实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些优选实施方案中，抗体为人源化抗体。抗体可以与一个用于检测的标记物结合，例如，检测标记物是同位素标记物。在一些实施方案中，检测标记物是亲和标记物。在其它实施方案中，检测标记物是酶。在另一些实施方案中，检测标记物是荧光标记物。抗体也可与毒素相连。
本发明提供与本发明的多肽或肽片段，或它们的保守性变异体结合的适体。该适体可以与检测标记物结合。例如，检测标记物可以是同位素标记物。在一些实施方案中，检测标记物是亲和标记物。在其他实施方案中，检测标记物是酶。在进一步的实施方案中，检测标记物为荧光蛋白。在一些优选实施方案中，检测标记物是荧光标记物。适体也可与毒素结合。
本发明提供含有本发明的抗体、S多肽或适体和药用载体的药用组合物或试剂盒。优选地，该药用组合物被配制成注射剂。
附图简述本专利或申请文本含有至少一幅彩图。本办公室将根据要求并在收取必要费用的情况下提供带有彩图的本专利或专利申请文本。


图1A是含有编码本发明的刺突蛋白的插入片段的DNA构建体的琼脂糖电泳图。从左到右的泳道道1为1kb的DNA分子量标记(从下到上为0.5、1.0、1.6、2.0、3.0、4.0)；道2显示被BamHI/XbaI消化后的DNA构建体，出现明显的载体条带(上带)和编码刺突蛋白的DNA片段(下带)；道3显示被HindIII消化后的DNA构建体，由于载体和编码刺突蛋白的DNA片段存在有HindIII的酶切位点，产生了预期的一个较小的条带和一个较大的条带。
图1B是全长的SARS-CoV S糖蛋白单体的示意图，显示了去除信号序列(1-16位残基，SEQ ID NO60)之后的各种可溶性多肽片段。可溶性片段为刺突蛋白片段，命名为“S”，继后是反应构成该片段末端的刺突蛋白氨基酸位数。这样，“S756”指一个起始于第17位氨基酸(紧跟信号序列之后)，终止于第756位氨基酸的可溶性刺突蛋白片段。“TM”指跨膜片段，箭头标示了在第758-761(序列RNTR)位氨基酸之间的可能的切割位点。“RBD”指在第272-537(SEQ IDNO57)位氨基酸之间的潜在的受体结合区，很可能位于第303位氨基酸的下游残基和第537(SEQ ID NO61)位氨基酸的上游残基之间。
图2显示了大肠杆菌中SARS-CoV刺突蛋白的肽片段表达的变性聚丙烯酰胺电泳图。该肽片段为SEQ ID NO1的第17-446位氨基酸。编码17-446位氨基酸的核酸片段被克隆进pRSET载体，构建成pRSET-S(17-446)，在BL21DE3细胞中表达。左边的数字和箭头指示以千道尔顿为单位的分子量标示。泳道含有以下多肽M为分子量标示；泳道1和2为不含编码SEQ ID NO1的17-446位氨基酸残基的核酸序列和未经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的对照大肠杆菌的多肽；泳道3为不含编码SEQ ID NO1的17-446位氨基酸残基的核酸序列但经过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的对照大肠杆菌的多肽；泳道4为含有编码SEQ ID NO1的17-446位氨基酸残基的核酸序列的pRSET载体并经IPTG诱导的大肠杆菌分析。右边的箭头指示与大肠杆菌表达的SEQ ID NO1的17-446位氨基酸残基相应的肽片段的位置。
图3是SARS-CoV的刺突蛋白的所述多肽片段在哺乳动物细胞中表达的狭线印迹分析图。编码肽片段的核酸片段被克隆进pSecTag2B载体，以表达N端含有具分泌功能的小鼠k链前导序列、C端含有用于检测和亲和层析纯化的c-Myc决定簇和组氨酸标记物的肽片段。该核酸构建体被转化进入HEK293和VeroE6细胞。指定肽片段的表达用抗c-Myc抗体通过狭线印迹分析来检测。左右两侧的数字指示检测到的肽片段的氨基酸残基。左边的一栏代表肽片段在HEK293细胞中的表达，右边的一栏代表肽片段在VeroE6细胞中的表达。上半栏代表获取自细胞培养基的样品(分泌蛋白)，下半栏代表获取自细胞裂解物的样品(细胞内蛋白)。PC为阳性对照，由提供含有C端带c-Myc标记物的PSA的质粒的厂家提供。NC为阴性对照，含来自SARS-CoV的全长刺突蛋白但无c-Myc决定簇或组氨酸标记物。
图4A是刺突蛋白的指定肽片段在人293细胞或猴VeroE6细胞中表达的狭线印迹分析。在有或无重组牛痘病毒表达的T7聚合酶存在下转染了编码S片段(S276，S537和S756)的质粒的293和VeroE6细胞的培养上清被转移到硝酸纤维素膜上并用抗c-Myc决定簇的抗体进行检测。左右两侧的数字指示被检出肽片段的氨基酸残基。PSA PC为含有C端带c-Myc标记物的PSA阳性对照。pCDNA-S NC为含有SARS-CoV全长刺突蛋白但无c-Myc决定簇或组氨酸标记物的阴性对照。泳道内容如下(1)未用VTF7.3牛痘病毒感染的人293细胞，(2)用VTF7.3牛痘病毒感染的人293细胞，(3)未用VTF7.3牛痘病毒感染的猴VeroE6细胞，(4)用VTF7.3牛痘病毒感染的猴VeroE6细胞。
图4B如图4A所述将转染细胞的上清与Ni-NTA琼脂糖珠一起温育，清洗并用与图4A中相同的抗-c-Myc抗原表位抗体进行Western印迹试验。
图4C为用两株分别抗起始于第24位残基(D24，中间组)和第540位残基(P540，右边组)的肽的兔多克隆抗体检测S片段的图示。左边的一组为用抗c-Myc决定簇抗体检测S537和S756的Western印迹对照。
图5是用兔多克隆抗体P540通过流式细胞仪显示全长的膜相关的S蛋白表达在细胞表面的图示。编码全长S糖蛋白的核酸被用于转染293细胞，然后再用VTF7.3转染。收集细胞并与P540多克隆抗体和带有FITC的第二抗体共孵育后，经洗涤，再用流式细胞仪进行分析。不含编码S的核酸的与表达S的质粒一样的质粒在对照实验中被用于转染作为阴性对照(NC)的细胞，转染有含有编码全长S糖蛋白的核酸的细胞以S标示。
图6A和6B显示S糖蛋白基本无自然发生的切割。表达S756、Se的转染293细胞的上清和表达S糖蛋白的293细胞的裂解物用P540抗体进行Western印迹，观察发现S和Se的切割在基线水平。图6A是样品在4℃存放3天后用于Western印迹分析切割图谱以监测非特异性蛋白酶活性效应的图示。作为对比，图6B为样品制备后立即进行的印迹分析图示。
图7A-C显示的是S糖蛋白介导的细胞融合。一个无S插入片段的基于pCDNA3的质粒被用作质粒对照，S表达细胞与ACE2-ecto表达细胞的融合被用作阴性对照。该pCDNA3-ACE2-ecto构建体只表达ACE2的带有C9肽标记物的可溶性ecto功能区。图7A显示转染有pSecTag2B-S和pCDNA3-ACE2-Ecto的293T细胞之间无合体细胞形成。相比之下，图7B显示转染有pSecTag2B-S和pCDNA3-ACE2的293T细胞之间有合体细胞形成。图7C为用一个基于报告基因的试验来测定的细胞融合的图示，如图所示，pCDNA3和pSecTag2B载体表达的S糖蛋白均可在基于β-gal报告基因的细胞-细胞融合试验中测到。
图8A-C显示S糖蛋白的受体-结合区(RBD)位于第272和537位残基之间。图8A为两个不同的可溶性S片段(S537和S756)与293细胞和Vero E6细胞结合的图示。图8B为各种S片段与Vero E6细胞结合的图示，背景阴性对照的OD405值从各S片段的OD405值中减除，得到的OD405值以相对S537的百分比表示。图8C为用ELISA法测得的S多肽片段与纯化后的可溶性ACE2相互作用的图示。在所有实验中，阴性对照(NC)为除了用于转染的质粒不编码任何蛋白外，其处理方式与其他样品完全相同的样品。这里显示的数据代表至少三个独立的实验。所有样品的OD405以相对S537的百分比表示。
图9A-D为SARS-CoV的S糖蛋白的N末端片段之间经证实通过免疫共沉淀和交叉连接发生二聚体化的图示。所有N末端片段，除含有受体结合区的最小的片段(S317-517)外，通过P540抗体与S756免疫共沉淀。P540抗体是抗含S糖蛋白的第540-555位残基的肽的兔多克隆抗体，它能与S756多肽非N末端片段结合。
图9A中，编码N末端片段的质粒(以终止氨基酸残基的数字或起始和终止氨基酸残基的数字命名)被用于单独转染(左边6条道)或与编码S756的质粒联合转染(右边4条道)293T细胞，这些细胞再用VTF7.3牛痘病毒转染，进行孵育后，收集细胞培养基，用能够识别所有片段的小鼠抗c-Myc决定簇抗体进行Western印迹分析的图示。
图9B为所有N末端S片段，除含有受体结合功能区的最小片段(S317-517)外，通过P540抗体与S756免疫共沉淀的图示。与图9A中所用培养基一样的培养基样品首先被用于与只识别S756的P540多克隆抗体进行免疫沉淀，然后用抗c-Myc决定簇的抗体对这些沉淀物进行Western印迹分析，以确定被免疫共沉淀的N末端片段。
图9C显示的是在有或无DTT存在的情况下，分子量大小与二聚体形式一致的新条带。为了排除可能引起免疫共沉淀的非特异性二硫键形成的可能，DTT被用于其中的一个免疫共沉淀实验中。DTT对分泌的S756(左道)或S756+S276(右道)的免疫沉淀或免疫共沉淀无作用。含有分泌的S756(左道)或S756+S276(右道)片段的培养基样品在有或无2mM DTT存在的情况下用P540抗体进行免疫沉淀。
图9D是S多肽寡聚体大小的示意图。S537片段与BS3(Pierce，Rockford，IL)如实施例中所描述的那样交叉联接，经过SDS-PAGE分离后，用抗c-Myc抗体通过Western印迹来检测S537的单体和它的寡聚体。正如图9D右边的泳道所显示，当交叉联接剂加入后出现了一个新条带。该新条带的分子量与二聚体一致而与更高级的寡聚体不同。
图10A为通过排阻层析检测到的N末端片段S537的二聚体化图示。S537和S317-517的洗脱谱上用箭头和数字指明标准校对蛋白被洗脱的位置和分子量。
图10B为用抗c-Myc决定簇抗体对收集到的S537和S317-517流分进行Western印迹的图示。
图11A-B显示最远端的N末端功能区为S糖蛋白介导的细胞-细胞融合所必需。图11A为S糖蛋白的缺失突变的图示和细胞-细胞融合试验数据的总结，其中RBD代表受体结合区的大致位置。因为融合而出现的信号用加号(+)表示，测不到高于背景水平的信号用减号(-)表示。只有野生型的含第17-1255位氨基酸的多肽具有融合活性。含第103-1255(Del1)和含第311-1255(Del2)氨基酸的缺失突变体均无融合活性。图11B显示用Western分析法测得的全长S糖蛋白和其突变体的表达水平。各样品用同样量的细胞裂解物加样，兔多克隆抗体P540用于检测。图11C为用流式细胞仪测得的全长S糖蛋白和Del1和Del2缺失突变体在细胞表面表达的图示。虽然表面表达较低，但只转染了空质粒的细胞的阴性对照与其他三条曲线有明显不同。
图12A-B显示二聚体S1与含受体结合域的单价片段相比能更有效地与受体ACE2结合。图12A显示用转染了S276、S319-518和S537构建体的细胞的200μl培养上清通过ELISA法检测到的不同S片段的相对表达水平。抗组氨酸抗体和抗c-Myc决定簇抗体被用于三明治ELISA来检测分泌的带标记物的S蛋白。图12B显示用ELISA法测得的S片段与ACE2结合的水平。带有标记的ACE2通过事先包被于板上的抗C9抗体固定在板上，转染了各种S蛋白的细胞的细胞培养上清被混合后，加入ELISA板，在有(影线)或无(空白)抗c-Myc抗体存在的条件下孵育。最高的表达或结合水平推定为100％。如图所示，具有N末端二聚体化和受体结合两个功能区的S537片段比只含有受体结合区的S319-518片段与ACE2的结合更有效。
图13A-B显示在排阻层析的条件下可溶性S胞外域为三聚体。图13A中，纯化的Se通过用已知分子量的蛋白校正过的凝胶过滤柱层析。同样量的BSA被用作内部对照。在图13B中，从凝胶过滤柱收集到的不同的流分，通过Western印迹进行分析。在一些含有已知分子量的Se片段的流分中检测到两个S多肽的条带，代表Se片段自身(下面的条带)和它的聚合体(上面的条带)。
图14A显示本发明的DNA疫苗能够在小鼠体内引发出很高滴度的抗SARS-CoV血清。小鼠1A-5A用编码含有刺突蛋白受体结合区(RBD)的S319-518片段的DNA免疫；小鼠1B-5B用RBD-编码DNA(S319-518片段)与编码Fc片段的核酸的融合体免疫；小鼠1C-3C接种空质粒(无S片段DNA)。收集抗血清，用ELISA法检测以确定不同分离物的滴度。在图14A中，第一个数字代表单个小鼠，字母代表各免疫组，最后的数字代表所用稀释度。抗血清按50、250、1250和7250的稀释系数稀释，如该柱图的X轴所示。这些数字提示用编码S蛋白的受体结合区的DNA进行免疫诱导出很强的针对SARS-CoV的免疫反应。
图14B显示从用RBD-编码DNA免疫的小鼠获取的抗血清能够预防S介导的细胞融合。细胞(293T)与获取自用编码刺突蛋白受体结合区多肽(S319-518)片段的DNA免疫过的小鼠的抗血清孵育，然后该细胞悬液与表达S蛋白的细胞混合。融合的测定如实施例20中所述(也见，Xiao等，BBRC 2003)。各融合反应的活性百分比(这里1＝100％)被绘制在Y轴，无任何抑制的融合的百分比被指定为100％。PC代表未加血清的阳性对照。对各组中#1到#2鼠血清，所用血清稀释系数为10(指定为0.1)、100(指定为0.01)和1000(指定为0.001)。对A组和B组中#3到#5鼠血清以及对照组中3#鼠血清，所用血清稀释系数为20(指定为0.05)和100(指定为0.01)。这些数据提示用编码S蛋白的受体结合区的DNA进行免疫可预防SARS-CoV感染。
图15显示可溶性S糖蛋白片段抑制S介导的细胞融合。10μg/ml的各种S片段与ACE2-表达细胞首先在室温下孵育10分钟。该ACE2-表达细胞再与S表达细胞混合，融合试验用实施例中描述的方法进行。Y轴是各样本减去了背景噪音后的OD595值。各构建体的数字代表各多肽的起始和终止残基。
发明详述SARS是重要的公共健康问题。诊断和治疗感染了SARS-CoV的病人的方法为预防或控制SARS-CoV感染的进一步传播提供了机会。由于SARS-CoV通过空气的途径感染人体，所以这些方法特别重要。本发明提供编码SARS-CoV刺突蛋白的氨基酸序列片段的核酸。本发明也提供氨基酸序列与SARS-CoV刺突蛋白的氨基酸片段序列一致的多肽。本发明还提供SARS-CoV刺突蛋白的肽片段和它们的保守性变异体，另外还有氨基酸序列部分与刺突蛋白一致的偶联蛋白和肽模拟物。
刺突蛋白是非常重要的蛋白，是由于其位于完整SARS-CoV的表面。因此，它可被用作在病毒有机会感染细胞之前抑制或清除完整病毒的靶目标。
本发明提供的核酸和多肽相对全长的刺突蛋白来说有明显的优势，因为核酸很容易生产，本发明的多肽也能以可溶性的形式大量制备。本发明的多肽相对天然刺突蛋白来说还有另一个优势，它们可以被制备成对动物体内的降解有较大抵抗力的形式。本发明的多肽也能通过配制增强其抗原性使其成为更有效的抗原在动物体，如人体引发免疫反应。
所以，本发明提供可以被配制成能够用于免疫和治疗SARS-CoV感染者的疫苗和免疫组合物的核酸和多肽抗原。另外，本发明还提供与SARS-CoV的刺突蛋白结合的可以用于诊断、免疫和治疗SARS-CoV感染者的抗体。
定义“佐剂”一般情况下被定义为非特异性地加强抗原的免疫反应的物质。各种佐剂可以用于本发明的免疫肽和免疫fragopeptides。大多数佐剂在设计上含有保护抗原不被快速代谢的物质，如氢氧化铝或矿物油，和免疫反应刺激剂，如脂质A、百日咳薄得氏菌(Bortadellapertussis)或结合分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)来源蛋白。合适的佐剂市场上有售，例如，Freund′s不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories，Detroit，Mich.)；Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)；铝盐如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝；钙盐、铁盐和锌盐；不可溶的酰化酪氨酸悬液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生化的多糖；聚磷腈；生物降解微球；单磷酰脂A和quil A；细胞因子，如GM-CSF或白介素-2、-7或-12也可以被用作佐剂。
“动物”指能够针对抗原的攻击调动起免疫反应的有机体。例如，爬行动物、禽鸟类和哺乳动物能够对抗原的攻击产生抗体反应。在非人有机体内产生的抗体被认为用于诊断试验有利于降低和排除交叉反应。
“适体”为与本发明的多肽或肽片段结合的肽、多肽或核酸(RNA或DNA)。
“载体蛋白”指可以连接到本发明的多肽或肽片段上形成偶联蛋白的多肽。载体蛋白可以为了增强多肽或肽片段的可溶性和免疫原性而连接到多肽或肽片段上。例如，生物素可以被用作载体蛋白连接到多肽或肽片段上形成一个可以通过与亲和素的相互作用而分离出来，或通过使用荧光标记的亲和素来检测的偶联蛋白。在另一个例子中，连接有抗体的载体蛋白可以被连接到多肽或肽片段上形成一个偶联蛋白，该偶联蛋白与抗体相连而抗体又与连接蛋白的载体蛋白相连。
本发明包含分离的或基本纯化的核酸、肽、多肽或蛋白。在本发明的内容中，“分离”的核酸、DNA或RNA分子或“分离”的多肽指存在于非天然环境中的核酸、DNA、RNA分子或多肽，因此不是天然产物。分离的核酸、DNA、RNA分子或多肽可以以纯化的形式存在或存在于一个非天然的环境中，例如，转基因宿主细胞中。“分离”的核酸分子、肽、多肽或蛋白、或其片段用重组技术生产时应基本不含其他细胞物质或培养基，用化学合成法生产时应基本不含化学前体或其他化学物质。在一个实施方案中，“分离”的核酸为不含该核酸在其来源有机体的基因组DNA上的天然侧翼序列(即位于该核酸5′和3′端的序列)。在各种实施方案中，分离的核酸分子可以含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的其来源细胞基因组DNA上该核苷酸序列的侧翼序列。基本不含细胞物质的蛋白、肽或多肽包括含有小于约30％、20％、10％或5％(干重)的污染蛋白的蛋白、肽或多肽制剂。当本发明的蛋白、或它们的生物活性部分是通过重组的方法生产时，优选培养基含小于30％、20％、10％或5％(干重)的化学前体或非目的蛋白化学物质。
术语多肽、肽和蛋白在这里是相互混用的。
肽或多肽“片段”在这里用于指比全长的肽、多肽或蛋白小的片段。例如，肽或多肽片段在长度上可以含有至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个氨基酸，或它们的单个单位长度。例如，片段在长度上可以是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多氨基酸，肽片段在大小上无上限。但是，在一些实施方案中，肽片段在长度上可以小于500个氨基酸、小于400个氨基酸、小于300个氨基酸、小于250个氨基酸。优选肽片段用于接种动物后能够诱导出免疫反应。肽片段用于引发免疫反应可以通过将肽片段与佐剂联和后接种动物，即与佐剂结合的肽片段，或与对氨基苯砷酸、对氨基苯磺酸、乙酰基团或间三硝基苯基偶联的肽片段。肽片段中可含有非酰胺键，并可以是肽模拟物。
术语“可溶”用于这里指多肽具有在水溶液中溶解的能力，例如，可溶性多肽可与水性介质混合，使水性介质中至少有部分可测到的肽。肽的检测可以通过常规技术来实现，如光吸收法、荧光法、与染料的结合能力、减少银离子的能力和其他类似方法。
术语“特异性结合”指与单一抗原决定簇结合而不与多于一个的抗原决定簇结合的抗体，因此，与一种多肽特异性结合的抗体将与该多肽上的一个抗原决定簇结合，而不与另一个多肽上的抗原决定簇结合。
I.本发明的多肽、肽片段、偶联蛋白、免疫肽和肽模拟物本发明提供含有与严重急性呼吸系统综合征(SARS)病原学相关的病毒(SARS-CoV)的刺突蛋白的氨基酸序列一致的氨基酸序列的多肽，其代表性氨基酸序列为SEQ ID NO1，该序列被罗列于下供参考
