一种蚯蚓中蚓激酶高效提取的方法
【专利摘要】蚯蚓是一种自然中非常重要的动物，其体内含有丰富的蛋白质和多种人体所需的氨基酸，其中一类具有纤溶酶活性的蛋白质——蚓激酶具有很高的药用和经济价值。蚓激酶可通过口服后经肠胃进入血液，降低血液粘稠度和改善微循环，对多种心脑血管疾病具有良好的治疗作用，当前国内外许多科研机构都在致力于这类新药的开发。我国一直有人工养殖蚯蚓的传统，但产品的经济价值较低，本发明旨在提供一种蚓激酶高效提取的方法，采用分段盐析的方式，节省提取成本，提高所提取蚓激酶的活性和纯度。
【专利说明】
一种蚯蚓中蚓激酶高效提取的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种蚯蚓中蚓激酶高效提取的方法，属于生物工程和制药领域。
【背景技术】
[0002]蚯蚓是一种常用的动物药材，在传统中医理论中，蚯蚓具有解热、定惊、利尿、降压等功效。现代研究发现，蚯蚓含有丰富的蛋白质和多种人体所需的氨基酸，其蛋白含量甚至超过大豆蛋白。上世纪80年代，日本研究人员在蚯蚓体内提取出一类具有纤溶酶活性的蛋白质，命名为蚓激酶。蚓激酶具有溶解人体血管内纤维蛋白和激活纤维酶原间接溶解纤维蛋白的双重作用，是目前最具有开发前景的纤溶药物之一。在临床上，蚓激酶可通过口服后经肠胃进入血液，降低血液粘稠度、改善微循环。对心脑血管病、血栓病、高血压、动脉硬化等具有良好的治疗作用。蚓激酶的稳定性好、纤溶活性强、药理作用广泛、口服有效、副作用小，目前国内外许多科研机构都在致力于这类新药的研发。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种蚓激酶的高效提取方法。
[0004]本发明的技术方案如下:
(1)清洗蚯蚓
使用自来水洗涤蚯蚓数次，清洗蚯蚓表面并刺激其排出体内污物，将蚯蚓从水中捞出后，用滤纸吸去多余水分，称重；
(2)匀