1 MFIFLLFLTL TSGSDLDRCT TFDDVQAPNY TQHTSSMRGV41 YYPDEIFRSD TLYLTQDLFL PFYSNVTGFH TINHTFGNPV81 IPFKDGIYFA ATEKSNVVRG WVFGSTMNNK SQSVIIINNS121 TNVVIRACNF ELCDNPFFAV SKPMGTQTHT MIFDNAFNCT161 FEYISDAFSL DVSEKSGNFK HLREFVFKNK DGFLYVYKGY201 QPIDVVRDLP SGFNTLKPIF KLPLGINITN FRAILTAFSP241 AQDIWGTSAA AYFVGYLKPT TFMLKYDENG TITDAVDCSQ281 NPLAELKCSV KSFEIDKGIY QTSNFRVVPS GDVVRFPNIT321 NLCPFGEVFN ATKFPSVYAW ERKKISNCVA DYSVLYNSTF361 FSTFKCYGVS ATKLNDLCFS NVYADSFVVK GDDVRQIAPG401 QTGVIADYNY KLPDDFMGCV LAWNTRNIDA TSTGNYNYKY441 RYLRHGKLRP FERDISNVPF SPDGKPCTPP ALNCYWPLND481 YGFYTTTGIG YQPYRVVVLS FELLNAPATV CGPKLSTDLI521 KNQCVNFNFN GLTGTGVLTP SSKRFQPFQQ FGRDVSDFTD561 SVRDPKTSEI LDISPCAFGG VSVITPGTNA SSEVAVLYQD601 VNCTDVSTAI HADQLTPAWR IYSTGNNVFQ TQAGCLIGAE641 HVDTSYECDI PIGAGICASY HTVSLLRSTS QKSIVAYTMS681 LGADSSIAYS NNTIAIPTNF SISITTEVMP VSMAKTSVDC721 NMYICGDSTE CANLLLQYGS FCTQLNRALS GIAAEQDRNT761 REVFAQVKQM YKTPTLKYFG GFNFSQILPD PLKPTKRSFI801 EDLLFNKVTL ADAGFMKQYG ECLGDINARD LICAQKFNGL841 TVLPPLLTDD MIAAYTAALV SGTATAGWTF GAGAALQIPF881 AMQMAYRFNG IGVTQNVLYE NQKQIANQFN KAISQIQESL921 TTTSTALGKL QDVVNQNAQA LNTLVKQLSS NFGAISSVLN961 DILSRLDKVE AEVQIDRLIT GRLQSLQTYV TQQLIRAAEI1001 RASANLAATK MSECVLGQSK RVDFCGKGYH LMSFPQAAPH1041 GVVFLHVTYV PSQERNFTTA PAICHEGKAY FPREGVFVFN1081 GTSWFITQRN FFSPQIITTD NTFVSGNCDV VIGIINNTVY1121 DPLQPELDSF KEELDKYFKN HTSPDVDLGD ISGINASVVN1161 IQKEIDRLNE VAKNLNESLI DLQELGKYEQ YIKWPWYVWL1201 GFIAGLIAIV MVTILLCCMT SCCSCLKGAC SCGSCCKFDE1241 DDSEPVLKGV KLHYT本发明也提供含有与严重急性呼吸系统综合征(SARS)病原学相关的病毒(SARS-CoV)的刺突蛋白的氨基酸序列一致的氨基酸序列的肽片段，这些氨基酸序列包括SEQ ID NO13、14、15、20-59和61-63所代表的序列。SEQ ID NO1的肽片段在长度上也可以是三个或三个以上的氨基酸，并且当用于接种动物时能够产生免疫反应。这些肽片段以那些长度为三个氨基酸，或更长一些的单个氨基酸单位，如长度为4、5、6、7、8、9、10个氨基酸和与SEQ ID NO1的氨基酸序列一致的序列上缺少一个氨基酸的氨基酸序列为典型。
本发明也提供含有载体蛋白连接到本发明的多肽和肽片段上的偶联蛋白。载体蛋白可以用于增强偶联蛋白的可溶性。载体蛋白也可用于增强偶联蛋白的免疫原性以增加与本发明的多肽或肽片段结合的抗体的产量。载体蛋白还可用于分离和检测偶联蛋白，因此，偶联蛋白可以通过与偶联蛋白的载体蛋白部分相结合的其他成分的相互作用而被检测或分离出来。例如，偶联蛋白含有亲和素的载体蛋白，可通过已知的方法用生物素进行检测和分离。许多载体蛋白可被用来制备本发明的偶联蛋白。这些载体蛋白的例子包括匙孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、小鼠血清白蛋白、兔血清白蛋白和其类似物。载体蛋白可以通过重组的方法以融合蛋白的形式与本发明的多肽或肽片段偶联。载体蛋白也可以通过化学的方法与本发明的多肽或肽片段偶联，或通过使用化学连接物偶联。这些偶联方法为本领域所知并且已有描述，见Harlow等，AntibodiesALaboratory Manual，page 319(Cold Spring Harbor Pub.1988)；Taylor，Protein Immobilization，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1991)。
本发明提供本发明的多肽或肽片段连接到对氨基苯砷酸、对氨基苯磺酸、乙酰基团，或间三硝基苯基的免疫肽，与这些基团连接的方法为已知的并且已有报道，见Weigle，J.Exp.Med.，116913-928(1962)；Weigle，J.Exp.Med.，1221049-1062(1965)；Weigle，J.Exp.Med.，121289-308(1965)。
本发明的多肽和肽片段可以是糖基化和非糖基化形式。本发明的多肽和肽片段可以是在水溶液中可溶的或不可溶的。本发明的多肽和肽片段可以是保守性变异体，保守性变异体指来源于全长多肽，如示例序列SEQ ID NO1的多肽和肽片段，通过删除(所谓截断)、添加或在全长多肽的N末端和/或C末端减去一个或多个氨基酸；或删除、添加或在全长多肽的N末端和/或C末端一处或多处减去一个或多个氨基酸。这些变异体可由，例如，基因多态性引起或人为操纵所致，这样的操纵方法为本领域所广泛知晓。例如，SEQ ID NO1的氨基酸序列变异体可以通过突变编码多肽的DNA来制备。突变及改变核苷酸序列的方法为本领域所广泛知晓。见，例如，Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)；Kunkel等，Methods in Enzymol.，154367(1987)；美国专利号4,873,192；Walker and Gaastra，eds.，Techniques in Molecular Biology.MacMillan Publishing Company，NewYork(1983)和这里引用的参考。合适的氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等的Atlas of Protein Sequence and Structure，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，C.D.(1978)模型中找到，这里通过引用结合于此。保守性取代，如用一个性质相似的氨基酸取代另一个氨基酸为优选。例如，用一个疏水氨基酸取代另一个，或用一个亲水氨基酸取代另一个。常规的筛选试验可用来确定取代后的来自SEQ ID NO1的多肽或肽片段用于动物后是否能产生免疫反应。这种筛选试验的例子为本领域所熟知，包括酶联免疫吸附试验、放射免疫试验、铬释放试验和类似试验，这些试验在Harlow et al.，AntibodiesALaboratory Manual，page 319(Cold Spring Harbor Pub.1988)上已有描述。
本发明提供本发明的多肽或肽片段的肽模拟物，肽模拟物为肽类似物，正如那些制药业常用的、特性类似于其模板肽的非肽类药物(Fauchere，J.，Adv.Drug Res.，1529(1986)和Evans等，J.Med.Chem.，301229(1987))。肽模拟物在结构上与多肽或肽片段类似，含有肽键、但有一个或多个肽联键通过本领域已知的方法被--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH--(顺和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--这样的联键任选取代。肽模拟物相对自然多肽的优势包括更经济地生产、更大的稳定性、改变了的特异性和加强了的药学特性，如半衰期、吸收性、强度和效果。
本发明的多肽、肽片段、偶联蛋白和肽模拟物可以通过在其氨基和/或羧基端添加封闭剂进行修饰以降低在体内的降解而用于体内。这种做法在多肽进入细胞前其末端倾向于被蛋白酶降解的情况下会有用。这样的封闭剂包括但不限于可以被连接到将要使用的多肽、肽片段、偶联蛋白和肽模拟物的外加的相关或非相关的肽序列，这可以通过普通技术人员所熟悉的方法，用化学方法在多肽、肽片段或偶联蛋白的合成过程中完成，或用重组DNA技术来完成。可选性的，封闭剂如焦谷氨酸和其他本领域所知的分子可以被连接到氨基端和/或羧基端残基上，或氨基端和/或羧基端残基的氨基基团可以被不同的分子取代，因此，本发明提供氨基端和羧基端残基被封闭的多肽或肽片段。
本发明的多肽或肽片段引发免疫反应的能力可以通过许多本领域认可的方法来测试，例如，它们诱导抗体产生的能力和刺激细胞毒性T淋巴细胞反应的能力。
本发明的多肽和肽片段可以被用于筛选试验以鉴别或分离与本发明的多肽或肽片段、或SARS-CoV的刺突蛋白结合的抗体。例如，多肽或肽片段可以用于噬菌体表面展示技术试验来分离与多肽或肽片段结合的抗体。在另一个例子中，本发明的多肽和肽片段被结合到一个抗体可以接触到的固体支持体上，这样，能够与多肽和肽片段结合的抗体就被固定到了固体支持体上，这些抗体过后可以从固体支持体上洗脱下来。本发明的多肽和肽片段可以通过本领域所知的其他许多方法用于分离抗体。
可以用于本发明的偶联蛋白、多肽或肽片段的小规模或大规模生产的表达系统包括但不限于被含有本发明的核酸片段的重组核酸构建体转化了的细胞或微生物。重组核酸构建体的例子包括细菌噬菌体DNA、质粒DNA、黏粒DNA或病毒表达载体。可以被转化的细胞和微生物的实例包括细菌(例如，大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)；酵母(例如，酵母属和毕赤酵母)；昆虫细胞系统(例如，杆状病毒)；植物细胞系统；哺乳动物细胞系统(例如，COS，CHO，BHK，293，VERO，HeLa，MDCK，W138，和NIH 3T3细胞)。可用作宿主细胞的还有转染有质粒载体或感染有病毒载体的直接从哺乳动物来源的原代或次代细胞。合适的表达载体的例子其中包括但不限于质粒和病毒载体，如疱疹病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、减毒牛痘病毒、金丝雀痘病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和疱疹病毒。合成的方法也可用来生产本发明的多肽和肽片段，已知这些方法并已有报道，见Merrifield，Science，852149(1963)。
II.本发明的核酸片段、表达盒和核酸构建体本发明提供编码本发明的多肽、肽片段和偶联蛋白的分离的核酸片段。本发明的核酸片段也包括由于基因密码子的简并性而编码同样氨基酸的片段，例如，氨基酸苏氨酸由ACU，ACC，ACA和ACG编码，因此是简并性的。本发明有意包括编码同样氨基酸的多核苷酸片段的所有变异体。这样的突变为本领域所知(Watson等，Molecular Biology of the Gene，Benjamin Cummings 1987)，突变也包括改变后的核酸片段转而编码保守性氨基酸，例如，异亮氨酸被亮氨酸取代和类似取代，这样的突变为本领域所知。如此，本发明的基因和核苷酸序列包括自然发生的序列和突变序列二者。
本发明的核酸片段可以含于载体上，载体可以包括但不限于任何质粒、噬粒、F-因子、病毒、黏粒或双链或单链线状和环状的可以或不可以自我渗透或移动的噬菌体。载体也可通过整合入细胞基因组或以染色体外存在的形式(即含有复制区的自主复制质粒)转化原核或真核宿主。
优选地，载体上的核酸片段在合适的启动子或其他调节元件的控制之下或被操作性的连接到启动子或其他调节元件以在体外或宿主细胞如真核细胞或微生物，如细菌内进行转录。载体可以是能在多种宿主内行使功能的穿梭载体，载体还可以是典型地含有一个或几个限制性酶切位点、外源DNA能以确定的方式插入的克隆载体，这样的插入不会造成克隆载体的基本生物学功能的丧失。克隆载体也可以含有适用于对该载体转化的细胞进行鉴别和筛选的标记基因，标记基因的例子有四环素和氨苄青霉素抗性基因。许多克隆载体从市场上可以买到(Stratagene，New England Biolabs，Clonetech)。
本发明的核酸片段也可被插入表达载体。典型的表达载体含有编码细菌复制区域的原核细胞DNA元件和用于扩增和筛选细菌宿主内的表达载体的抗生素抗性基因；含有控制启动转录的调节元件如启动子；含有控制转录子的加工的DNA元件如内含子或转录终止/多聚腺苷酸化序列。
本领域有现成的将核酸片段装入载体的方法(Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd edition，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))，简单地讲，将待插入核酸片段的载体用一种或多种限制性酶(限制性内切酶)处理，产生含有平末端、带5′或3′悬余“粘”末端或它们的任何组合的线性载体。载体可以用限制性酶处理后，再用修饰酶，如聚合酶、内切酶、去磷酸化酶或激酶处理，以得到一个具有有利于将核酸片段连接入载体的特征的线性载体。待插入载体的核酸片段用一种或多种限制性酶(限制性内切酶)处理，产生含有平末端、带5′或3′悬余的“粘”末端或它们的任何组合的线性片段。核酸片段也可以用限制性酶处理后，继而用其他DNA修饰酶处理，这些DNA修饰酶包括、但不限于聚合酶、内切酶、去磷酸化酶或激酶，以得到一个具有有利于将核酸片段连接入载体的特征的核酸片段。
然后，用本领域可用的方法(Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(2001))，将经过处理的载体和核酸片段连接到一起形成含有核酸片段的构建体。简单地讲，被处理过的核酸片段和被处理过的载体在有合适的缓冲液和连接酶存在的条件被混合在一起，然后在适宜的条件下进行孵育，以允许连接酶将核酸片段连接到载体上。
本发明也提供含有能够在体外或宿主细胞内指导本发明的特殊核酸片段表达的核酸序列的表达盒，如SEQ ID NO2。同时，本发明的核酸片段也可被插入表达盒以产生一个反义信息。表达盒为一个独立的单元，可以为线状并能用于体外转录和翻译试验。进行这些试验的材料和方法从Promega Corp.(Madison，Wisconsin)公司购得。例如，体外转录可以将核酸序列置于T7启动子的控制之下，然后用T7聚合酶开始体外转录。这些转录子可以通过加入兔网织红细胞裂解物进行翻译。任选性地，表达盒可被装入载体而在宿主细胞内复制和括增，或在体外转录和翻译核酸片段。
这样的表达盒可以含有一个或多个限制性位点，允许核酸片段被置于调节序列的调节之下。表达盒也可含有操作性地连接到核酸片段的终止信号和核酸片段正常翻译所需的调节序列。表达盒所含核酸片段可以是嵌合型的，即它的一个组分相对于它的至少其他一个组分来说是外源性的。表达盒可以是天然的但以重组的形式获得以方便外源基因的表达。核酸片段在表达盒中的表达可以受组成型启动子或诱导型启动子的控制，诱导型启动子只有在宿主细胞暴露于特殊的外源刺激物时才启动转录。
表达盒可以包括5′-3′方向的转录，一个转录和翻译启动区，一个核酸片段和一个在体外和/或体内发挥功能的转录和翻译终止区。该终止区可以是转录起始区天然所有，可以是核酸片段天然所有，或是从其他来源所得。
调节序列可以包括、但不限于增强子、启动子、阻遏子结合位点、翻译前导序列、内含子和多聚腺苷酸信号序列。它们可以包括天然的和合成的序列以及天然与合成序列的联合序列。调节序列不限于启动子，一些调节序列包括组成型启动子、诱导型启动子、调节型启动子、组织特异型启动子、病毒启动子和合成启动子。
启动子是一段核酸序列，通过提供RNA聚合酶和其他转录所必须的识别位点控制编码序列的表达。启动子包括一个最小启动子，含所有最基本的起始转录所必须的元件，如TATA盒和/或起始子，起始子为一段短DNA序列，含TATA盒和标示转录起始位点的其他序列，调节元件与其结合以控制表达。启动子可以完全来源于一个天然基因，或由来自不同的天然启动子的不同元件组成，甚至由合成的DNA片段组成。启动子可以含与蛋白因子结合的序列，该类蛋白因子能对物理或发育条件作出反应而控制转录起始的有效性。
本发明提供含有载体和表达盒的构建体。载体可以选自、但不限于任何前面已描述过的载体。可以通过本领域所知的方法和前面描述过的方法(Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))将表达盒插入载体。在一个实施方案中，表达盒的调节序列可以来源于该表达盒插入的载体以外。在另一个实施方案中，含有载体和表达盒的构建体的形成是将本发明的核酸片段插入自身带有调节序列的载体，于是，当核酸片段插入载体时表达盒得以形成。带有调节序列的载体可以在市场上购得，其使用方法为本领域所知。
III.本发明的免疫组合物和疫苗本发明提供用于动物体后能够产生抗病原学上与严重急性呼吸道综合征有关的病毒的免疫反应的免疫组合物和疫苗。免疫反应可以是体液免疫反应或细胞免疫反应。
本发明的免疫组合物可以包括佐剂和核酸、多肽、肽片段、肽模拟物、偶联蛋白和免疫肽或它们的任何联合。免疫组合物可以含有与本发明的多肽、肽片段、肽模拟物、偶联蛋白和免疫肽以非化学方法连接的佐剂。免疫组合物可以含有与本发明的多肽、肽片段、肽模拟物、偶联蛋白和免疫肽以化学方法连接的佐剂。本发明的免疫组合物也可含有药学上可接受的稀释液或载体。
免疫组合物可以通过常规的方法制备，特别是，组合物中的核酸、多肽、肽片段、肽模拟物、偶联蛋白和免疫肽或它们的任何联合可以与药学上可接受的稀释液或载体结合。药学上可接受的稀释液或载体的例子包括水或盐溶液，如磷酸盐缓冲液(PBS)。通常，根据给药的方式和途径以及标准的药学实践来选择药学上可接受的稀释液。药学上可接受的稀释液和载体以及所有那些药学组合物必需用到的东西在本领域的标准参考书Remington′s PharmaceuticalSciences中有描述。
免疫组合物可以含有这里描述的和本领域所知的佐剂。铝化合物可以被用作佐剂，这些铝化合物包括氢氧化铝、磷酸铝、氢氧化磷酸铝及其类似物。核酸、多肽、肽片段、肽模拟物、偶联蛋白和免疫肽或它们的任何联合可以通过标准的方法吸附或沉淀于铝化合物。其他佐剂包括聚磷腈(WO 95/2415)，DC-chol(3-β-[N-(N′，N′-二甲基氨基甲烷)氨基甲酰基]胆固醇)(美国专利号5,283,185和WO96/14831)，QS-21(WO 88/9336)和来自ImmunoChem(Hamilton，Montana)的RIBI。含非甲基化的CpG二核苷酸(″CpG″)的免疫刺激性寡核苷酸在本领域已知被用作系统或粘膜给药的佐剂(WO 96/02555，EP 468520，等，J.Immunol.，160870(1998)；McCluskie和Davis，J.Immunol.，1614463(1998)。当CpG被配制进免疫组合物或疫苗时，通常在自由溶液中与自由抗原一起给药。Immunol.，1614463(1998))或与抗原共价连接(PCT Publication No.WO 98/16247)，或与载体如氢氧化铝配制后给药。(Brazolot-Millan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，9515553(1998)).
本发明也提供包括本发明的核酸、多肽、肽片段、肽模拟物、偶联蛋白和免疫肽或它们的任何联合的疫苗。这些疫苗可以用这里所描述的方法或疫苗领域所知的方法配制。例如，可以根据本领域所知的方法构建出表达本发明的多肽、肽片段或偶联蛋白的病毒疫苗，用作病毒载体的例子可以包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、金丝雀疱疹病毒和类似病毒。疫苗也可被制成脂质体，其配制方法为本领域技术人员所知。见，LiposomesA Practical Approach.RRCNew Ed，IRL press(1990)。
本发明也提供表达本发明的多肽、肽片段或偶联蛋白的基于核酸的疫苗。例如核酸疫苗可表达SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、61-63多肽或SEQ ID NO1的片段。用编码本发明的多肽、肽片段或偶联蛋白的核酸构建体接种动物可以诱导出对被编码抗原的体液或细胞介导的免疫反应，它被认为是骨髓来源的专业抗原递呈细胞被核酸构建体转染，被编码抗原经转录和翻译生成诱导特异性反应的免疫源性多肽所致。核酸疫苗的一个特征是它能诱导出很强的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。这种反应是由于核酸编码的多肽在被转染的细胞内合成的缘故。此外，在细菌内生产的核酸构建体富含能被巨噬细胞认作外来物质的非甲基化的CpG核苷酸，因此，巨噬细胞诱发能够强化继发免疫的天然免疫，所以，核酸疫苗即使在无佐剂的情况下也很有效。
将表达盒直接注射入活宿主细胞，使许多细胞得以转化从而表达被导入的核酸和表达基因产物。被转染的细胞可以将表达的抗原片段传呈到细胞表面与I类和II类主要组织相容抗原结合成复合物。
在将核酸构建体注射动物、包括人前，通过诱导肌肉降解可以更有效地将核酸构建体导入细胞(Vitadello等，Hum.Gene.Ther.，511(1994)；Danko and Wolff，Vaccine，121499(1994)；Davis等，Hum.Gene.Ther.，4733(1993))。例如，这样的处理被认为可以提高转染效率到40倍。两种最常用的肌肉坏死剂(myonecrotic)是局部麻醉药布比卡因和心脏毒素(Danko and Wolff，Vaccine，121499(1994)；Davis等，Hum.Gene.Ther，4733(1993))。其他许多技术也被用于将核酸构建体转导入肌肉中，这些技术包括逆转录病毒载体、腺病毒载体和脂质体。但是，对于外源核酸的转导和核酸在细胞内的表达来说，直接注射裸核酸是乎是这些导入机理中最有效的。
核酸构建体可以与药学上可接受的载体一起用药。药学上可接受的载体为生物学上相容的适合于用于人或其他哺乳动物的介质，如生理盐水。治疗有效量为核酸构建体能够在被给药的动物中引起免疫反应的量(如，加强T细胞反应或抗体产生)，正如医疗领域所熟知，对任何一个病人的剂量取决于许多因素，包括病人的身高、体表面积、年龄、所要使用的特殊化合物、性别、给药时间和途径、一般健康状况和其他同时使用的药物。剂量是可以变化的，但是核酸构建体的优选剂量约为106到1012拷贝的核酸构建体。如果需要，该剂量可以重复给药。
核酸构建体的给药可以有许多途径，其例子包括肌肉内、静脉内、肠外、皮内、鼻内和皮下注射，这些途径都曾在鸡体内引起抗流感病毒血凝素(HA)的免疫反应(见Pardoll and Beckerkleg的综述，Immunity 3(1995)，165-169)。基于核酸的疫苗也可通过聚合体、生物降解微粒或微囊导入载体，将其大小优化到吞噬细胞、如巨噬细胞吞噬的最佳大小。例如，可以使用直径为1-10μm的PLGA(poly-lacto-co-glycolide)微粒。核酸构建体包裹在这些微粒中，被巨噬细胞吞噬并在细胞内逐渐发生生物降解，于是释放出核酸构建体。一旦释放出来，核酸构建体会在细胞内进行表达。另一个使核酸构建体进入细胞的途径是通过使用脂质体，脂质体可以通过标准方法制备。核酸构建体可单独、也可与组织特异性抗体一道结合于这些导入载体。可选性地，也可制备核酸构建体通过静电或共价力附着于多聚-L赖氨酸的偶联分子，多聚-L-赖氨酸能够与靶细胞上的受体的配体结合(Cristano等(1995)，J.Mol.Med.73，479)。可选性地，淋巴组织特异靶向性可以通过使用淋巴组织特异的转录调节元件(TRE)来实现，如B淋巴细胞、T淋巴细胞或树突状细胞特异性TRE，淋巴细胞特异性TRE为已知(见Thompson等，Mol.Cell.Biol.，121043(1992)；Toll等J.Exp.Med.，1771663(1993)；Penix等，J.Exp.Med.，1781483(1993))。
本发明也提供基于微生物的疫苗。一般来讲，这些疫苗涉及到被表达本发明的多肽、肽片段或偶联蛋白的核酸构建体转化了的微生物。例如，单核细胞增生李斯特氏菌被用作载体诱导T细胞免疫，因为它能感染抗原递呈细胞，而且因为其感染为粘膜感染，见Lieberman和Frankel，Vaccine，202007-10(2002)。所以，可以用多肽、肽片段或偶联蛋白的核酸构建体转染李斯特菌，去诱导针对引起严重急性呼吸系统综合征的冠状病毒的体液免疫反应。可以根据本领域报道的方法制备高度减毒的李斯特菌，见Lieberman和Frankel，Vaccine，202007-10(2002)。沙门氏菌也可被用作载体诱导针对引起严重急性呼吸系统综合征的冠状病毒的细胞毒性T淋巴细胞反应。见Pasetti等，Infect Immun.，704009(2002)。
免疫组合物或疫苗可以通过疫苗领域的常规途径给药。例如，免疫组合物或疫苗可以通过口服或静脉滴注，或皮下、肌内、肠道外、肛内、阴道内、鼻内、胃肠道内、气管内或心血管内给药。给药途径的选择取决于诸多因素，如活性原理的性质；多肽、肽片段、肽模拟物、偶联蛋白、免疫肽、DNA疫苗的成分；或与以上提到的分子结合的佐剂。免疫组合物的给药可以是单剂量的或一个剂量在一定时间内一次或几次给药。合适的剂量根据因素的不同而变化，这些因素包括被处理的个体(成人或小孩)、免疫组合物或抗原本身、给药的方式和频率、有否佐剂、如有，佐剂的类型和预期的作用(如保护或治疗)，将由本领域的技术人员来决定。
IV.本发明的抗体和适体本发明提供与SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、60、61、62、63所示的氨基酸序列或SEQ ID NO1的片段、或其保守性变异体结合的抗体。这些抗体可以用于诊断、免疫预防和治疗严重急性呼吸道综合征(SARS)。在某些实施方案中，抗体与具SEQ ID NO58或59序列的肽结合。与肽P540(SEQ ID NO59)结合的抗体高度有效，即使在高倍稀释后仍能检测出刺突多肽。例如，P540抗体稀释1∶10000倍后仍能检测出刺突多肽。
抗体可以通过用完整的目的多肽或肽片段作为免疫抗原来制备。用于免疫的多肽或肽片段可以经cDNA翻译或经合成而来。如有必要，多肽或肽片段可以结合到载体蛋白上，这些通常使用的以化学方式连接到肽上的载体蛋白包括匙孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白和破伤风毒素。偶联蛋白可以用于免疫动物(如小鼠、大鼠或兔子)。
如有必要，多克隆或单克隆抗体可以进一步被纯化，例如，与结合有用于产生抗体的多肽或肽片段的基质相结合，并从该基质上洗脱下来。本领域的技术人员懂得免疫领域常用的纯化和/或浓缩多克隆抗体和单克隆抗体的技术(见Coligan等，Unit9，Current protocolin Immunology，Wiley Interscience，1991，通过引用结合)。
通过抗独特型技术产生一个模拟抗原决定簇的单克隆抗体也是可能的。例如，抗第一单克隆抗体的抗独特型将含有高变区的结合功能区，该功能区是第一单克隆抗体所结合的决定簇的“镜影”。
适合与多肽或肽片段结合的抗体至少对多肽的某区域的一部分是特异的。例如，本领域的技术人员能够用肽片段去产生本发明中合适的抗体。本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体和多克隆和单克隆抗体的片段。
制备多克隆抗体为本领域的技术人员所熟知(见Green等，Production of Polyclonal Antisera，in Immunochemical Protocols(Manson，ed.)，pages 1-5(Humana Press 1992)；Coligan等，Productionof Polyclonal Antisera in Rabbits，Rats，Mice and Hamsters，in CurrentProtocols in Immunology，section 2.4.1(1992)，通过引用结合于此)。例如，多肽或肽片段被注射入宿主动物，优选地，根据预先决定的实施方案，再进行一次或多次加强免疫，阶段性对动物进行采血。抗多肽或肽片段的特异性抗体可以用结合有多肽或肽片段的合适的固体支持体进行亲和层析，从而将抗体从这些抗血清中纯化出来。
单克隆抗体的制备同样是常规性的(见Kohler & Milstein，Nature，256495(1975)；Coligan等，sections 2.5.1-2.6.7；和Harlow等，AntibodiesA Laboratory Manual，page 726(Cold Spring Harbor Pub.1988))，通过引用结合与此。简单地讲，单克隆抗体可以通过用含有抗原的组合物注射小鼠，从采集的血清标本中确认抗体存在后，取其脾获取B淋巴细胞，将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，克隆杂交瘤细胞，筛选产生针对抗原的抗体的阳性克隆，从杂交瘤细胞的培养基中分离抗体。可以通过多种已知的方法从杂交瘤细胞的培养基中分离纯化抗体。这些分离技术包括用蛋白A琼脂糖进行亲和层析、分子排阻层析和离子交换层析。(见Coligan等，sections 2.7.1-2.7.12和sections 2.9.1-2.9.3；Barnes等，Purification ofImmunoglobulin G(IgG)，in Methods in Molecular Biology，Vol.10，pages 79-104(Humana Press 1992))在体外和体内扩增单克隆抗体的方法为本领域的技术人员所熟知，体外扩增可以在合适的培养基中，如Dulbecco’s Modified Eagle Medium和PRMI 1640培养基，适量加入哺乳动物血清如胎牛血清和微量元素，并且加入维持生长的补充物质如正常小鼠的腹腔渗出细胞，脾细胞和骨髓巨噬细胞。体外生产提供相对纯的抗体制剂，并可以加大规模以大量生产需要的抗体。大规模杂交瘤培养可以通过在气升式反应器、连续搅拌反应器、或固定化或截留细胞培养来实现。体内扩增可以通过将细胞克隆注射入与父代细胞组织相容的哺乳动物体内，例如，osyngeneic小鼠体内，使产生抗体的肿瘤得以生长。任选注射前先用碳氢化合物，特别是油类如四甲基十五烷激活动物，一至三周后从动物的体液中回收单克隆抗体。
抗体也可通过噬菌体表面展示技术来制备，在一个例子中，用抗原，如本发明的多肽或肽片段免疫一个生物体，从被免疫的生物体的脾内分离淋巴细胞，从淋巴细胞中提取总RNA，含于总RNA中的mRNA被逆转录成互补的脱氧核糖核苷酸(cDNA)。编码免疫球蛋白的轻链和重链可变区的cDNA用聚合酶链反应(PCR)进行括增，产生单链的抗体可变区片段(scFV)，轻链和重链的扩增产物可以通过剪切重叠延伸PCR产生完整的序列然后连接入合适的载体中，用编码scFV的载体转化大肠杆菌，然后再用一个辅助噬菌体对其进行转染，产生表面上带有抗体的噬菌体。可选性地，为了产生一个完整的抗原结合片段(Fab)，重链扩增产物可以与编码噬菌体外膜蛋白的核酸序列融合，轻链括增产物可以克隆进一个合适的载体中，用表达轻链括增产物的载体转化表达与噬菌体外膜蛋白融合的重链的大肠杆菌，轻链和重链间的二硫键连接在大肠杆菌的外周胞质中形成。该方法的结果是产生一个大至109克隆的抗体库，抗体库的大小还可以通过增加对来自相同或不同的生物体附加免疫的免疫反应来括增到1018个噬菌体。识别特异性抗原的抗体可以通过淘选的方法来筛选，简单地说，将完整的抗体库暴露于期望能与抗体结合的固化的抗原，不产生与抗原结合的抗体的噬菌体将被洗去，表达与抗原结合的抗体的噬菌体将结合到固化的抗原上，这些噬菌体将被洗脱下来并在大肠杆菌内括增。可以重复该过程以富集表达与抗原特异性结合的抗体的噬菌体群。在分离出表达与抗原特异性结合的抗体的噬菌体后，含有编码抗体的序列的载体可以从噬菌体颗粒中提取出来，再次被克隆进一个合适载体以产生可溶性抗体。在另一个例子中，人噬菌体文库可被用于筛选抗体，如与SARS-CoV的刺突蛋白结合的单克隆抗体。简单地讲，从感染或未感染SARS-CoV的人体分离脾细胞，用以上描述和本领域所知的方法创建人噬菌体文库，这些方法可以用来获取与SARS-CoV的刺突蛋白结合的人单克隆抗体。噬菌体表面展示技术用于分离抗原和抗体的方法为本领域所知并已有描述(见Gram等，Proc.Natl.Acad.Sci.，893576(1992)；Kay等，Phage display of peptides and proteinsAlaboratory manual.San DiegoAcademic Press(1996)；Kermani等，Hybrid，14323(1995)；Schmitz等，Placenta，21Suppl.AS106(2000)；Sanna等，Proc.Natl.Acad.Sci.，926439(1995))。
本发明的抗体可以来自于“人源化”的单克隆抗体，人源化单克隆抗体通过将鼠免疫球蛋白的重链和轻链的互补决定区转移到人的可变区，然后用人的残基取代鼠框架区的残基而得。来自人源化单克隆抗体的抗体成分的使用，避免了鼠恒定区的免疫源性引起的潜在问题。有关克隆鼠免疫球蛋白可变区的一般技术已有描述(见Orlandi等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，863833(1989)通过引用整体结合于此)。产生人源化单克隆抗体的技术的描述见Jones等.，Nature，321522(1986)；Riechmann等，Nature，332323(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534(1988)；Carter等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，894285(1992)；Sandhu，Crit.Rev.Biotech.，12437(1992)；和Singer等，J.Immunol.，1502844(1993)，它们通过引用结合于此。
另外，本发明的抗体可以来自人单克隆抗体，这些抗体从被基因工程技术改造过的能针对抗原刺激产生特异性的人抗体的转基因鼠获得。在这一技术中，人重链和轻链基因座被导入其内源性重链和轻链的基因座被定向破坏了的胚胎干细胞来源的小鼠中，该转基因鼠能合成人抗原特异的人抗体，该小鼠可以被用于生产分泌人抗体的杂交瘤细胞。从转基因鼠获取人抗体的方法被描述在Green等.，Nature Genet.，713(1994)；Lonberg等，Nature，368856(1994)；和Taylor等，Int.ImmunoL.6579(1994)，它们通过引用结合于此。
本发明的抗体片段可以通过蛋白酶水解抗体或通过编码片段的DNA在大肠杆菌中的表达来制备。可以通过常规的方法用胃蛋白酶或木瓜酶对完整抗体进行消化来获得抗体片段。例如，通过用胃蛋白酶切割抗体可以得到一个5S的F(ab)2片段，该片段用硫代还原因子进一步切割，并可选性地用封闭基团封闭由于二硫键被切割产生的巯基基团，会产生3.5S的Fab单价片段。可选性地，通过用胃蛋白酶切割也可直接产生两个单价Fab和一个Fc片段。这些方法已有描述(见，美国专利号4,036,945；4,331,647；和6,342,221，和含于此的参考；Porter，Biochem.J.，73119(1959)；Edelman等，Methods in Enzymology，Vol.1，page 422(Academic Press 1967)和Coligan等at sections 2.8.1-2.8.10and 2.10.1-2.10.4)。
其他切割抗体的方法，如分离重链而形成单价轻链片段的方法，进一步切割片段的方法，或其他酶学的、化学的或基因技术的方法也可使用，只要形成的片段能够与完整抗体所识别的抗原结合。
例如，Fv片段含连接在一起的VH和VL链，这种连接可以是非共价连接的(Inbar等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，692659(1972))，可变链可以可选性地通过分子内二硫键连接或通过化学物质如戊二醛交叉连接(Sandhu，Crit.Rev.Biotech.，12437(1992))。优选Fv片段的VH和VL链通过肽键连接。这些单链抗原偶联蛋白(sFv)可以通过构建一个含编码VH和VL链、中间以寡核苷酸相连的结构基因，将该结构基因插入表达载体，再将该载体导入宿主细胞，如大肠杆菌，该重组的宿主细胞即合成含有中间以连接肽相连的两个V功能区的单一多肽链。有关产生sFvs的方法见描述(Whitlow等，MethodsACompanion to Methods in Enzymology，Vol.2，page 97(1991)；Bird等，Science，242423(1988)，Ladner等，U.S.patent No.4,946，778；Pack等，Bio/Technologv，111271(1993)和Sandhu，Crit.Rev.Biotech.，12437(1992)).抗体片段的另一种形式是形成单一互补决定区(CDR)的肽，CDR肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码目标抗体的基因来获得。制备这样的基因可以通过，例如，用聚合酶链反应从抗体产生细胞的RNA中合成可变区(Larrick等，MethodsACompanion to Methods in Enzymology，Vol.2，page 106(1991))。
本发明的抗体可以与某种毒素结合，这样的抗体可以用于治疗感染了在病原学上与严重急性呼吸系统综合征相关的病毒的动物，包括人。例如，与在病原学上与严重急性呼吸系统综合征相关联的冠状病毒的刺突蛋白结合的抗体被连接上破伤风毒素，用于感染有上述病毒的动物，结合有毒素的抗体与被感染细胞表面的刺突蛋白结合，然后将被感染细胞杀灭。
本发明的抗体可以与某种检测标记物结合，这样的抗体可以用于诊断试验以确定动物，如人，是否感染了SARS-CoV。检测标记物的例子有荧光蛋白(即绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白)。荧光标记(即荧光素异硫氰酸、罗丹明、德克萨斯红)、放射标记(即3H、32P、125I)、酶(β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、β-葡萄醛酸糖苷酶碱性磷酸酶)，或亲和标记(即亲和素、生物素、链霉亲和素)。抗体与检测标记物连接的方法为本领域所知。见Harlow等，AntibodiesA Laboratory Manual，page 319(Cold Spring HarborPub.1988)。
本发明也提供本发明多肽或肽片段的适体。本发明的适体可以是肽适体或核酸适体。肽适体为与本发明的多肽或肽片段结合的肽，其结合力常与单克隆抗体-抗原复合物相当。类似，核酸适体为与本发明的多肽或肽片段有很强结合力的核酸，其结合力常与单克隆抗体-抗原复合物相当。
在一个例子中，核酸适体可以通过使用随机寡核苷酸序列文库而分离得到。筛选该文库以确定某一个寡核苷酸序列与本发明的S多肽和肽片段结合。结合的寡核苷酸从固化的多肽或肽片段上洗脱下来，然后用PCR进行扩增。该过程可以重复多次以筛选出对本发明的多肽和肽片段具有高结合力的适体。然后确定编码该适体的核酸序列，并将其克隆进入一个合适的载体中以有利于该适体的生产和保存。
肽适体可以通过mRNA展示筛选含有启动子、起始密码子和编码随机肽的核酸序列的文库来获得。在某些实施方案中，该DNA文库还含有编码组氨酸标记物的核酸片段。该文库用合适的聚合酶，如T7RNA聚合酶进行转录。转录完成后一个含嘌呤霉素的多聚A接头被加到新合成的mRNA的3’端。当这些mRNA在体外翻译后，新生成的肽与嘌呤霉素接头共价连接形成mRNA-肽的融合分子。用Ni-NTA琼脂糖和oligo-dT纤维素对mRNA-肽的融合分子进行纯化。再对融合分子的mRNA部分进行逆转录。然后，用双链的DNA/RNA-肽融合分子与本发明的肽或肽片段共孵育，未结合的融合分子将被洗去，结合的融合分子从固化的肽或肽片段上洗脱下来，再用PCR进行扩增，该过程可以重复进行以筛选出与本发明的肽或肽片段有高度结合力的适体。然后可确定编码该适体的核酸序列，并将其克隆进合适的载体。制备肽适体的方法已有描述(见(Wilson等，Proc.Natl.Acad.Sci.，983750(2001))。所以，本发明提供能够识别本发明的肽和肽片段的适体。
V.本发明的药用组合物本发明提供含有与SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、60、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO1的片段或它们的保守变异体结合的抗体以及药学上可接受的载体的药用组合物。在某些实施方案中，抗体与具有SEQ ID NO58或59序列的肽结合。与肽P540(SEQ ID NO59)结合的抗体高度有效，即使在高倍稀释的条件下也能检测出刺突多肽。例如，P540抗体在1∶10000倍稀释的条件下仍然可以检出刺突多肽。
本发明的药用组合物可被制备成多种形式，包括片剂、硬或软的明胶胶囊、水溶液剂、混悬液、脂质体和其他缓释制剂，如有形高分子胶。也可做成一种口服剂量制剂形式，使抗体在从胃内排入肠道后释放出来。这样的制剂在美国专利号6,306,434上和含于本文的参考文献中有描述。
口服的液体药用组合物可以是这些形式，例如，水性或油性的混悬液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂，或使用前用水或其他合适介质调和后使用的干燥产品。这些液体药用组合物可以含有常规添加剂，如悬浮剂、乳化剂、非水性介质(它们可包括食用油)或防腐剂。
抗体可被做成肠外给药的制剂(例如，通过注射，如一次性注射或连续滴注)，以单位剂量的形式装于安瓿、预灌装的注射器、小容量的滴注容器或多剂量的容器中，并加入保存剂。该药用组合物可以是悬液、溶液、或油性或水性乳剂，并可以含有悬浮剂、稳定剂和/或分散剂这样的成型剂。适合于肛内用药的制剂可被制备成单位剂量的栓剂。合适的载体包括本领域常用的盐水和其他物质。
对于吸入给药，抗体可以用吹入器、雾化器、压力包装或方便的导入气体喷雾的方式很容易地导入。压力包装可以带有合适的推进剂如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳和其他合适气体。在用加压气雾剂的情况下，可以通过提供气阀来导入计量量来确定剂量单位。
可选性地，对于吸入或吹入给药，抗体可以是干粉形式的组合物，例如，调节剂和合适的干粉基质如乳糖或淀粉的粉状混合物。粉状混合物可以以单位剂量的形式装于胶囊和药筒中，或例如明胶或泡罩包装中，药粉可以借助吸入器或吹入器从这些容器中给药。对于鼻腔给药，抗体可以通过液体喷雾，例如通过一个塑料喷雾器。
本发明的药用组合物也可含有其他成份，如调味剂、着色剂、抗微生物剂或防腐剂。用于治疗的抗体的量不仅将因为所选载体不同而不同，而且会因用药途径、被治疗的病情、病人的年龄和病人的状况不同而不同，这是可以理解的。最终可能由医疗提供者决定合适剂量。另外，药用组合物可以被制成单一单位剂量形式。
VI.针对严重急性呼吸系统综合征的动物的免疫、治疗和诊断的方法本发明提供了免疫动物以抵抗严重急性呼吸系统综合征的方法。该方法涉及到给予动物有效治疗剂量的与SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、60、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO1的片段或它们的变异体结合的抗体；给予动物有效治疗剂量的免疫组合物；给予动物有效治疗剂量的病毒疫苗；给予动物有效治疗剂量的核酸疫苗。动物可以是哺乳动物，如人。给予疫苗和免疫组合物的方法在这里已有描述并且为本领域所知。
根据本发明，也可通过被动免疫治疗的方法治疗感染了SARS-CoV的动物。例如，将与SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、60、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO1的片段或它们的保守性变异体结合的抗体给予感染了SARS-CoV的动物，如人。这样的用药方法可能适合于病人免疫受到抑制，不能调动起有效的抗SARS-CoV免疫，或对疫苗或免疫组合物不反应的情况。
本发明提供诊断动物是否患有严重急性呼吸系统综合征的方法，该方法涉及到用与SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、60、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO1的片段或它们的保守性变异体结合的抗体与来自该动物的生物标本接触，如组织样品、血、粘液或唾液，确定该抗体是否与生物样品结合。利用抗体来检测生物标本中是否有抗原存在为本领域所熟知。简单地讲，本发明的抗体可以被固定在一个表面，然后生物标本与固化的抗体接触以使标本中的抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物，可选性地洗涤标本除去未结合的物质，本发明的第二抗体结合有一个检测标记物，如酶或放射性标记物，能与抗原抗体复合物结合使酶或放射性标记物固定到表面。然后可检测该检测标记物来决定生物标本中是否含有抗原。在另一个例子中，生物标本可以被固定于一个表面，然后，连接有检测标记物的本发明的抗体与固化的生物标本接触，并洗去未结合物质，通过检测检测标记物的存在以决定是否生物标本中是否含有抗原。这些试验的例子为本领域所熟知，包括酶联免疫吸附试验，放射性免疫试验和类似试验。
基于核酸的方法也可用于诊断严重急性呼吸系统综合征。在一个例子中，聚合酶链反应(PCR)可以被用于诊断SARS-CoV感染。简单地讲，从动物体内获得生物标本如组织标本、血液、粘液或唾液，用常规方法，如有机提取法提取标本中的核酸，提取的核酸与能够退火连接到编码SARS蛋白的核酸序列的正向和反向引物、聚合酶、核苷酸和含有允许聚合酶以SARS核酸为模板延伸正向和反向引物的成份的典型缓冲液混合，然后检测扩增出的正向和反向引物之间的DNA的存在以确定标本中是否含有SARS来源的核酸。核酸杂交技术，如Northern和Southern印迹也可用于检测生物标本中SARS核酸的存在。
VII.试剂盒本发明提供含有包装材料和与SEQ ID NO1、13、14、15、45、46、或47、58、59、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO1的片段或它们的保守性变异体结合的抗体的试剂盒。试剂盒可以含有注射器以将试剂盒内的抗体注射给动物，如人。在另一个实施方案中，本发明提供含有包装材料和与SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、60、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO1的片段或它们的保守性变异体结合的抗体的试剂盒，并被做成用于动物，如人的制剂。在某些实施方案中，抗体与SEQ ID NO59的氨基酸序列结合。在其他实施方案中，抗体与SEQ ID NO58的氨基酸序列结合。这样的试剂盒可以含有注射器以方便将试剂盒所含的抗体注射给动物，如人。
本发明提供含有包装物质和含有编码SEQ ID NO1、13、14、15、45、46、或47、58、59、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQID NO1的片段或它们的保守性变异体的DNA分子或表达载体的DNA疫苗。该试剂盒也可含有使用DNA疫苗的装置(如注射器和基因枪)以方便将试剂盒内含有的疫苗用于动物，如人。
本发明也提供含有包装物质和包括具有SEQ ID NO1、13、14、15、45、46、或47、58、59、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQID NO1的片段或它们的保守性变异体的多肽的疫苗组合物。该试剂盒也可含有疫苗使用装置(如注射器)以方便将试剂盒内含有的疫苗用于动物，如人。
本发明提供一个含有包装物质和具有SEQ ID NO1、13、14、15、45、46、或47、58、59、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQID NO1的片段或它们的保守性变异体的多肽、用于检测SARS-CoV感染的试剂盒。多肽可以被固定在一个固体支持体上。这样的试剂盒可以被用于检测感染动物或人的血清中直接抗SARS-CoV的抗体。该试剂盒也包含有检测这些抗体与S多肽结合的方法。VIII.Tor2SARS-CoV病毒分离株的全长的刺突(S)蛋白(氨基酸1-1255)的氨基酸序列MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTTTDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCAFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLGADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTEVMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQDRNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRSF
IEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYTAALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFITQRNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIINNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYVWLGFIAGLIAIVMVTILLCCMTSCCSCLKGACSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO1)IX.全长的刺突(S)蛋白(氨基酸1-3768)的核酸序列ATGTTTATTTTCTTATTATTTCTTACTCTCACTAGTGGTAGTGACCTTGACCGGTGCACCACTTTTGATGATGTTCAAGCTCCTAATTACACTCAACATACTTCATCTATGAGGGGGGTTTACTATCCTGATGAAATTTTTAGATCAGACACTCTTTATTTAACTCAGGATTTATTTCTTCCATTTTATTCTAATGTTACAGGGTTTCATACTATTAATCATACGTTTGGCAACCCTGTCATACCTTTTAAGGATGGTATTTATTTTGCTGCCACAGAGAAATCAAATGTTGTCCGTGGTTGGGTTTTTGGTTCTACCATGAACAACAAGTCACAGTCGGTGATTATTATTAACAATTCTACTAATGTTGTTATACGAGCATGTAACTTTGAATTGTGTGACAACCCTTTCTTTGCTGTTTCTAAACCCATGGGTACACAGACACATACTATGATATTCGATAATGCATTTAATTGCACTTTCGAGTACATATCTGATGCCTTTTCGCTTGATGTTTCAGAAAAGTCAGGTAATTTTAAACACTTACGAGAGTTTGTGTTTAAAAATAAAGATGGGTTTCTCTATGTTTATAAGGGCTATCAACCTATAGATGTAGTTCGTGATCTACCTTCTGGTTTTAACACTTTGAAACCTATTTTTAAGTTGCCTCTTGGTATTAACATTACAAATTTTAGAGCCATTCTTACAGCCTTTTCACCTGCTCAAGACATTTGGGGCACGTCAGCTGCAGCCTATTTTGTTGGCTATTTAAAGCCAACTACATTTATGCTCAAGTATGATGAAAATGGTACAATCACAGATGCTGTTGATTGTTCTCAAAATCCACTTGCTGAACTCAAATGCTCTGTTAAGAGCTTTGAGATTGACAAAGGAATTTACCAGACCTCTAATTTCAGGGTTGTTCCCTCAGGAGATGTTGTGAGATTCCCTAATATTACAAACTTGTGTCCTTTTGGAGAGGTTTTTAATGCTACTAAATTCCCTTCTGTC
TATGCATGGGAGAGAAAAAAAATTTCTAATTGTGTTGCTGATTACTCTGTGCTCTACAACTCAACATTTTTTTCAACCTTTAAGTGCTATGGCGTTTCTGCCACTAAGTTGAATGATCTTTGCTTCTCCAATGTCTATGCAGATTCTTTTGTAGTCAAGGGAGATGATGTAAGACAAATAGCGCCAGGACAAACTGGTGTTATTGCTGATTATAATTATAAATTGCCAGATGATTTCATGGGTTGTGTCCTTGCTTGGAATACTAGGAACATTGATGCTACTTCAACTGGTAATTATAATTATAAATATAGGTATCTTAGACATGGCAAGCTTAGGCCCTTTGAGAGAGACATATCTAATGTGCCTTTCTCCCCTGATGGCAAACCTTGCACCCCACCTGCTCTTAATTGTTATTGGCCATTAAATGATTATGGTTTTTACACCACTACTGGCATTGGCTACCAACCTTACAGAGTTGTAGTACTTTCTTTTGAACTTTTAAATGCACCGGCCACGGTTTGTGGACCAAAATTATCCACTGACCTTATTAAGAACCAGTGTGTCAATTTTAATTTTAATGGACTCACTGGTACTGGTGTGTTAACTCCTTCTTCAAAGAGATTTCAACCATTTCAACAATTTGGCCGTGATGTTTCTGATTTCACTGATTCCGTTCGAGATCCTAAAACATCTGAAATATTAGACATTTCACCTTGCGCTTTTGGGGGTGTAAGTGTAATTACACCTGGAACAAATGCTTCATCTGAAGTTGCTGTTCTATATCAAGATGTTAACTGCACTGATGTTTCTACAGCAATTCATGCAGATCAACTCACACCAGCTTGGCGCATATATTCTACTGGAAACAATGTATTCCAGACTCAAGCAGGCTGTCTTATAGGAGCTGAGCATGTCGACACTTCTTATGAGTGCGACATTCCTATTGGAGCTGGCATTTGTGCTAGTTACCATACAGTTTCTTTATTACGTAGTACTAGCCAAAAATCTATTGTGGCTTATACTATGTCTTTAGGTGCTGATAGTTCAATTGCTTACTCTAATAACACCATTGCTATACCTACTAACTTTTCAATTAGCATTACTACAGAAGTAATGCCTGTTTCTATGGCTAAAACCTCCGTAGATTGTAATATGTACATCTGCGGAGATTCTACTGAATGTGCTAATTTGCTTCTCCAATATGGTAGCTTTTGCACACAACTAAATCGTGCACTCTCAGGTATTGCTGCTGAACAGGATCGCAACACACGTGAAGTGTTCGCTCAAGTCAAACAAATGTACAAAACCCCAACTTTGAAATATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCTGACCCTCTAAAGCCAACTAAGAGGTCTTTTATTGAGGACTTGCTCTTTAATAAGGTGACACTCGCTGATGCTGGCTTCATGAAGCAATATGGCGAATGCCTAGGTGATATTAATGCTAGAGATCTCATTTGTGCGCAGAAGTTCAATGGACTTACAGTGTTGCCACCTCTGCTCACTGATGATATGATTGCTGCCTACACTGCTGCTCTAGTTAGTGGTACTGCCACTGCTGGATGGACATTTGGTGCTGGCGCTGCTCTTCAAATACCTTT
TGCTATGCAAATGGCATATAGGTTCAATGGCATTGGAGTTACCCAAAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAACAAATCGCCAACCAATTTAACAAGGCGATTAGTCAAATTCAAGAATCACTTACAACAACATCAACTGCATTGGGCAAGCTGCAAGACGTTGTTAACCAGAATGCTCAAGCATTAAACACACTTGTTAAACAACTTAGCTCTAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTGCTAAATGATATCCTTTCGCGACTTGATAAAGTCGAGGCGGAGGTACAAATTGACAGGTTAATTACAGGCAGACTTCAAAGCCTTCAAACCTATGTAACACAACAACTAATCAGGGCTGCTGAAATCAGGGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCTGAGTGTGTTCTTGGACAATCAAAAAGAGTTGACTTTTGTGGAAAGGGCTACCACCTTATGTCCTTCCCACAAGCAGCCCCGCATGGTGTTGTCTTCCTACATGTCACGTATGTGCCATCCCAGGAGAGGAACTTCACCACAGCGCCAGCAATTTGTCATGAAGGCAAAGCATACTTCCCTCGTGAAGGTGTTTTTGTGTTTAATGGCACTTCTTGGTTTATTACACAGAGGAACTTCTTTTCTCCACAAATAATTACTACAGACAATACATTTGTCTCAGGAAATTGTGATGTCGTTATTGGCATCATTAACAACACAGTTTATGATCCTCTGCAACCTGAGCTCGACTCATTCAAAGAAGAGCTGGACAAGTACTTCAAAAATCATACATCACCAGATGTTGATCTTGGCGACATTTCAGGCATTAACGCTTCTGTCGTCAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTCGCTAAAAATTTAAATGAATCACTCATTGACCTTCAAGAATTGGGAAAATATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATGTTTGGCTCGGCTTCATTGCTGGACTAATTGCCATCGTCATGGTTACAATCTTGCTTTGTTGCATGACTAGTTGTTGCAGTTGCCTCAAGGGTGCATGCTCTTGTGGTTCTTGCTGCAAGTTTGATGAGGATGACTCTGAGCCAGTTCTCAAGGGTGTCAAATTACATTACACATAA(SEQ ID NO2)实施例1刺突蛋白的克隆编码全长刺突蛋白的核酸序列用重叠聚合酶链反应(PCR)的方法获得。含有刺突蛋白的重叠克隆从British Columbia Cancer Agency(Vancouver，British Columbia)获得。以下引物在PCR反应中被用于扩增编码全长SARS-CoV刺突蛋白的核酸序列克隆1正向引物5′-AGTCGGA TCCGGT AGG CTT ATC ATT AGA G-3′(SEQ ID NO3)；反向引物5′-CCA TCA GGG GAG AAA GGC AC-3(SEQ ID NO4)。克隆2正向引物5′-GTG CCT TTC TCC CCT GAT GG-3′(SEQ ID NO5)；反向引物5′-GAA GAG CAG CGC CAG CAC C-3′(SEQ ID NO6)。克隆3正向引物5′-GGT GCT GGC GCT GCT CTT C-3′(SEQ IDNO7)；反向引物5′-A CTGTCT AGAGTT CGT TTA TGT GTAATG-3(SEQ ID NO8)。
通过重叠PCR扩增以上引物对之间的核酸片段所产生的核酸片段含有与严重急性呼吸系统综合征病原学相关的病毒(SARS-CoV)的刺突蛋白的1到1255个氨基酸残基。带有下划线的引物序列代表用于将扩增片段克隆到pCDN3(+)质粒中的限制性酶BamH1和XbaI的酶切位点。
该全长刺突蛋白基因的克隆如图1所显示，图1显示的是插入了编码刺突蛋白全长的核酸片段的pCDN3.1(+)载体被限制性酶酶切后的胶图(道2BamH1和XbaI酶切；道3HindIII酶切)。
实施例2全长刺突蛋白的氨基端片段(S1)和羧基端(S2)片段的产生用计算机分析确定刺突蛋白的氨基端(S1)和羧基端(S2)的潜在功能性分割点，S1和S2之间的分割点在SEQ ID NO1的758和761(758RNTR761)之间。PCR的方法被用于制备编码刺突蛋白的氨基端片段(S1)和羧基端(S2)片段。
以下引物对，S1正向引物5′-AGTCGGA TCCGAC CGG TGCACC ACT TTT G-3′(SEQ ID NO9)，和S1反向引物5′-AGTCGGGCCCCTG TTC AGC AGC AAT ACC-3′(SEQ ID NO10)被用于制备编码刺突蛋白的第17到757位氨基酸残基的核酸片段。两个限制性切点，BamHI和ApaI(两个引物序列带下划线的部分)被用于克隆该编码刺突蛋白基因的氨基端片段的核酸片段(S1)到pSecTaG2B质粒中进行表达。
以下引物对，S2正向引物5′-ACTG GGATCC GAA GTG TTCGCT CAA GTC-3′(SEQ ID NO11)，和S2反向引物5′-ACTGTCTAGA TTG CTC ATA TTT TCC C-3′(SEQ ID NO12)被用于PCR反应以制备编码刺突蛋白第762到1189位氨基酸残基的核酸片段。两个限制性切点，BamHI和XbaI(两个引物序列带下划线的部分)被用于克隆该编码刺突蛋白基因的羧基端片段的核酸片段(S2)到pCDN3.1(+)质粒中进行表达。
为了获得含有第272到537位残基的片段，以下引物对被用于PCR扩增引物5′GATCGGATCCGGTACAATCACAG 3′(SEQ IDNO64)和引物5′GATCGGGCCCGACACACTGGTTC 3′(SEQ IDNO65)。该扩增片段用BamHI和ApaI消化，并与用同样的酶消化的pSecTag2B连接。全长刺突蛋白的许多可溶性刺突蛋白片段的位置见图1B中的图解。
在某些情况下，编码S的片段和全长的S多肽的核酸的天然前导序列(刺突蛋白的第1到16位氨基酸，MFIFLLFLTLTSGSDL(SEQID NO60)被小鼠k链前导序列取代(METDTLLLWVLLLWVPGSTGD)(SEQ ID NO16)以促成分泌，正如以下所描述。
实施例3缺乏胞质尾和跨膜区的完整可溶性刺突蛋白(sS)的获得以下引物对被用于获取编码缺乏胞质尾的含SEQ ID NO1的第17到1189位氨基酸的核酸片段S1正向引物5′-AGTC GGATCCGAC CGG TGC ACC ACT TTT G-3′(SEQ ID NO9)，和反向引物5′ACTGTCTAGATTG CTC ATA TTT TCC C-3′(SEQ ID NO12)。
实施例4刺突蛋白的氨基端和羧基端片段的表达通过用含有pSecTag2或pCDN3.1(+)质粒和编码氨基端(S1)、羧基端(S2)片段，或缺乏胞质尾和跨膜区的SARS-CoV刺突蛋白片段的表达构建体转染293或E6Vero细胞来进行表达。跨膜区的去除被认为可导致多肽和肽片段在水溶液中可溶。然后将测试被编码片段的表达效率。一旦用电泳分析得到阳性信号，将建立一个稳定的转染细胞系。全长的刺突蛋白和它的片段将根据常规的用于纯化高度糖基化的蛋白的方法进行纯化，如晶状体凝集素柱用于大量生产。得到的蛋白质可溶性的S1(sS1)、可溶性的S2(sS2)和完整S(sS)将含有以下氨基酸序列。黑体字代表可以被切去的信号肽，分泌出的蛋白将不含有它。
刺突蛋白的可溶性氨基端片段的氨基酸序列(17-757位氨基酸)DRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCAFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLGADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTEVMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQ(SEQ IDNO13)刺突蛋白的可溶性羧基端片段的氨基酸序列(762-1189位氨基酸)
EVFAQVKQMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRSFIEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYTAALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFITQRNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIINNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQ(SEQ ID NO14)含有SEQ ID NO1的17-757位氨基酸和762-1189位氨基酸可溶性刺突蛋白的氨基酸序列(缺乏信号肽和潜在切割位点)DRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCAFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLGADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTEVMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQDEVFAQVK
QMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRSFIEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYTAALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFTTQRNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIINNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQ(SEQ ID NO15)实施例5刺突蛋白的附加可溶性片段的产生通过聚合酶链反应(PCR)获得含有编码SEQ ID NO1的第17-757位氨基酸的多肽的核酸序列。以下引物用于在PCR中扩增该核酸序列正向引物5′AGCTGGA TCCGAC CGG TGC ACC ACTTTT G 3′(SEQ TD NO9)；和反向引物5′AGCTGGG CCCCTGTTC AGC AGC AAT ACC 3′(SEQ ID NO10)。该PCR产物用BamHI和ApaI酶切，编码与SEQ ID NO43氨基酸序列一致的多肽。被消化后的PCR产物与用同样酶消化的pSecTag2B连接(Invitrogen，Carlsbad，California)。含有插入的PCR产物的pSecTag2B构建体编码多肽SEQ ID NO46，该多肽的氨基端含有鼠k链前导序列(METDTLLLWVLLLWVPGSTGD)(SEQ ID NO16)，羧基端含有用于亲和层析纯化的myc决定簇(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO17)加组氨酸标记物(HHHHHH)(SEQ ID NO18)。
通过聚合酶链反应(PCR)获得含有编码SEQ ID NO1的第17-276位氨基酸的多肽的核酸序列。以下引物用于在PCR中扩增该核酸序列正向引物5′AGCTGGA TCCGAC CGG TGC ACC ACTTTT G3′(SEQ ID NO9)；反向引物5′CTAGCTC GAGCAA CAGCAT CTG TG 3′(SEQ ID NO19)。该PCR产物用BamHI和XhoI酶切，编码含有SEQ ID NO44氨基酸序列的多肽。被消化后的PCR产物与用同样酶消化的pSecTag2B连接(Invitrogen，Carlsbad，California)。含有插入的PCR产物的pSecTag2B构建体编码多肽SEQID NO47，该多肽的氨基端含有鼠k链前导序列(METDTLLLWVLLLWVPGSTGD)(SEQ ID NO16)，羧基端含有用于亲和层析纯化的myc决定簇(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO17)加组氨酸标记物(HHHHHH)(SEQ ID NO18)。
编码含有SEQ ID NO1第17-537位氨基酸的多肽的核酸序列通过消化编码SEQ ID NO43(如以上所描述)的核酸序列而获得，该核酸片段编码含SEQ ID NO45的多肽。该核酸片段与用BamHI和EcoRV消化的pSecTag2B连接。含有插入的PCR产物的pSecTag2B构建体编码多肽SEQ ID NO48，该多肽的氨基端含有鼠k链前导序列(METDTLLLWVLLLWVPGSTGD)(SEQ ID NO16)，羧基端含有用于亲和层析纯化的myc决定簇(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO17)加组氨酸标记物(HHHHHH)(SEQ ID NO18)。
图3显示了这些多肽片段在哺乳动物细胞中的表达，数据显示这些肽片段可以被分泌到表达这些肽片段的细胞生长的培养基中。图3还显示了肽片段在水溶液中可溶。
表1本发明的附加肽片段的实施例
实施例6刺突蛋白的结构为了弄清SARS-CoVS蛋白的特性和功能，编码全长Tor2分离株的核酸被克隆进以上描述的表达载体，该Tor2分离株在Marra等发表的The genome sequence of the SARS-associated coronavirus，Scienee 3001399-1404(2003)上有更多描述。得到的克隆包括含全长S蛋白(1255个残基)、去除了公认的刺突蛋白的跨膜区和胞质内尾的仅含S蛋白的胞外区的氨基端胞外区Se(残基17-1189)、含氨基端276(SEQ ID NO50)、537(SEQ ID NO52)和756(SEQ ID NO56)位氨基酸残基(分别为S276，S537，和S756)并带有16个残基的信号序列或鼠k链前导序列的片段及含有第272-537位残基(SEQ IDNO57)的内部片段(S272-537)的克隆(见图1B)。
氨基酸残基758-761(RNTR)形成以下前体转化酶切割的基序K/R-Xn-K/R其中X是任何氨基酸残基，n＝0，2，4或6。
S1亚单位几乎包含在S756片段中，大小与鼠冠状病毒S1亚单位大小相符，如JHM株，其S1为769个残基，人冠状病毒OC43为778个残基，见Gallagher &.Buchmeier，Coronavirns spike proteins inviral entry andpathogenesis，Virology 279371-374(2001)；Kunkel &Herrler，Structural and functional analysis of the surface protein of humancoronavirus OC43，Virology 195417195-202(1993)。但是，人冠状病毒229E的S1被认为由一个较短的含547个残基的片段组成，与S537相对应，见Bonavia等，Identification of a receptor-binding domain of thespike glycoprotein of human coronavirus HCoV-229E，J.Virol.772530-2538(2003)。
所有S糖蛋白片段和全长S糖蛋白用SDS-PAGE胶电泳时其位置都明显高于它们估计的分子量，提示这些多肽很可能进行了翻译后修饰。S276多肽的表观分子量约为75kDa，S537的表观分子量约为100-110kDa，S756的表观分子量约为130-140kDa，Se和S的表观分子量约为200kDa或更高(图4和6)。这些多肽对应的条带在低曝光的情况下也较宽(图6；一些数据未出示)。这些数据提示有明显的糖基化发生，正如在S糖蛋白和其片段上观察到的那样。基于对分子量的大致估计，似乎S2亚单位不如S756(构成S1亚单位)糖基化的程度高。值得注意的是，如果糖基化是唯一增加分子重量的因素的话，S276糖基化程度非常高。
从细胞培养上清中获得的大多数SARS-CoV的S糖蛋白是未被切割的，虽然小蛋白形成的弱条带在SDS-PAGE胶上能看到。其中一个弱条带与S756在同一位置，提示非有效切割(图4和6)。蛋白酶的随机切割可能发生，需要进一步的研究来确定S糖蛋白的切割是否为其功能所必需。
实施例7大肠杆菌中肽片段的表达编码SEQ ID NO51肽片段的含SEQ ID NO1的第17-446位氨基酸残基的核酸片段被克隆进pRSET载体(Invitrogen，San Diego，CA)构建成质粒pRSET-S(17-446)，用pRSET-S(17-446)转染大肠杆菌BL21DE3，用IPTG诱导，图2显示了诱导的结果。
实施例8用T7启动子驱动被克隆的本发明的肽片段的表达转染前一天，人293细胞和猴Vero E6细胞在5ml DMEM+10％FBS培养基中生长到1.2×106细胞/T25培养瓶(60mm皿)，然后根据厂家提供的方法用Polyfect(Qiagen)转染试剂盒，将含有编码各种刺突蛋白肽片段的插入片段的pSecTag2B构建体(各6μg)转染入细胞，这些构建体的制备如以上所描述。
转染4小时后，以MOI(感染量)20的量用一个带有T7聚合酶的牛痘病毒转染细胞(见Fuerst等，Proc.Natl.Acad.Sci.，9311371(1986))，这一步骤是为pSecTag2B载体上的T7启动子提供用途而不是为弱很多的CMV启动子(Nussbaum等，J.Virol.，685411(1994))。感染后3小时，1.5ml新鲜培养基被加入细胞，并将细胞转到31℃孵箱中培养。细胞继续培养24小时后，收集培养基。
在用任何一种S核酸构建体转染的细胞中均未观察到(数据未出示)可测得的病理变化，提示全长的和可溶性S糖蛋白片段可能没有明显的细胞毒性作用，然而，高水平表达时这种作用是可能的，并且以下描述的合胞体的形成有可能导致细胞死亡。
实施例9刺突特异性抗体用0.1mg的由计算机程序对其免疫原性进行了筛选的各种多肽免疫新西兰兔。从新西兰兔获得的血清用ELISA和Western印迹检测其反应性。由两种肽免疫的兔的血清显示出很高而且特异的抗刺突糖蛋白活性，它们被用于进一步研究。名为D24和D540的抗体分别由肽DVQAPNYTQH TSSMRGC(SEQ ID NO58)和PSSKRFQPFQQFGRDC(SEQ ID NO59)诱导产生。另一个抗SARS-CoVS糖蛋白的多克隆抗体IMG-542，识别S糖蛋白的288-303氨基酸，从IMGENEX(San Diego，CA)购得。
实施例10刺突蛋白的免疫沉淀和纯化可溶性刺突多肽片段从Vero E6或293cell的培养基中获得，但全长的刺突糖蛋白只在细胞裂解物中发现。
收集转染了编码各种可溶性S片段的核酸的细胞的培养基，1000转离心10分钟去除细胞残片，澄清的培养基与Ni-NTA琼脂糖珠(Qiagen，Valencia，CA)或免疫沉淀抗体加糖蛋白G-琼脂糖珠(Sigma，St.Louis，MO)4℃孵育2小时。然后珠子与同量的SDS胶样品缓冲液混合，煮沸3分钟，并进行电泳分析。对于全长的S糖蛋白，细胞首先用加有1％NP-40和0.5mM PMSF的PBS在4℃裂解1小时。然后14000转/分在台式Eppendorf离心机上离心20分钟。澄清的裂解液首先用于免疫沉淀或直接用于Western印迹。
实施例11Western印迹和狭线印迹如上所述表达S糖蛋白的细胞首先用基于PBS的NP40裂解缓冲液裂解，残片用离心方法澄清。对于可溶性S片段，收集培养基用上述方法澄清。对狭线印迹，澄清的裂解液和取自上清的培养基根据厂家(Bio-Rad，Hercules，CA)提供的方法直接用于在硝酸纤微素膜上印迹，然后如常规Western印迹的方法用抗体对膜进行检测。对于Western印迹，抗c-Myc表位的单克隆抗体(Invitrogen，Carlsbad，C(A)或获取自用刺突肽免疫的兔的抗刺突蛋白兔多可隆抗体用TBST缓冲液稀释，抗体与膜孵育2小时，洗膜，然后膜再与结合有HRP的第二抗体孵育1小时，洗膜4次(每次15分钟)，最后用ECL试剂(Pierce，Rockford，IL)显色。
实施例12细胞结合试验和ELISA收集含有可溶性S片段的培养基，离心使其澄清。Vero E6细胞或其他细胞(5×106)与0.5ml含有可溶性S片段的澄清的培养基和2μg缀合有HRP的抗c-Myc表位的抗体4℃孵育2小时。然后用冰冷的PBS洗细胞三次并离心收集细胞。细胞沉淀物与购自Roche(Indianapolis，IN)的ABTS底物室温下孵育10分钟，离心澄清底物并在405nm波长测定其光密度值。
对于ELISA，纯化的ACE2(R&D，Minneapolis，MN以100ng/孔的浓度用pH9.6的缓冲液吸附到Maxisorp ELISA板上。含有各种可溶性S片段的培养基154(150μl)和0.6μg结合有HRP的抗c-155Myc表位抗体加入各孔中37℃孵育2小时。洗孔并向各孔中加入60μlABTS底物，20分钟后测定其光密度值(OD405)。
实施例13荧光染料再分布细胞融合试验转染了编码S糖蛋白的质粒的Hela或293细胞，用Calcein AM(分子探针)负载，Calcein AM在细胞内可转变成Calcein绿，细胞与含有1μg/mlCalcein AM的培养基在37℃和5％CO2的条件下孵育1小时后，经过洗涤后重悬于新鲜培养基中。接种靶细胞于板中，Vero E6用CMAC浸染，Vero E6与含有1μg/ml的CMAC(分子探针)的培养基在37℃和5％CO2的条件下孵育1小时后，用培养基洗涤细胞两次，在新鲜培养基中孵育20分钟后，再次洗涤细胞，然后每孔中加入0.5ml培养基。负载有Calcein的S表达细胞被加入靶细胞中，在37℃和5％CO2的条件下孵育1、2或4小时。以双重染色细胞与接触S表达细胞的靶细胞总数之间的比值来衡量细胞融合。用来自Universal Imaging的MethaMorph 4.0软件进行拍照。
实施例14基于β半乳糖酶报告基因的细胞-细胞融合试验293T细胞(1.5×106)被接种于T25培养瓶，次日，用Polyfect转染试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)根据厂家提供的方法，分别将pCDNA3-S、pSectag2B-S、pCDNA3-ACE2和pCDNA3-ACE2-Ecto转入这些细胞中。转染后4小时，转染了S构建体的细胞用表达T7聚合酶的牛痘病毒转染，转染了ACE-2的细胞用编码β-gal的牛痘病毒(VCB21R)转染。转染后2小时，细胞用新鲜培养基孵育并转入31℃孵育过夜。第二天，S糖蛋白表达细胞和ACE2表达细胞以1∶1的比例混合并在37℃孵育。3小时后，加入NP-40至终浓度为0.5％裂解细胞，细胞裂解液与等量的CPRG底物混合，1小时后测定其OD595。
实施例15哺乳动物细胞刺突多肽的表达对某些试验，除全长S糖蛋白的所有蛋白都用c-Myc抗原表位和组氨酸标记物标记。用相应的质粒转染293和Vero E6细胞后表达这些蛋白，之后用牛痘病毒表达T7聚合酶感染。
用抗c-Myc单克隆抗体(图4)检测标记蛋白。如图4所示，T7启动子是表达S糖蛋白的高度有效启动子。在这些试验中，T7启动子产生的表达水平高于CMV启动子，在大多数情况下其为强启动子(图4A)。如图4所示，S片段是可溶性片段，它们在培养基上清中的浓度与它们的大小成反比。
实施例16抗刺突抗体为了能够检测未标记的蛋白，证实通过抗-c-myc抗体得到的数据和定位可能的抗原位点，制备了兔多克隆抗体。这些抗体中的两个，D24和P540，分别为抗起始于第24和第540位残基的肽的抗体。D24和P540抗体制剂特异性地识别特定的可溶性片段，(图4C)。正如期待的那样，D24识别所有的片段；P540识别S756、Se和S，但不识别更小的片段(图4C，某些数据未出示)。D24抗体制剂相对较弱，而P540制剂即使稀释1∶10000倍也相当敏感，被广泛应用于这里所描述的实验中。
P540被用于检测S糖蛋白是否在细胞内、细胞外和细胞表面表达。正如图5所示，当用流式细胞仪进行测定时，全长的S糖蛋白在细胞表面有表达，但表达水平较低。
实施例17刺突蛋白介导细胞融合全长的S糖蛋白在中性pH时介导与表达受体分子的细胞融合，进行细胞-细胞融合试验来确证全长S糖蛋白是功能性的，来证实S蛋白的融合活性是否需要其他病毒蛋白和低的pH。
用pCDNA3-S和pSectag2B-S两种载体表达的全长S糖蛋白均能有效地导致ACE2表达细胞的融合，通过各种大小的合胞体的形成和基于β-gal报告基因的试验(图7)即可证实。有趣的是，S糖蛋白的前导序列被鼠k链前导序列取代的pSectag2B-S构建体诱导合胞体形成较快，而且，形成的合胞体较编码天然的S糖蛋白的pCDNA3-S诱导的大且数量更多(数据未出示)。通过基于报告基因试验检测，pSectag2B-S表达的S蛋白诱导融合的程度也较pCDNA3-S诱导的高(图7B)。这些数据提示天然的S糖蛋白可能不能被有效地转送到细胞表面。这些研究也提示，这里所描述的β-gal试验可以被用作鉴别抑制SARS-CoV进入细胞的抑制剂的快速并定量的方法，同时也可被用作研究SARS-CoV进入细胞的机理的工具。
注意，当细胞没有用ACE2表达质粒转染，只表达天然浓度的受体时，用β-gal试验或合胞体形成试验均未能检出Vero E6细胞的融合。为了弄清这种结果是否由于这两个试验的敏感性太低所致，又启用了另一个试验。这个新试验是基于荧光染料的再分布试验，能够检测出单个细胞融合。即使用基于荧光染料的试验，也未发现转染了编码全长S糖蛋白的细胞和各种阴性对照之间有明显的统计学差异。一些阴性对照包括了在低pH条件下转染编码可溶性S片段(数据未出示)。明显的细胞-细胞融合只有当细胞转染了编码ACE2的质粒才能检测到，提示通过重组ACE2而致的受体高水平表达可能对于细胞融合是关键的。总的来讲，这些结果提示重组的S糖蛋白能够介导细胞融合，融合可以在中性pH时发生，并且融合的效率取决于受体分子的浓度。
更进一步，可溶性S糖蛋白片段抑制S介导的细胞融合。正如图15所示，加入含有以下描述的受体结合区的S片段S272-537和S17-537，抑制S介导的细胞融合。在本试验中，S272-537(SEQ IDNO57)片段最具抑制力。不含受体结合区的S17-276片段只有很小的或无抑制S介导的细胞融合作用。这些数据提示含有受体结合区的S多肽片段可能抑制SARS-CoV与细胞的融合，进而抑制或预防细胞感染。
这样，用抗-RBD抗体、S多肽、S肽或适体阻断、操纵或抑制刺突蛋白受体结合区的活性，可以有效地预防和治疗SARS-CoV感染。
实施例18刺突蛋白受体结合区的鉴别本实施例阐明了刺突蛋白的受体结合区定位于第272-537位残基(SEQ ID NO57)和可能定位于第303-537位残基(SEQ ID NO61)。后面的实验表明含有319-517残基的片段(SEQ ID NO62)也有受体结合活性。
一个基于将各种可溶性片段结合到表达受体的Vero E6细胞的实验被建立起来，以定位S糖蛋白的受体结合区(RBD)。该试验涉及到测定抗S多肽的抗体结合到Vero E6细胞有关的荧光，并在鉴别SARS-CoV的受体之前开展。对SARS-CoV易感的Vero E6细胞与全长的S多肽和各种可溶性S片段孵育，几种对SARS-CoV不易感的细胞同样也与全长的S多肽和它的可溶性片段孵育。正如图8A和8B所示，所有S片段都与Vero E6细胞结合，除了最小的一个S片段(S276)外。当几个对SARS-CoV不易感的细胞系与全长的S多肽和它的可溶性片段孵育时没有检出这样的结合。与Vero E6细胞的结合与片段表达的水平成正比，与片段的大小成反比。这些发现提示RBD位于第272和537位残基之间。
为了进一步定位RBD，一个用含有288-303残基的肽产生的抗体(IMG542)被使用。该抗体不抑制S537与Vero E6细胞的结合，虽然它确实能与S537片段结合(图8B，一些数据未出示)，提示RBD位于303和537之间。因为抗体相对较大和立体阻碍的缘故，很有可能RBD位于303残基的下游。最近，HCoV-299E的RBD位于一个含有氨基酸残基407-547的片段上，见Ksiazek等.A novelcoronavirus associated with severe acute respiratory syndrome，N.Engl.J.Med.3481953-1966(2003)；Rota等Characterization of a novelcoronavirus associated with severe acute respiratory syndrome，Science3001394-1399(2003)。相比之下，鼠肝炎病毒的RBD定位于N端330氨基酸。
含RBD的SARS-CoV S1糖蛋白片段(如，S272-537)和HCoV-229E或肝炎病毒的RBD之间是否存在结构上的相似，并且这种相似是否关系到用相同宿主进行复制还需进一步研究。这两种病毒使用不同的受体。这里描述的简单直接的细胞结合方法也可能对鉴别其他的病毒受体有帮助。
最近，研究人员已经对ACE2作为SARS-CoV功能性受体的鉴定进行了报道，见Li等Angiotensin-converting enzyme 2is a functionalreceptorfor the SARS coronavirns，Nature 426450-54(2003)。ACE2作为受体的鉴定进一步证实了以上提供的结果是正确的。正如图8C所示，当纯化的ACE2被用于ELISA以测定结合时，观察到与细胞结合试验相同的结合模式，所有的被测试的S片段都是如此。
这里展示的结果不仅提供了研究SARS病毒进入细胞的新工具、证实了ACE2是SARS-CoV S1糖蛋白的受体和定位了RBD，而且为开发新的疫苗免疫原及预防和治疗SARS的药物提供了方便。
实施例19S糖蛋白的N末端和C末端寡聚反应本实施例阐述了S糖蛋白的在RBD上游的极远端N末端片段可能在融合中发挥了作用，并且S胞外区形成的三聚体可能通过6-螺旋束中间体介导融合。
材料和方法抗体和质粒用于Western和FACS分析的兔抗-S血清P540由发明者按以上描述的方法制备，也见Xiao等Biochem.Biophys.Res.Comm.3121159-65(2003)。抗Myc表位抗体从Invitrogen(Carlsbad，CA)购得。抗ACE2山羊多克隆抗体从R&Dsystem(Minneapolis，MN)购得，用于Western印迹检测。
定点突变技术被用于在pCDNA3上的全长SARS-CoV S糖蛋白上制造一个与HIV-1胞膜糖蛋白(Env)和某些冠状病毒一致的共有切割位点，根据厂家提供的方法用从Straagene(La Jolla，CA)购得的Quick Change试剂盒来进行。对于各种N端S片段的表达，对应的基因片段用PCR扩增后克隆进pSecTag2表达载体(Invitrogen，Carlsbad)。表达带有C9肽的ACE2可溶性胞外段的pCDNA3-ACE2-ecto由Michael Farzan(Harvard University，Boston MA)友情赠送。
蛋白表达和纯化S糖蛋白的各种N端片段被亚克隆进pSecTag2表达载体，转染入293T细胞，继之用VTF7.3感染，正如Xiao等在Biochem.Biophys.Res.Comm.3121159-65(2003)中所描述。表达并分泌进入培养基的蛋白用HiTrap Ni++-Chelating柱在天然条件下纯化。纯化的蛋白经PBS透析后保存，用作进一步分析。
通过免疫共沉淀检测S糖蛋白的二聚体化和其与ACE2的相互作用对于S片段的二聚体化，不同的S糖蛋白构建体，单独或联合转染入293T细胞，正如Xiao等在Biochem.Biophys.Res.Comm.3121159-65(2003)中所描述。含有S片段的培养基用于与兔抗S多克隆抗血清P540进行免疫沉淀试验。对于一些免疫共沉淀试验，加入DTT创造一个还原条件，以排除分子间通过二硫键相互作用。免疫沉淀的S片段用抗Myc表位单克隆抗体通过Western来检测。可溶性ACE2-C9的表达很相似，表达进入培养基的ACE2-C9直接用于与各种S片段在4℃条件下孵育2小时。继后，ACE2通过与抗C9单克隆抗体和蛋白G-琼脂糖珠在4℃条件下孵育1小时进行免疫沉淀。琼脂糖珠用PBS洗涤4次，悬于SDS-PAGE样品缓冲液，煮沸3分钟后用于胶分离。样品中存在的ACE2或S用Western来检测，正如Xiao等在Biochem.Biophys.Res.Comm.3121159-65(2003)中所描述的那样。
流式细胞仪检测转染了全长S糖蛋白或各个N端缺失的S糖蛋白，并用VTF7.3感染了的细胞与P540兔抗S多克隆抗体和结合了FITC的山羊抗兔抗体在含有1％BSA的PBS中4℃孵育2小时，然后用冰冷PBS洗涤细胞4次，用FacsCalibur(Becton Dickinson，SanJose，California)进行分析。
S片段的胶过滤分析通过HiTrap Ni-Chelating柱纯化、缓冲液被置换成PBS后，将S片段上样到已用PBS平衡过的Superose 1210/300GL柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上，蛋白用PBS在0.5ml/分的流速下洗脱，以0.5ml量收集洗脱组分。该Superose 12柱用蛋白分子量标准669，440，232，158，67，44和25kD进行标定。从各组分中取10μl用于Western印迹分析。
交联纯化的S537片段用PBS稀释至0.2μg/ml的浓度，BS3(Pierce，Rockford，IL)被加入到S537溶液中至终浓度为1mg/ml，并在冰上孵育1分钟。样品然后与等量的4XSDS-PAGE上样缓冲液混合，用Western进行分析。
细胞融合β-gal报告基因试验转染了pSecTag2B-S或pCDNA3-ACE2并且分别用VTF7.3和VCB21R感染的细胞用胰酶消化，用PBS洗涤一次，细胞然后被悬于pH7.4的常规DMEM培养基中，混合。经4小时孵育后裂解细胞，用CPRG测定β-gal活性，正如Xiao等在Biochem.Biophys.Res.Comm.3121159-65(2003)中所描述的那样。
ELISA两种ELISA方法被使用。在三明治ELISA中，ELISA板用抗-His标记物的抗体包被，然后S片段被加入板中，并用抗c-Myc表位抗体检测。这一方法被用于检测S片段。在第二种ELISA方法中，通过抗C9抗体将带有C9标记的ACE2包被在板上，然后加入S片段，经洗板后，用抗c-Myc表位抗体进行检测。所有实验中与抗c-Myc表位抗体的孵育为室温2小时。测定OD值并正态化至最大值。
结果S糖蛋白RBD上游的N端片段形成二聚体。以前已证明另一个冠状病毒(MHV)的可溶性S1(类似SU)片段形成二聚体，N端最远端的含有受体结合区的330个氨基酸残基参与了二聚体化，只有二聚体才能与CEACAM结合，见Lewicki & Gallagher，J.Biol.Chem.27719727-34(2002)。然而，本发明者和其他人已将SARS-CoV的受体结合区定位在了N端极远端的下游，Xiao等Biochem.Biophys.Res.Comm.3121159-65(2003)；Wong等J.Biol.Chem.2793197-3201(2004)；Babcock等J.Virol.784552-4560(2004)。
为了探索含受体结合区片段的寡聚化反应的可能性和检测其在介导膜融合中的功能，对几个S片段的寡聚化反应进行了检测。这些S片段包括了不与受体ACE2结合的N端极远端的片段(残基17到276，名为S276，SEQ ID NO50)和含有第319到517残基并保留有受体结合活性的片段(名为S319-517，SEQ ID NO62)。选择这些片段部分是因为它们能独立折叠并分泌到细胞培养上清中，尽管它们的表达效率有明显差异(图9A，左边)，且当与S756共表达时它们的浓度会降低(图9A，右边)。
为了发现是否这些片段与含有相当于包膜糖蛋白的受体结合亚单位(一般为SU，冠状病毒为S1)的最大片段(S756)发生寡聚反应，共表达这些多肽片段，然后将细胞培养上清中的混合物用P540进行免疫沉淀。正如前面例子所述，本兔多克隆抗体制剂是制备来抗S糖蛋白上含540到555位残基的肽(SEQ ID NO59)的。P450抗体与S756多肽结合但不与其他多肽结合(图9B，左边)。所有含受体结合区的N端片段除最小的片段(S319-517)外，均能够与S756通过P540发生免疫共沉淀(图9B，右边)。为了排除因二硫键形成引起免疫共沉淀的非特异性反应的可能，DTT被加入了其中的一个免疫共沉淀实验，DTT对分泌的S756(左道)或S756+S276(右道)的免疫沉淀或免疫共沉淀无影响(图9C，左边组)。
为了弄清寡聚体的大小，其中一个片段(S537)与BS3交联。图9C右边组显示新出现的条带的分子量与二聚体一致，而与更高级别的寡聚体不符。为排除交联引起的假相的可能并进一步确证二聚体形成，S537片段也用胶过滤法进行了分析，观察到两个胶过滤的洗脱峰一个峰由分子量约为230kDa的物质引起，另一个由110kDa的物质引起，分别与二聚体和单体的大小一致。形成对照的是，洗脱下来的含有受体结合区的最小片段(S319-517)只有单体，分子量约为35kDa(图2A，下组)。总的来讲，这些结果提示可溶性SU为二聚体，二聚体化的区域在N端极远端317残基的上游和受体结合区之内。
二聚体化的N端区为S介导的细胞-细胞融合所必需。因为推测的二聚体化区域在S1的受体结合区的上游，而融合机制在S2内，人们会假设二聚体化并不是介导融合所需要的。为了验证这一假设，制备了两个全长S糖蛋白的缺失突变子，N端103个残基从一个片段上缺失，N端311个残基从另一个片段上缺失(图9A)，这样，去除了推测的二聚体化区域。两个突变子与具有融合活性的野生型全长S糖蛋白相比无一显示出融合活性(图9A)。为了检测是否因表达水平的差异导致了可观察到的融合活性的缺失，用流式细胞仪和Western印迹对表面及总表达水平进行了测定，从两个实验获得的数据提示两个缺失突变子与野生型的表达水平无明显区别(图11B和C)。这些结果提示N端极远端通过可能涉及或不涉及到二聚体化的机理为融合所必需。
二聚体化的S1与ACE2的结合远比含受体结合区的单体有效。以前对另一个冠状病毒(MHV)的研究提示只有二聚体化的S1与它的受体CEACAM结合，Lewicki & Gallagher，J.Biol.Chem.27719727-734(2002)。用SARS-CoV片段进行实验以弄清二聚体状态下的S1如何影响融合。具体的说，通过使用抗c-Myc表位抗体来将单价S1片段转化成双价来观察单价或双价形式的S1片段与ACE2的结合。这些S1片段的其中之一(S319-517，SEQ ID NO62)与固化于表面的ACE2无任何可测到的结合，除非其与抗c-Myc表位抗体结合后，该抗体在其与受体孵育之前和之中在溶液中将其转化成双价分子(图12)。形成对比的是，S537在没有抗体存在时与ACE2结合，虽然抗体的存在增强其结合力(图12)。这些结果提示S1的二聚体状态可能通过增强总的结合力从而提高融合效率。
可溶性S胞外区为三聚体。I类融合蛋白的病毒胞膜糖蛋白如流感病毒的血凝素(HA)通过跨膜区形成三聚体。因为SARS-CoV S糖蛋白最近被认为属I类融合蛋白，S2亚单位可能主导整个S糖蛋白的三聚体化。然而，带有三聚体化的S2的二聚体化S1可能导致更高级别的寡聚体，它们的形成取决于天然S蛋白上可用的二聚体化结合位点。为了检测这种可能性，去除了跨膜区和胞质内段的可溶性胞外区(Se)的大小用胶过滤法进行了估计，正如图13所示，一个大小接近三聚体(MW 512kDa)的复合物被检出，没有发现有更高级别的寡聚体。这些结果不仅提示Se片段及也许全长的膜相关S在天然未结合状态为三聚体，而且显示S1的二聚体化位点不太容易被用于三聚体间的相互作用。
这些结果有以下提示1)SARS-CoV S糖蛋白(S1)的SU亚单位形成二聚体，2)二聚体化区不重叠，并且在受体结合区的上游，3)去除二聚体化区即阻断融合，4)二聚体化的S1结合受体分子的效率远较含有受体结合区的单体片段强，5)可溶性的S胞外区在胶过滤条件下形成三聚体。
以前已有报道，某些I类融合蛋白(与受体分子结合的蛋白)的SU亚单位能够形成二聚体，包括，例如逆转录病毒的HIV-1的gp120和S1冠状病毒MHV的S1。Center等J.Virol.744448-55(2000)；Lewicki等J.Biol.Chem.27719727-34(2002)。直到本研究，S1二聚体化在介导膜融合中的作用是不清楚的，现在，可溶性胞外区如HIV-1的gp140和SIV的胞膜蛋白(Env)形成三聚体已被普遍接受，虽然也可观察到二聚体和四聚体。Center et al.Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.9814877-82(2001)。类似，至少一个包括SARS-CoV的S2的冠状病毒的可能的融合中间体4级结构为三聚体。Liu et al.Lancet 363938-947(2004)；Bosch et al.Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.1018455-60(2004)。形成对比的是，某些数据提示MHV的S2在与S1分离后是单体。Lewicki等J.Biol.Chem.27719727-34(2002)。二聚体到三聚体的转化在II类融合蛋白介导的融合中发挥着关键作用。这样，有人认为一些冠状病毒的四级结构的改变可能在融合机理中发挥了作用。人们应该注意到HIV-1的Env和MHV的S糖蛋白均被切割，SU亚单位可从跨膜亚单位分离，然而，这种分离可能对融合不重要。形成对照的是，SARS-CoVd的S当表达为膜相关时不被切割，或可溶形式和切割不是融合所必需。这样，虽然SARS-CoV的S糖蛋白为I类融合蛋白，对于I类融合蛋白的Env推测被切割后转化为亚稳定的高能状态以驱动融合反应的法则来说，不被切割是一个例外。
有关SARS-CoV的S糖蛋白的SU(S1)区能够形成二聚体并且与跨膜区的胞外段(S2)形成三聚体的发现展示了一个有趣的拓扑学情形，假如三聚体中的两个单体也形成二聚体，那么第三个单体仍然是自由的可以与另一个三聚体中的自由单体反应形成两个三聚体间的二聚体。另外一种状况是三聚体中的各单体的方向不允许在三聚体中形成二聚体，留出自由结合位点与其他三聚体中的单体形成二聚体。在这种情况下，人们可以期待一个网状的三聚体的形成。最后一种状况是三聚体的三维结构可能不允许任何单体的二聚体化位点与同一个或不同的三聚体之间的单体相互反应。后一种可能得到这里提供的初步数据的支持，即在所述的胶过滤条件下，未检出有高级别的寡聚体。在那些条件下，要么三聚体内形成二聚体，但单体的构型不允许与其他三聚体的单体相互反应，或这样的反应太弱不足以本检测出来，或三聚体的三维结构不允许二聚体化反应的发生。
这里提供的数据证明在删除部分二聚体化区后融合不能发生，提示二聚体化区可能在融合中起作用，虽然其机理可能不是通过二聚体化反应。另外，在天然条件下，表面S糖蛋白的浓度会很高，正如在显微照像中所见，有可能二聚体化反应在稳定相互作用的分子的“网”中起作用，也许有些类似介导II类融合蛋白进入的蛋白网。这样的网，如果有的话，可能增加与受体分子相互作用的亲和力，并且通过事前集合的胞膜分子网促成融合孔结构的形成，或甚至在缺乏产生高能亚稳定状态的S切割的情况下提供驱动融合反应的能量。
实施例20用编码RBD多肽的DNA免疫小鼠获得的血清抑制S介导的细胞融合本实施例表明用编码受体结合区多肽的DNA免疫哺乳动物可预防SARS感染。
材料和方法
小鼠被分为3组A组小鼠从1#到5#用编码含刺突蛋白的受体结合区的S319-518片段的质粒pSecTag-SRBD免疫；B组1#到5#小鼠用编码与Fc融合的RBD(S319-518)片段的融合蛋白的pEAK-10-RBD-Fc免疫；C组1#到3#鼠用对照质粒免疫。各组的5只BALB/C鼠分别在0天、14天和28天免疫。小鼠用基因枪进行免疫，每次剂量低于2μgDNA。第56天采集血清。在图14A-B中，第一个数字代表小鼠个体，字母代表各自的免疫组，最后的数字代表所用稀释度。
细胞(293T)与来自被免疫的小鼠的抗血清孵育，然后与表达S蛋白的细胞混合。融合用前面的例子中描述的方法进行测定(也见，Xiao等BBRC 2003)。PC代表未加血清的阳性对照，对各组的1#到2#鼠，所用稀释系数为10、100和1000，对A组、B组和对照组的3#鼠，所用稀释系数为20和100。
结果从小鼠获得的抗血清的抗体滴度见图14A。如图所示，用编码刺突蛋白受体区(S319-518，A组和B组)DNA免疫的小鼠的抗体滴度非常高，用于ELISA时稀释至1∶7250仍与抗原有很强的反应。
正如图14B所示，从用编码刺突蛋白受体结合区的DNA免疫的小鼠获得的抗血清抑制表达有S蛋白的细胞的融合，并呈剂量依赖关系。这样，来自1A和2A，即用编码S的受体结合区DNA免疫的小鼠的抗血清，当用1∶10稀释时，明显抑制S蛋白介导的细胞融合。更高稀释度(1∶100和1∶1000)时，该抗血清的效果降低。在从来自小鼠3A(1∶20稀释)，小鼠4A(1∶20稀释)，和小鼠5A(1∶20稀释)的抗血清对细胞融合的抑制上也观察到类似结果。
这些数据提示用编码S蛋白受体结合区的多肽的DNA免疫哺乳动物能诱导出很强的抗刺突蛋白的免疫反应并可预防SARS感染。正如以上所述，可溶性的含有受体结合区的S糖蛋白片段抑制S介导的细胞融合(见图15)。
参考文献D.S.Dimitrov，Cell biology of virus entry，Cell 101(2000)697-702.
D.S.Dimitrov，Virus entrymolecular mechanisms and biomedicalapplications，Nat.Rev.Microbiol.2(2004)109-122.
K.V.Holmes，SARS-associated coronavirns，N.Engl.J.Med.348(2003)1948-1951.
M.M.Lai，D.Cavanagh，The molecular biology of coronaviruses，Adv.Virus Res.48(1997)1-100.
T.G.Ksiazek，D.Erdman，C.S.Goldsmith，S.R.Zaki，T.Peret，S.Emery，S.Tong，C.Urbani，J.A.Comer，W.Lim，P.E.Rollin，S.F.Dowell，A.E.Ling，C.D.Humphrey，W.J.Shieh，J.Garner，C.D.Paddock，P.Rota，B.Fields，J.DeRisi，J.Y.Yang，N.Cox，J.M.Hughes，J.W.LeDuc，W.J.Bellini，L. J.Anderson，A novel coronavirus associatedwith severe acute respiratory syndrome，N.Engl.J.Med.348(2003)1953-1966.
P.A.Rota，M.S.Oberste，S.S.Monroe，W.A.Nix，R.Campagnoli，J.P.Icenogle，S.Penaranda，B.Bankamp，K.Maher，M.H.Chen，S.Tong，A.Tamin，L.Lowe，M.Frace，J.L.DeRisi，Q.Chen，D.Wang，D.D.Erdman，T.C.Peret，C.Burns，T.G.Ksiazek，P.E.Rollin，A.Sanchez，S.Li.ck，B.Holloway，J.Limor，K.McCaustland，M.Olsen-Rasmussen，R.Fouchier，S.Gunther，A.D.Osterhaus，C.Drosten，M.A.Pallansch，L.J.Anderson，W.J.Bellini，Characterization of a novel coronavirus associated with severe acuterespiratory syndrome，Science 300(2003)1394-1399.
M.A.Marra，S.J.Jones，C.R.Astell，R.A.Holt，A.Brooks-Wilson，Y.S.Butterfield，J.Khattra，J.K.Asano，S.A.Barber，S.Y.Chan，A.Cloutier，S.M.Coughlin，D.Freeman，N.Girn，O.L.Gri.th，S.R.Leach，M.Mayo，H.McDonald，S.B.Montgomery，P.K.Pandoh，A.S.Petrescu，A.G.Robertson，J.E.Schein，A.Siddiqui，D.E.Smailus，J.M.Stott，G.S.Yang，F.Plummer，A.Andonov，H.Artsob，N.Bastien，K.Bernard，T.F.Booth，D.Bowness，M.Czub，M.Drebot，L.Fernando，R.Flick，M.Garbutt，M.Gray，A.Grolla，S.Jones，H.Feldmann，A.Meyers，A.Kabani，Y.Li，S.Normand，U.Stroher，G.A.Tipples，S.Tyler，R.Vogrig，D.Ward，B.Watson，R.C.Brunham，M.Krajden，M.Petric，D.M.Skowronski，C.Upton，R.L. Roper，The genome sequence of the SARS-associated coronavirus，Science 300(2003)1399-1404.
T.M.Gallagher，M.J.Buchmeier，Coronavirus spike proteins in viralentry and pathogenesis，Virology 279(2001)371-374.
F.Kunkel，G.Herrler，Strnctural and functional analysis of the surfaceprotein of human coronavirus OC43，Virology 195(1993)195-202.
A.Bonavia，B.D.Zelus，D.E.Wentworth，P.J.Talbot，K.V.Holmes，Identi.cation of a receptor-binding domain of the spike glycoproteinof human coronavirus HCoV-229E，J.Virol.77(2003)2530-2538.
W.Li，M.J.Moore，N.Vasilieva，J.Sui，S.K.Wong，M.A.Berne，M.Somasundaran，J.L.Sullivan，K.Luzuriaga，T.C.Greenough，H.Choe，M.Farzan，Angiotensin-converting enzyme 2is a functionalreceptor for the SARS coronavirus，Nature 426450-54(2003).
P.L.Earl，B.Moss，Mutational analysis of the assembly domain of theHIV-1envelope glycoprotein，AIDS Res.Hum.Retrovirnses.9(1993)589-94.
R.J.Center，P.Schuck，R.D.Leapman，L.O.Arthur，P.L.Earl，B.Moss，J.Lebowitz，Oligomeric structure of virion-associated and solubleforms of the simian immunodeficiency virus envelope protein in theprefusion activated conformation，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98(2001)14877-14882.
R.J.Center，P.L.Earl，J.Lebowitz，P.Schuck，B.Moss，The humanimmunodeficienoy virus type 1 gP120 V2 domain mediates gP41-independent intersubunit contacts，J.Virol.74(2000)4448-4455.
D.N.Lewicki，T.M.Gallagher，Quaternary structure of coronavirnsspikes in complex with carcinoembryonic antigen-related celladhesion molecule cellular receptors，J.Biol.Chem′277(2002)19727-19734.
B.Tripet，M.W.Howard，M.Jobling，R.K.Holmes，K.V.Holmes，R.S.Hodges，Structural characterization of the SARS-coronavirus spike Sfusion protein core，J Biol.Chem.279(2004)20836-20849.
J.Zhu，G.Xiao，Y.Xu，F.Yuan，C.Zheng，Y.Liu，H.Yan，D.K.Cole，J.I.Bell，Z.Rao，P.Tien，G.F.Gao，Following the ruleformation ofthe 6-helix bundle of the fusion core from severe acute respiratorysyndrome coronavirus spike protein and identification of potentpeptide inhibitors，Biochem.Biophys.Res.Commun.319(2004)283-288.
B.J.Bosch，B.E.Martina，Z.R.van der，J.Lepault，B.J.Haijema，C.Versluis，A.J.Heck，R.de Groot，A.D.Osterhaus，P.J.Rottier，Severe acute respiratory syndrome coronavirus(SARS-CoV)infection inhibition using spike protein heptad repeat-derivedpeptides，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101(2004)8455-8460.
S.Liu，G.Xiao，Y.Chen，Y.He，J.Niu，C.R.Escalante，H.Xiong，J.Farmar，A.K.Debnath，P.Tien，S.Jiang，Interaction between heptadrepeat 1 and 2 regions in spike protein of SARS-associatedcoronavirusimplications for virus fusogenic mechanism andidentification of fusion inhibitors，Lancet 363(2004)938-947.
B.J.Bosch，Z.R.van der，C.A.de Haan，P.J.Rottier，The coronavirusspike protein is a class I virus fusion proteinstructural andfunctional characterization of the fusion core complex，J.Virol.77(2003)8801-8811.
H.Bisht，A.Roberts，L.Vogel，A.Bukreyev，P.L. Collins，B.R.Murphy，K.Subbarao，B.Moss，Severe acute respiratory syndromecoronavirus spike protein expressed by attenuated vaccinia virusprotectively immunizes mice，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101(2004)6641-6646.
G.J.Babcoek，D.J.Esshaki，W.D.Thomas，Jr.，D.M.Ambrosino，Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndromecoronavirus spike protein are required for interaction with receptor，J.Virol.78(2004)4552-4560.
G.Simmons，J.D.Reeves，A.J.Rennekamp，S.M.Amberg，A.J.Piefer，P.Bates，Characterization of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus(SARS-CoV)spike glycoprotein-mediatedviral entry，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101(2004)4240-4245.
S.K.Wong，W.Li，M.J.Moore，H.Choe，M.Farzan，A 193-amino acidfragment of the SARS coronavirus S protein efficiently bindsangiotensin-converting enzyme 2，J.Biol.Chem.279(2004)3197-3201.
这里引用或提到的所有的专利和出版物代表着与本发明有关的本领域技术人员的技术水平，作为参考的各专利或出版物通过引用结合到本文中，其程度与通过引用以其整体单独结合到本文或以其整体列于本文相同。申请者保留在此说明中引述任何这些提到的专利或出版物的任何和所有材料和信息权利。
这里所述的特殊方法和组合物为代表性优选实施方案，是示例性的，无意作为对本发明范围的限制。当本领域的技术人员在研究本说明时产生的其他的目的、方向和实施方案，正如权利要求的权限中所定义，被本发明的精神所涵盖。本领域的技术人员应该相当清楚地知道，对这里公开的发明的各种取代和修改不偏离本发明的范围和精神。这里解说性地描述的本发明可能适于在缺乏这里没有作为要素公开的任何元素或某些元素、或任何限制或某些限制的情况下实施。这里解说性地描述的方法和过程可能适于用不同次序的步骤实施，它们不必拘泥于这里提到的或权利要求中的步骤次序。正如用于这里和附加的权利要求中的“一”、“一个”和“所述”，除非文中特别指明，包括一或多的含义。例如，“一个宿主细胞”的内容包括了多个这种细胞的(例如培养物和群体)和类似情况。在任何情况下本专利都不能被解释为限于这里具体公开的特殊例子或实施方案。在任何情况下本专利都不能被解释为受限于专利和商标管理局的任何审查员、官员或雇员的申明，除非这样的申明被申请人特别地、无条件无保留地以书面形式表示采纳。
所用术语和表达被用作描述性术语而非限制性术语，这里无意用这些术语和表达来将所展示和描述的特征的等同物或等同物的某部分排除在外，但是，正如所主张的，应该认可在本发明范围内的各种修改是可能的。这样，虽然本发明通过优选的实施方案和可选性特征被具体公开，本领域的那些技术人员可能会谋求对这里公开的概念的修饰和改变，这样的修饰和改变被认为在本发明的涵盖范围内，正如附加权利要求中所定义的那样。
这里对本发明进行了宽泛地、一般性地描述，各种在本一般性公开范围内的较窄的和次一般性的描述也构成本发明的一部分。这包括带有附加条件或从上位概念中去除任何主题的否定性限制的本发明的一般性描述，无论被摘除的材料是否在此有具体叙述。
其他实施方案在以下的权利要求中。另外，当本发明的特征或方面以Markush组来描述时，那些本领域的技术人员应该意识到本发明也以Markush组的任何个体成员或亚组成员来描述。
序列表<110>美国政府卫生及公众服务部国家卫生协会(National Institutes of Health)D.S.迪米特罗夫(Dimitrov，Dimiter S.)X.肖(Xiao，Xiaodong)<120>SARS冠状病毒刺突糖蛋白的可溶性片段<130>1662.024W01<150>US 60/489,166<151>2003-07-21<150>US 60/524,642<151>2003-11-25<160>65<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1255<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>1Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser
50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val65 70 75 80Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Iys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln100 105 110Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys115 120 125Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met130 135 140Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr145 150 155 160Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser165 170 175Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly180 185 190Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp195 200 205Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu210 215 220Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro225 230 235 240Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr245 250 255Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile260 265 270Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys275 280 285Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn290 295 300Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr305 310 315 320Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser325 330 335Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr340 345 350Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly355 360 365Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala
370 375 380Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly385 390 395 400Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe405 410 415Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser420 425 430Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu435 440 445Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly450 455 460Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp465 470 475 480Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val485 490 495Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly500 505 510Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn515 520 525Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg530 535 540Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp545 550 555 560Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys565 570 575Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser580 585 590Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr595 600 605Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr610 615 620Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu625 630 635 640His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile645 650 655Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys660 665 670Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala675 680 685Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile690 695 700
Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys705 710 715 720Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu725 730 735Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile740 745 750Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys755 760 765Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe770 775 780Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile785 790 795 800Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met805 810 815Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile820 825 830Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr835 840 845Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala850 855 860Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe865 870 875 880Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn885 890 895Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala900 905 910Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly915 920 925Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu930 935 940Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn945 950 955 960Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp965 970 975Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln980 985 990Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala995 10001005Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe101010151020Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His
1025103010351040Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn104510501055Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro106010651070Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln107510801085Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val109010951100Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr1105111011151120Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys112511301135Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser114011451150Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu115511601165Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu117011751180Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu1185119011951200Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu120512101215Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys122012251230Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys123512401245Gly Val Lys Leu His Tyr Thr12501255<210>2<211>3768<212>DNA<213>SARS冠状病毒<400>2atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt300
tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct 360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt 420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact 480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa 540cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat 600caacctatag atgtagttcg tgatctacct tctggtttta acactttgaa acctattttt 660aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat tttagagcca ttcttacagc cttttcacct 720gctcaagaca tttggggcac gtcagctgca gcctattttg ttggctattt aaagccaact 780acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa 840aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt aagagctttg agattgacaa aggaatttac 900cagacctcta atttcagggt tgttccctca ggagatgttg tgagattccc taatattaca 960aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg1020gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt1080ttttcaacct ttaagtgcta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc1140aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga1200caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc1260cttgcttgga atactaggaa cattgatgct acttcaactg gtaattataa ttataaatat1320aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc tttgagagag acatatctaa tgtgcctttc1380tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct gctcttaatt gttattggcc attaaatgat1440tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct1500tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt1560aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct1620tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat1680tccgttcgag atcctaaaac atctgaaata ttagacattt caccttgcgc ttttgggggt1740gtaagtgtaa ttacacctgg aacaaatgct tcatctgaag ttgctgttct atatcaagat1800gttaactgca ctgatgtttc tacagcaatt catgcagatc aactcacacc agcttggcgc1860atatattcta ctggaaacaa tgtattccag actcaagcag gctgtcttat aggagctgag1920catgtcgaca cttcttatga gtgcgacatt cctattggag ctggcatttg tgctagttac1980catacagttt ctttattacg tagtactagc caaaaatcta ttgtggctta tactatgtct2040ttaggtgctg atagttcaat tgcttactct aataacacca ttgctatacc tactaacttt2100tcaattagca ttactacaga agtaatgcct gtttctatgg ctaaaacctc cgtagattgt2160aatatgtaca tctgcggaga ttctactgaa tgtgctaatt tgcttctcca atatggtagc2220ttttgcacac aactaaatcg tgcactctca ggtattgctg ctgaacagga tcgcaacaca2280cgtgaagtgt tcgctcaagt caaacaaatg tacaaaaccc caactttgaa atattttggt2340ggttttaatt tttcacaaat attacctgac cctctaaagc caactaagag gtcttttatt2400gaggacttgc tctttaataa ggtgacactc gctgatgctg gcttcatgaa gcaatatggc2460gaatgcctag gtgatattaa tgctagagat ctcatttgtg cgcagaagtt caatggactt2520acagtgttgc cacctctgct cactgatgat atgattgctg cctacactgc tgctctagtt2580agtggtactg ccactgctgg atggacattt ggtgctggcg ctgctcttca aatacctttt2640gctatgcaaa tggcatatag gttcaatggc attggagtta cccaaaatgt tctctatgag2700aaccaaaaac aaatcgccaa ccaatttaac aaggcgatta gtcaaattca agaatcactt2760
acaacaacat caactgcatt gggcaagctg caagacgttg ttaaccagaa tgctcaagca2820ttaaacacac ttgttaaaca acttagctct aattttggtg caatttcaag tgtgctaaat2880gatatccttt cgcgacttga taaagtcgag gcggaggtac aaattgacag gttaattaca2940ggcagacttc aaagccttca aacctatgta acacaacaac taatcagggc tgctgaaatc3000agggcttctg ctaatcttgc tgctactaaa atgtctgagt gtgttcttgg acaatcaaaa3060agagttgact tttgtggaaa gggctaccac cttatgtcct tcccacaagc agccccgcat3120ggtgttgtct tcctacatgt cacgtatgtg ccatcccagg agaggaactt caccacagcg3180ccagcaattt gtcatgaagg caaagcatac ttccctcgtg aaggtgtttt tgtgtttaat3240ggcacttctt ggtttattac acagaggaac ttcttttctc cacaaataat tactacagac3300aatacatttg tctcaggaaa ttgtgatgtc gttattggca tcattaacaa cacagtttat3360gatcctctgc aacctgagct cgactcattc aaagaagagc tggacaagta cttcaaaaat3420catacatcac cagatgttga tcttggcgac atttcaggca ttaacgcttc tgtcgtcaac3480attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gtcgctaaaa atttaaatga atcactcatt3540gaccttcaag aattgggaaa atatgagcaa tatattaaat ggccttggta tgtttggctc3600ggcttcattg ctggactaat tgccatcgtc atggttacaa tcttgctttg ttgcatgact3660agttgttgca gttgcctcaa gggtgcatgc tcttgtggtt cttgctgcaa gtttgatgag3720gatgactctg agccagttct caagggtgtc aaattacatt acacataa 3768<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>3agtcggatcc ggtaggctta tcattagag29<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>4ccatcagggg agaaaggcac 20<210>5
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>5gtgcctttct cccctgatgg 20<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>6gaagagcagc gccagcacc 19<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>7ggtgctggcg ctgctcttc 19<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物
<400>8actgtctaga gttcgtttat gtgtaatg 28<210>9<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>9agtcggatcc gaccggtgca ccacttttg29<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>10agtcgggccc ctgttcagca gcaatacc 28<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>11actgggatcc gaagtgttcg ctcaagtc 28<210>12<211>26
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>12actgtctaga ttgctcatat tttccc 26<210>13<211>740<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>13Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln1 5 10 15His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg20 25 30Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser35 40 45Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val50 55 60Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn65 70 75 80Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln85 90 95Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys100 105 110Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met115 120 125Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr130 135 140Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser145 150 155 160Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly165 170 175Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp180 185 190Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
195 200 205Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro210 215 220Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr225 230 235 240Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile245 250 255Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys260 265 270Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn275 280 285Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr290 295 300Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser305 310 315 320Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr325 330 335Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly340 345 350Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala355 360 365Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly370 375 380Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe385 390 395 400Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser405 410 415Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu420 425 430Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly435 440 445Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp450 455 460Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val465 470 475 480Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly485 490 495Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn500 505 510Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg515 520 525
Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp530 535 540Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys545 550 555 560Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser565 570 575Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr580 585 590Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr595 600 605Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu610 615 620His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile625 630 635 640Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys645 650 655Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala660 665 670Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile675 680 685Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys690 695 700Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu705 710 715 720Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile725 730 735Ala Ala Glu Gln740<210>14<211>429<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>14Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys1 5 10 15Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys20 25 30Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr35 40 45
Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp50 55 60Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr65 70 75 80Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala85 90 95Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly100 105 110Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn115 120 125Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile130 135 140Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr145 150 155 160Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn165 170 175Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly180 185 190Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val195 200 205Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser210 215 220Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg225 230 235 240Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly245 250 255Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser260 265 270Phe Pro Gln Ala Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr275 280 285Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His290 295 300Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly305 310 315 320Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile325 330 335Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly340 345 350Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser355 360 365
Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp370 375 380Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile385 390 395 400Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu405 410 415Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln420 425<210>15<211>1170<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln1 5 10 15His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg20 25 30Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser35 40 45Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val50 55 60Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn65 70 75 80Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln85 90 95Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys100 105 110Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met115 120 125Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr130 135 140Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser145 150 155 160Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly165 170 175Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp180 185 190Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
195 200 205Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro210 215 220Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr225 230 235 240Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile245 250 255Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys260 265 270Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn275 280 285Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr290 295 300Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser305 310 315 320Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr325 330 335Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly340 345 350Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala355 360 365Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly370 375 380Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe385 390 395 400Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser405 410 415Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu420 425 430Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly435 440 445Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp450 455 460Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val465 470 475 480Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly485 490 495Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn500 505 510Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg515 520 525
Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp530 535 540Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys545 550 555 560Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser565 570 575Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr580 585 590Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr595 600 605Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu610 615 620His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile625 630 635 640Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys645 650 655Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala660 665 670Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile675 680 685Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys690 695 700Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu705 710 715 720Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile725 730 735Ala Ala Glu Gln Asp Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys740 745 750Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu755 760 765Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu770 775 780Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met Lys Gln Tyr Gly785 790 795 800Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys805 810 815Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Asp Met Ile820 825 830Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala Thr Ala Gly Trp835 840 845Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met
850 855 860Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu865 870 875 880Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala Ile Ser Gln Ile885 890 895Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp900 905 910Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu915 920 925Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser930 935 940Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr945 950 955 960Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg965 970 975Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser980 985 990Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly995 10001005Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His Gly Val Val Phe101010151020Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala1025103010351040Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro Arg Glu Gly Val104510501055Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe106010651070Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys107510801085Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln109010951100Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn1105111011151120His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala112511301135Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala114011451150Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr115511601165Glu Gln1170
<210>16<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的k链前导序列<400>16Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp20<210>17<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的myc抗原表位<400>17Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu1 5 10<210>18<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的组氨酸标记物<400>18His His His His His His1 5<210>19<211>24
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>19ctagctcgag caacagcatc tgtg 24<210>20<211>100<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>20Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val65 70 75 80Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly100<210>21<211>100<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>21Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln Ser Val Ile Ile1 5 10 15Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys Asn Phe Glu Leu20 25 30
Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met Gly Thr Gln Thr35 40 45His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Ile50 55 60Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys65 70 75 80His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val85 90 95Tyr Lys Gly Tyr100<210>22<211>100<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>22Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu1 5 10 15Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg20 25 30Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser35 40 45Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu50 55 60Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln65 70 75 80Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp85 90 95Lys Gly Ile Tyr100<210>23<211>100<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>23Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe1 5 10 15Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr
20 25 30Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys35 40 45Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe50 55 60Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser65 70 75 80Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln85 90 95Ile Ala Pro Gly100<210>24<211>100<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>24Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe1 5 10 15Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser20 25 30Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu35 40 45Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly50 55 60Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp65 70 75 80Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val85 90 95Val Val Leu Ser100<210>25<211>100<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>25Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Leu Ser1 5 10 15
Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu20 25 30Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg Phe Gln Pro Phe35 40 45Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp50 55 60Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys Ala Phe Gly Gly65 70 75 80Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser Glu Val Ala Val85 90 95Leu Tyr Gln Asp100<210>26<211>100<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>26Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr1 5 10 15Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln20 25 30Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys35 40 45Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser50 55 60Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser65 70 75 80Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile85 90 95Pro Thr Asn Phe100<210>27<211>100<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>27Ser Ile Ser Ile Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr
1 5 10 15Ser Val Asp Cys Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala20 25 30Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala35 40 45Leu Ser Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe50 55 60Ala Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly65 70 75 80Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys85 90 95Arg Ser Phe Ile100<210>28<211>100<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>28Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met1 5 10 15Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile20 25 30Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr35 40 45Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala50 55 60Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe65 70 75 80Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn85 90 95Val Leu Tyr Glu100<210>29<211>100<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>29
Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala Ile Ser Gln Ile1 5 10 15Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp20 25 30Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu35 40 45Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser50 55 60Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr65 70 75 80Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg85 90 95Ala Ala Glu Ile100<210>30<21l>100<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>30Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu1 5 10 15Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met20 25 30Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr35 40 45Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys50 55 60His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn65 70 75 80Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile85 90 95Ile Thr Thr Asp100<210>31<211>90<212>PRT<213>SARS冠状病毒
<400>31Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asnl 5 10 15Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu20 25 30Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu35 40 45Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu50 55 60Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile65 70 75 80Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln85 90<210>32<211>200<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>32Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val65 70 75 80Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln100 105 110Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys115 120 125Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met130 135 140Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr145 150 155 160Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser
165 170 175Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly180 185 190Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr195 200<210>33<211>200<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>33Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu1 5 10 15Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg20 25 30Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser35 40 45Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu50 55 60Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln65 70 75 80Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp85 90 95Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp100 105 110Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val115 120 125Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys130 135 140Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe145 150 155 160Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp165 170 175Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp180 185 190Asp Val Arg Gln IleAla Pro Gly195200<210>34
<211>200<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>34Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe1 5 10 15Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser20 25 30Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu35 40 45Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly50 55 60Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp65 70 75 80Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val85 90 95Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly100 105 110Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn115 120 125Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg130 135 140Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp145 150 155 160Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys165 170 175Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser180 185 190Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp195 200<210>35<211>200<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>35Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr1 5 10 15Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln
20 25 30Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys35 40 45Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser50 55 60Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser65 70 75 80Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile85 90 95Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser100 105 110Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser115 120 125Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln130 135 140Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr145 150 155 160Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu165 170 175Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu180 185 190Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile195 200<210>36<211>200<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>36Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met1 5 10 15Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile20 25 30Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr35 40 45Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala50 55 60Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe65 70 75 80Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn
85 90 95Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala100 105 110Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly115 120 125Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu130 135 140Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn145 150 155 160Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp165 170 175Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln180 185 190Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile195 200<210>37<211>190<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>37Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu1 5 10 15Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met20 25 30Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr35 40 45Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys50 55 60His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn65 70 75 80Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile85 90 95Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile100 105 110Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp115 120 125Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro130 135 140
Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn145 150 155 160Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn165 170 175Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln180 185 190<210>38<211>400<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>38Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val65 70 75 80Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln100 105 110Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys115 120 125Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met130 135 140Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr145 150 155 160Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser165 170 175Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly180 185 190Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp195 200 205Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
210 215 220Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro225 230 235 240Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr245 250 255Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile260 265 270Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys275 280 285Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn290 295 300Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr305 310 315 320Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser325 330 335Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr340 345 350Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly355 360 365Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala370 375 380Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly385 390 395 400<210>39<211>600<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>39Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val65 70 75 80
Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln100 105 110Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys115 120 125Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met130 135 140Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr145 150 155 160Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser165 170 175Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly180 185 190Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp195 200 205Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu210 215 220Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro225 230 235 240Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr245 250 255Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile260 265 270Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys275 280 285Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn290 295 300Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr305 310 315 320Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser325 330 335Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr340 345 350Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly355 360 365Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala370 375 380Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly385 390 395 400Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
405 410 415Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser420 425 430Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu435 440 445Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly450 455 460Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp465 470 475 480Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val485 490 495Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly500 505 510Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn515 520 525Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg530 535 540Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp545 550 555 560Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys565 570 575Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser580 585 590Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp595 600<210>40<211>800<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>40Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val
65 70 75 80Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln100 105 110Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys115 120 125Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met130 135 140Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr145 150 155 160Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser165 170 175Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly180 185 190Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp195 200 205Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu210 215 220Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro225 230 235 240Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr245 250 255Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile260 265 270Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys275 280 285Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn290 295 300Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr305 310 315 320Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser325 330 335Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr340 345 350Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly355 360 365Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala370 375 380Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385 390 395 400Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe405 410 415Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser420 425 430Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu435 440 445Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly450 455 460Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp465 470 475 480Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val485 490 495Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly500 505 510Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn515 520 525Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg530 535 540Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp545 550 555 560Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys565 570 575Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser580 585 590Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr595 600 605Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr610 615 620Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu625 630 635 640His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile645 650 655Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys660 665 670Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala675 680 685Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile690 695 700Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys705 710 715 720
Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu725 730 735Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile740 745 750Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys755 760 765Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe770 775 780Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile785 790 795 800<210>41<211>1000<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>41Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val65 70 75 80Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln100 105 110Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys115 120 125Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met130 135 140Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr145 150 155 160Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser165 170 175Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly180 185 190
Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp195 200 205Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu210 215 220Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro225 230 235 240Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr245 250 255Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile260 265 270Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys275 280 285Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn290 295 300Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro AsnIle Thr305 310 315 320Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser325 330 335Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr340 345 350Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly355 360 365Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala370 375 380Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly385 390 395 400Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe405 410 415Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser420 425 430Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu435 440 445Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly450 455 460Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp465 470 475 480Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val485 490 495Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly500 505 510
Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn515 520 525Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg530 535 540Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp545 550 555 560Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys565 570 575Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser580 585 590Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr595 600 605Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr610 615 620Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu625 630 635 640His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile645 650 655Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys660 665 670Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala675 680 685Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile690 695 700Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys705 710 715 720Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu725 730 735Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile740 745 750Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys755 760 765Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe770 775 780Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile785 790 795 800Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met805 810 815Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile820 825 830Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr
835 840 845Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala850 855 860Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe865 870 875 880Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn885 890 895Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala900 905 910Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly915 920 925Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu930 935 940Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn945 950 955 960Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp965 970 975Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln980 985 990Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile995 1000<210>42<211>1190<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>42Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val65 70 75 80Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln
100 105 110Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys115 120 125Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met130 135 140Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr145 150 155 160Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser165 170 175Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly180 185 190Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp195 200 205Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu210 215 220Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro225 230 235 240Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr245 250 255Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile260 265 270Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys275 280 285Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn290 295 300Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr305 310 315 320Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser325 330 335Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr340 345 350Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly355 360 365Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala370 375 380Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly385 390 395 400Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe405 410 415Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser
420 425 430Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu435 440 445Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly450 455 460Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp465 470 475 480Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val485 490 495Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly500 505 510Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn515 520 525Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg530 535 540Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp545 550 555 560Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys565 570 575Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser580 585 590Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr595 600 605Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr610 615 620Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu625 630 635 640His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile645 650 655Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys660 665 670Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala675 680 685Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile690 695 700Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys705 710 715 720Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu725 730 735Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile740 745 750
Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys755 760 765Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe770 775 780Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile785 790 795 800Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met805 810 815Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile820 825 830Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr835 840 845Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala850 855 860Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe865 870 875 880Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn885 890 895Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala900 905 910Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly915 920 925Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu930 935 940Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn945 950 955 960Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp965 970 975Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln980 985 990Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala995 10001005Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe101010151020Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His1025103010351040Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn104510501055Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro106010651070Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln
107510801085Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val109010951100Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr1105111011151120Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys112511301135Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser114011451150Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu115511601165Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu117011751180Leu Gly Lys Tyr Glu Gln11851190<210>43<211>84<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>43Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln1 5 10 15His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg20 25 30Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser35 40 45Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val50 55 60Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn65 70 75 80Val Val Arg Gly<210>44<211>184<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>44
Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln1 5 10 15His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg20 25 30Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser35 40 45Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val50 55 60Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn65 70 75 80Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln85 90 95Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys100 105 110Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met115 120 125Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr130 135 140Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser145 150 155 160Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly165 170 175Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr180<210>45<211>384<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>45Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln1 5 10 15His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg20 25 30Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser35 40 45Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val50 55 60Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn65 70 75 80
Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln85 90 95Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys100 105 110Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met115 120 125Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr130 135 140Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser145 150 155 160Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly165 170 175Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp180 185 190Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu195 200 205Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro210 215 220Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr225 230 235 240Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile245 250 255Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys260 265 270Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn275 280 285Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr290 295 300Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser305 310 315 320Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr325 330 335Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly340 345 350Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala355 360 365Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly370 375 380<210>46
<211>584<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>46Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln1 5 10 15His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg20 25 30Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser35 40 45Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val50 55 60Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn65 70 75 80Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln85 90 95Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys100 105 110Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met115 120 125Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr130 135 140Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser145 150 155 160Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly165 170 175Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp180 185 190Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu195 200 205Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro210 215 220Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr225 230 235 240Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile245 250 255Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys260 265 270Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
275 280 285Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr290 295 300Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser305 310 315 320Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr325 330 335Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly340 345 350Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala355 360 365Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly370 375 380Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe385 390 395 400Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser405 410 415Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu420 425 430Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly435 440 445Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp450 455 460Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val465 470 475 480Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly485 490 495Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn500 505 510Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg515 520 525Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp530 535 540Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys545 550 555 560Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser565 570 575Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp580<210>47
<211>784<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>47Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln1 5 10 15His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg20 25 30Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser35 40 45Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Ash His Thr Phe Gly Asn Pro Val50 55 60Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn65 70 75 80Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln85 90 95Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys100 105 110Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met115 120 125Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr130 135 140Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser145 150 155 160Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly165 170 175Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp180 185 190Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu195 200 205Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro210 215 220Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr225 230 235 240Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile245 250 255Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys260 265 270Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
275 280 285Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr290 295 300Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser305 310 315 320Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr325 330 335Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly340 345 350Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala355 360 365Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly370 375 380Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe385 390 395 400Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser405 410 415Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu420 425 430Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly435 440 445Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp450 455 460Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val465 470 475 480Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly485 490 495Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn500 505 510Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg515 520 525Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp530 535 540Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys545 550 555 560Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser565 570 575Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr580 585 590Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr595 600 605
Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu610 615 620His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile625 630 635 640Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys645 650 655Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala660 665 670Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile675 680 685Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys690 695 700Ash Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu705 710 715 720Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile725 730 735Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys740 745 750Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe755 760 765Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile770 775 780<210>48<211>984<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>48Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln1 5 10 15His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg20 25 30Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser35 40 45Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val50 55 60Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn65 70 75 80Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln85 90 95
Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys100 105 110Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met115 120 125Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr130 135 140Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser145 150 155 160Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly165 170 175Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp180 185 190Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu195 200 205Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro210 215 220Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr225 230 235 240Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile245 250 255Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys260 265 270Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn275 280 285Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr290 295 300Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser305 310 315 320Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr325 330 335Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly340 345 350Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala355 360 365Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly370 375 380Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe385 390 395 400Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser405 410 415
Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu420 425 430Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly435 440 445Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp450 455 460Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val465 470 475 480Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly485 490 495Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn500 505 510Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg515 520 525Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp530 535 540Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys545 550 555 560Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser565 570 575Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr580 585 590Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr595 600 605Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu610 615 620His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile625 630 635 640Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys645 650 655Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala660 665 670Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile675 680 685Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys690 695 700Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu705 710 715 720Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile725 730 735Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys
740 745 750Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe755 760 765Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile770 775 780Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met785 790 795 800Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile805 810 815Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr820 825 830Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala835 840 845Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe850 855 860Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn865 870 875 880Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala885 890 895Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly900 905 910Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu915 920 925Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Ash930 935 940Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp945 950 955 960Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln965 970 975Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile980<210>49<211>1174<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>49Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln1 5 10 15His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg
20 25 30Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser35 40 45Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val50 55 60Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn65 70 75 80Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln85 90 95Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys100 105 110Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met115 120 125Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr130 135 140Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser145 150 155 160Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly165 170 175Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp180 185 190Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu195 200 205Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro210 215 220Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr225 230 235 240Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile245 250 255Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys260 265 270Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn275 280 285Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr290 295 300Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser305 310 315 320Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr325 330 335Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
340 345 350Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala355 360 365Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly370 375 380Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe385 390 395 400Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser405 410 415Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu420 425 430Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly435 440 445Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp450 455 460Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val465 470 475 480Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly485 490 495Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn500 505 5l0Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg515 520 525Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp530 535 540Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys545 550 555 560Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser565 570 575Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr580 585 590Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr595 600 605Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu610 615 620His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile625 630 635 640Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys645 650 655Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala660 665 670
Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile675 680 685Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys690 695 700Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu705 710 715 720Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile725 730 735Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys740 745 750Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe755 760 765Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile770 775 780Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met785 790 795 800Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile805 810 815Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr820 825 830Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala835 840 845Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe850 855 860Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn865 870 875 880Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala885 890 895Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly900 905 910Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu915 920 925Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn930 935 940Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp945 950 955 960Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln965 970 975Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala980 985 990Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe
995 10001005Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His101010151020Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn1025103010351040Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro104510501055Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln106010651070Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val107510801085Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr109010951100Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys1105111011151120Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser112511301135Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu114011451150Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu115511601165Leu Gly Lys Tyr Glu Gln1170<210>50<211>260<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>50Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln1 5 10 15His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg20 25 30Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser35 40 45Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val50 55 60Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn65 70 75 80
Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln85 90 95Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys100 105 110Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met115 120 125Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr130 135 140Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser145 150 155 160Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly165 170 175Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp180 185 190Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu195 200 205Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro210 215 220Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr225 230 235 240Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile245 250 255Thr Asp Ala Val260<210>51<211>430<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>51Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln1 5 10 15His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg20 25 30Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser35 40 45Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val50 55 60Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn
65 70 75 80Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln85 90 95Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys100 105 110Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met115 120 125Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr130 135 140Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser145 150 155 160Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly165 170 175Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp180 185 190Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu195 200 205Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro210 215 220Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr225 230 235 240Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile245 250 255Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys260 265 270Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn275 280 285Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr290 295 300Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser305 310 315 320Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr325 330 335Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly340 345 350Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala355 360 365Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly370 375 380Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe385 390 395 400
Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser405 410 415Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly420 425 430<210>52<211>521<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>52Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln1 5 10 15His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg20 25 30Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser35 40 45Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val50 55 60Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn65 70 75 80Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln85 90 95Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys100 105 110Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met115 120 125Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr130 135 140Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser145 150 155 160Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly165 170 175Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp180 185 190Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu195 200 205Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro210 215 220Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr
225 230 235 240Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile245 250 255Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys260 265 270Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn275 280 285Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr290 295 300Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser305 310 315 320Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr325 330 335Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly340 345 350Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala355 360 365Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly370 375 380Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe385 390 395 400Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser405 410 415Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu420 425 430Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly435 440 445Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp450 455 460Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val465 470 475 480Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly485 490 495Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn500 505 510Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val515 520<210>53<211>777<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>合成的SEQ ID NO1的17-157位氨基酸序列外加小鼠K链前导序列N端以及myc抗原表位C端和多聚组氨酸标记物<400>53Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala20 25 30Pro Asn Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro35 40 45Asp Glu Ile Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe50 55 60Leu Pro Phe Tyr Ser Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr65 70 75 80Phe Gly Asn Pro Val Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala85 90 95Thr Glu Lys Ser Asn Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met100 105 110Asn Asn Lys Ser Gln Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val115 120 125Val Ile Arg Ala Cys Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala130 135 140Val Ser Lys Pro Met Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn145 150 155 160Ala Phe Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp165 170 175VaI Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe180 185 190Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile195 200 205Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile210 215 220Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu225 230 235 240Thr Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala245 250 255Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp260 265 270
Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu275 280 285Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile290 295 300Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg305 310 315 320Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala325 330 335Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn340 345 350Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr355 360 365Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe370 375 380Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg385 390 395 400Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys405 410 415Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn420 425 430Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu435 440 445Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro450 455 460Phe Ser Pro Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr465 470 475 480Trp Pro Leu Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr485 490 495Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro500 505 510Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln515 520 525Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr530 535 540Pro Ser Ser Lys Arg Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val545 550 555 560Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu565 570 575Asp Ile Ser Pro Cys Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly580 585 590Thr Asn Ala Ser Ser Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys
595 600 605Thr Asp Val Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp610 615 620Arg Ile Tyr Ser Thr Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys625 630 635 640Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro645 650 655Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg660 665 670Ser Thr Ser Gln Lys Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala675 680 685Asp Ser Ser Ile Ala Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn690 695 700Phe Ser Ile Ser Ile Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys705 710 715 720Thr Ser Val Asp Cys Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys725 730 735Ala Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg740 745 750Ala Leu Ser Gly Ile Ala Ala Glu Gln Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu755 760 765Glu Asp Leu His His His His His His770 775<210>54<211>297<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的SEQ ID NO1的17-276位氨基酸序列外加小鼠K链前导序列N端以及myc抗原表位C端和多聚组氨酸标记物<400>54Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala20 25 30Pro Asn Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro35 40 45Asp Glu Ile Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe
50 55 60Leu Pro Phe Tyr Ser Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr65 70 75 80Phe Gly Asn Pro Val Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala85 90 95Thr Glu Lys Ser Asn Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met100 105 110Asn Asn Lys Ser Gln Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val115 120 125Val Ile Arg Ala Cys Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala130 135 140Val Ser Lys Pro Met Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn145 150 155 160Ala Phe Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp165 170 175Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe180 185 190Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile195 200 205Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile210 215 220Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu225 230 235 240Thr Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala245 250 255Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp260 265 270Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu275 280 285Glu Asp Leu His His His His His His290 295<210>55<211>558<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的SEQ ID NO1的17-537位氨基酸序列外加小鼠K链前导序列N端以及myc抗原表位C端和多聚组氨酸标记物
<400>55Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala20 25 30Pro Asn Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro35 40 45Asp Glu Ile Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe50 55 60Leu Pro Phe Tyr Ser Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr65 70 75 80Phe Gly Asn Pro Val Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala85 90 95Thr Glu Lys Ser Asn Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met100 105 110Asn Asn Lys Ser Gln Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val115 120 125Val Ile Arg Ala Cys Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala130 135 140Val Ser Lys Pro Met Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn145 150 155 160Ala Phe Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp165 170 175Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe180 185 190Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile195 200 205Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile210 215 220Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu225 230 235 240Thr Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala245 250 255Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp260 265 270Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu275 280 285Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile290 295 300Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg
305 310 315 320Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala325 330 335Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn340 345 350Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr355 360 365Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe370 375 380Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg385 390 395 400Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys405 410 415Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn420 425 430Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu435 440 445Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro450 455 460Phe Ser Pro Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr465 470 475 480Trp Pro Leu Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr485 490 495Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro500 505 510Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln515 520 525Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Glu Gln530 535 540Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His545 550 555<210>56<211>739<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的SEQ ID NO1的17-756位氨基酸序列，N端没有信号肽
<400>56Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln1 5 10 15His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg20 25 30Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser35 40 45Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val50 55 60Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn65 70 75 80Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln85 90 95Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys100 105 110Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met115 120 125Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr130 135 140Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser145 150 155 160Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly165 170 175Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp180 185 190Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu195 200 205Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro210 215 220Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr225 230 235 240Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile245 250 255Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys260 265 270Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn275 280 285Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr290 295 300Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser305 310 315 320
Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr325 330 335Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly340 345 350Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala355 360 365Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly370 375 380Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe385 390 395 400Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser405 410 415Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu420 425 430Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly435 440 445Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp450 455 460Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val465 470 475 480Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly485 490 495Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn500 505 510Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg515 520 525Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp530 535 540Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys545 550 555 560Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser565 570 575Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr580 585 590Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr595 600 605Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu610 615 620His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile625 630 635 640Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys
645 650 655Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala660 665 670Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile675 680 685Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys690 695 700Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu705 710 715 720Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile725 730 735Ala Ala Glu<210>57<211>265<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的SEQ ID NO1的272-537位氨基酸序列<400>57Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys1 5 10 15Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser20 25 30Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Asn Ile Thr35 40 45Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser50 55 60Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr65 70 75 80Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly85 90 95Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala100 105 110Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly115 120 125Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe130 135 140
Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser145 150 155 160Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu165 170 175Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly180 185 190Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp195 200 205Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val210 215 220Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly225 230 235 240Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn245 250 255Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val260 265<210>58<211>17<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>58Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly1 5 10 15Cys<210>59<211>15<212>PRT<213>SARS冠状病毒<400>59Pro Ser Ser Lys Arg Phe Gln Pro Gln Gln Phe Gly Arg Asp Cys1 5 10 15<210>60<211>16<212>PRT<213>SARS冠状病毒
<400>60Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15<210>61<211>235<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的SEQ ID NO1的303-537位氨基酸序列，含有受体结合域<400>61Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn1 5 10 15Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe20 25 30Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala35 40 45Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys50 55 60Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val65 70 75 80Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala85 90 95Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp100 105 110Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala115 120 125Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly130 135 140Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro145 150 155 160Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu165 170 175Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr180 185 190Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val195 200 205
Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn210 215 220Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val225 230 235<210>62<211>199<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的SEQ ID NO1的319-517位氨基酸序列，含有受体结合域<400>62Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn AIa Thr Lys Phe1 5 10 15Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala20 25 30Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys35 40 45Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val50 55 60Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala65 70 75 80Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp85 90 95Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala100 105 110Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly115 120 125Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro130 135 140Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu145 150 155 160Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr165 170 175Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val180 185 190Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr195
<210>63<211>200<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的SEQ ID NO1的319-518位氨基酸序列，含有受体结合域<400>63Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe1 5 10 15Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala20 25 30Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys35 40 45Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val50 55 60Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala65 70 75 80Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp85 90 95Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala100 105 110Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly115 120 125Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro130 135 140Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu145 150 155 160Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr165 170 175Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val180 185 190Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr Asp195 200<210>64<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成引物<400>64gatcggatcc ggtacaatca cag 23<210>65<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>65gatcgggccc gacacactgg ttc 2权利要求
1.一种SEQ ID NO1的多肽片段或其保守性变异体，其中所述多肽当用于接种动物时可产生体液或细胞免疫反应。
2.一种具有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个的多肽，其中所述多肽当用于接种动物时可产生体液或细胞免疫反应。
3.一种具有SEQ ID NO13、14、15、25、34、46、51、52、56、57、58、59、61、62或63中任何一个的多肽，其中所述多肽当用于接种动物时可产生体液或细胞免疫反应。
4.权利要求1、2或3的多肽，其中所述多肽在水溶液中可溶。
5.权利要求1、2或3的多肽，其中所述动物为哺乳动物。
6.权利要求5的多肽，其中所述哺乳动物为人。
7.权利要求1、2或3的多肽，其中所述多肽是氨基端或羧基端封闭的。
8.一种偶联蛋白，所述偶联蛋白含有载体蛋白以及与之偶联的具有(a)SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63；(b)SEQ ID NO1的肽片段；或(a)或(b)的保守性变异体中任何一个的第二多肽。
9.权利要求8的偶联蛋白，其中所述载体蛋白在水溶液中可溶。
10.权利要求9的偶联蛋白，其中所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、卵白蛋白、小鼠血清白蛋白、兔血清白蛋白。
11.权利要求8的偶联蛋白，其中所述偶联蛋白当用于接种动物时能产生体液或细胞免疫反应。
12.权利要求11的偶联蛋白，其中所述动物为哺乳动物。
13.权利要求12的偶联蛋白，其中所述哺乳动物为人。
14.一种免疫肽，所述免疫肽含有具有(a)SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63；或(b)SEQ ID NO1的片段中任何一个的多肽以及与之偶联的对氨基苯砷酸、对氨基苯磺酸、乙酰基或间三硝苯基。
15.权利要求14的免疫肽，其中所述免疫肽当用于接种动物时能产生体液或细胞免疫反应。
16.权利要求15的免疫肽，其中所述动物为哺乳动物。
17.权利要求16的免疫肽，其中所述哺乳动物为人。
18.一种免疫组合物，所述免疫组合物包含佐剂和具有SEQ IDNO13、14、15、20-59、61-63；或SEQ ID NO1的片段中任何一个的多肽。
19.权利要求18的免疫组合物，其中所述佐剂选自氢氧化铝、脂质A、灭活的细菌、多糖、矿物油、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、磷酸铝、铁盐、锌盐、钙盐、乙酰化酪氨酸、乙酰化糖、阳离子衍生化的多糖、阴离子衍生化的多糖、聚磷腈、生物降解微球、单磷酰脂A和quil A。
20.权利要求18的免疫组合物，其中所述多肽是氨基端或羧基端封闭的。
21.一种氨基酸序列的肽模拟物，所述氨基酸序列具有(a)SEQID NO13、14、15、20-59、61-63；(b)SEQ ID NO1的片段，或(a)或(b)的保守性变异体中任何一个。
22.一种免疫组合物，所述免疫组合物包含佐剂和具有(a)SEQID NO13、14、15、20-59、61-63；(b)SEQ ID NO1的片段，或(a)或(b)的保守性变异体中任何一个的氨基酸序列的肽模拟物。
23.权利要求22的免疫组合物，其中所述佐剂选自氢氧化铝、脂质A、灭活的细菌、多糖、矿物油、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、磷酸铝、铁盐、锌盐、钙盐、乙酰化酪氨酸、乙酰化糖、阳离子衍生化的多糖、阴离子衍生化的多糖、聚磷腈、生物降解微球、单磷酰脂A和quil A。
24.一种核酸片段，所述核酸片段编码具有(a)SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63；(b)SEQ ID NO1的片段的肽，或(a)或(b)的保守性变异体中任何一个的多肽。
25.一种表达盒，所述表达盒包含被操作性地连接到编码具有(a)SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63；(b)SEQ ID NO1的片段的肽，或(a)或(b)的保守性变异体中任何一个的多肽的核酸片段的启动子。
26.权利要求25的表达盒，其中所述启动子为组成型启动子或调节型启动子。
27.一种核酸构建体，所述核酸构建体含有载体和编码(a)具有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个的多肽；(b)SEQ IDNO1的片段的肽；(c)(a)或(b)的保守性变异体的核酸片段；或权利要求25的表达盒。
28.权利要求27的核酸构建体，其中所述载体选自质粒、黏粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体、F因子、病毒、表达载体和噬粒。
29.一种重组病毒，所述重组病毒含有病毒载体和编码(a)具有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个的多肽；(b)SEQ IDNO1的片段的肽；(c)(a)或(b)的保守性变异体的核酸片段；或权利要求25的表达盒。
30.权利要求29的重组病毒，其中所述病毒载体选自牛痘病毒、金丝雀痘病毒、腺病毒和疱疹病毒。
31.一种组合物，所述组合物包含药用载体和(a)具有SEQ IDNO13、14、15、20-59、61-63中任何一个的多肽；(b)SEQ ID NO1的片段的肽；或(c)(a)或(b)的保守性变异体。
32.权利要求31的组合物，其中所述组合物被制成治疗SARS-CoV的制剂。
33.权利要求31的组合物，其中所述组合物被制成抑制SARS-CoV与哺乳动物细胞融合或进入哺乳动物细胞的制剂。
34.一种组合物，所述组合物包含药用载体和编码(a)具有SEQID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个的多肽；(b)SEQ ID NO1的片段的肽；(c)(a)或(b)的保守性变异体的核酸片段；或权利要求30的表达盒。
35.权利要求34的组合物，其中所述组合物被制成治疗SARS-CoV的制剂。
36.权利要求34的组合物，其中所述组合物被制成预防SARS-CoV与哺乳动物细胞融合或进入哺乳动物细胞的制剂。
37.一种病毒性疫苗，所述病毒性疫苗包含药用载体、病毒载体和编码(a)具有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个的多肽；(b)SEQ ID NO1的片段的肽；(c)(a)或(b)的保守性变异体的核酸片段；或权利要求30的表达盒。
38.权利要求34的病毒性疫苗，其中所述病毒性疫苗被制成单位剂量形式。
39.一种肽疫苗，所述肽疫苗包含药用载体和(a)具有SEQ IDNO13、14、15、20-59、61-63中任何一个的肽；(b)SEQ ID NO1的片段；(c)(a)或(b)的肽模拟物；或(d)(a)或(b)的保守性变异体。
40.权利要求39的肽疫苗，其中所述肽疫苗被制成单位剂量形式。
41.一种微生物疫苗，所述微生物疫苗包含药用载体和表达(a)具有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个的肽；(b)SEQID NO1的片段；或(c)(a)或(b)的保守性变异体的微生物。
42.权利要求41的微生物疫苗，其中所述微生物选自沙门氏菌属和单核细胞增生李斯特氏菌。
43.权利要求42的微生物疫苗，其中所述微生物疫苗被制成单位剂量形式。
44.一种DNA疫苗，所述DNA疫苗包含药用载体和插入了编码(a)SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO1的片段；或(c)(a)或(b)的保守性变异体的核酸片段的载体。
45.权利要求44的DNA疫苗，其中所述载体选自质粒、黏粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体、F因子、病毒和噬粒。
46.权利要求44的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗被制成单位剂量的形式。
47.权利要求46的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗进一步含有肌肉坏死剂。
48.权利要求47的DNA疫苗，其中所述肌肉坏死剂为布比卡因或心脏毒素。
49.一种抗体，所述抗体与SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段结合。
50.权利要求49的抗体，其中所述抗体特异性地与SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列；或SEQ IDNO1的片段结合。
51.权利要求49的抗体，其中所述抗体特异性地与S蛋白受体结合区结合。
52.权利要求49的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、抗原结合性的抗体片段或人源化抗体。
53.权利要求52的抗体，其中所述抗原结合性抗体片段是scFv、Fv、Fab′、Fab、双链抗体、线性抗体或F(ab′)2。
54.权利要求49的抗体，其中所述抗体与检测标记物偶联。
55.权利要求54的抗体，其中所述检测标记物是荧光蛋白、荧光标记物、放射性标记物、酶或亲和标记物。
56.权利要求49的抗体，其中所述抗体与毒素偶联。
57.权利要求56的抗体，其中所述毒素是A链毒素、核糖体失活蛋白、α-帚曲霉素、白树毒蛋白、曲霉菌素、局限毒素、核糖核酸酶、表鬼臼毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒素、多柔比星、柔红霉素、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、表鬼臼噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、二羟碳疽菌素二酮、放线菌素D、PE40、相思豆毒蛋白或糖皮质激素。
58.一种药用组合物，所述药用组合物包含药用载体和与SEQID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段结合的抗体。
59.一种免疫哺乳动物以抗严重急性呼吸系统综合征的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的与SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段结合的抗体。
60.权利要求59的方法，其中所述抗体特异性地与SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列；或SEQ IDNO1的片段结合。
61.权利要求59的方法，其中所述哺乳动物为人。
62.一种治疗哺乳动物的严重急性呼吸系统综合征的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的与SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段结合的抗体。
63.权利要求62的方法，其中所述抗体特异性地与SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列；或SEQ IDNO1的片段结合。
64.权利要求62的方法，其中所述哺乳动物为人。
65.权利要求59或62的方法，其中所述抗体与药用载体或稀释剂制成制剂。
66.一种治疗或抑制哺乳动物严重急性呼吸系统综合征的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的含有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列；或SEQ IDNO1的片段的S多肽。
67.一种在哺乳动物体内诱导抗SARS冠状病毒刺突蛋白的免疫反应的方法，所述方法包括给予治疗有效量的含有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列；或SEQ IDNO1的片段的多肽。
68.权利要求67的方法，其中所述多肽含有SEQ ID NO13、14、15、25、34、51、52、56、57、58、59、61、62、63中任何一个所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段。
69.权利要求67的方法，其中所述哺乳动物为人。
70.一种诊断动物严重急性呼吸系统综合征的方法，所述方法包括(a)使获取自动物的生物样品与SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段结合的抗体接触；(b)确定所述抗体是否与所述生物样品结合。
71.权利要求70的方法，其中所述动物为哺乳动物。
72.权利要求70的方法，其中所述哺乳动物为人。
73.一种制备抗体的方法，所述方法包括获得被(a)具有SEQ IDNO1所示的氨基酸序列的多肽的肽片段；(b)具有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列的多肽；(c)(a)或(b)的肽模拟物，或(d)(a)或(b)的保守性变异体免疫的动物；并分离与(a)结合的抗体。
74.一种制备抗体的方法，所述方法包括获得被偶联蛋白免疫的动物，所述偶联蛋白具有载体蛋白以及与之偶联的(a)具有SEQ IDNO1所示的氨基酸序列的多肽的肽片段；(b)具有SEQ ID NO1、13、14、15、20-55中任何一个所示的氨基酸序列的多肽；(c)(a)或(b)的肽模拟物，或(d)(a)或(b)的保守性变异体；并分离与具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的多肽结合的抗体。
75.一种试剂盒，所述试剂盒含有包装材料和与SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列；或SEQ IDNO1片段结合的抗体或适体。
76.权利要求75的试剂盒，其中所述抗体与药用载体或稀释剂制成制剂。
77.权利要求75的试剂盒，进一步包含注射器。
78.一种试剂盒，所述试剂盒含有包装材料和治疗有效量的含有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段的S多肽。
79.权利要求78的试剂盒，其中所述S多肽与药用载体或稀释剂制成制剂。
80.权利要求78的试剂盒，所述试剂盒进一步包含注射器。
81.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性地与SEQ IDNO1、13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列结合。
82.一种分离的多克隆抗体，所述多克隆抗体特异性地与SEQID NO1、13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列结合。
83.一种适体，所述适体与SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、61-63中任何一个所述的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段结合。
84.一种药用组合物，所述药用组合物包含药用载体和与SEQID NO1、13、14、15、20-59、61-63中任何一个所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段结合的适体。
全文摘要
本发明总体涉及到与严重急性呼吸系统综合征(SARS)病原学上相关的病毒的刺突蛋白；刺突蛋白的多肽和肽片段以及它们的保守性变异体；编码刺突蛋白、刺突蛋白的多肽和肽片段、它们的保守性变异体和含有刺突蛋白或其部分的偶联蛋白的核酸片段和构建体；肽模拟物；疫苗；预防和治疗严重急性呼吸系统综合征的方法；抗体；适体；和含有与刺突蛋白结合的抗体和适体的试剂盒。
文档编号A61K39/42GK1852921SQ200480027159
公开日2006年10月25日 申请日期2004年7月20日 优先权日2003年7月21日
发明者D·S·迪米特罗夫, X·肖 申请人:美国政府卫生及公众服务部国家卫生协会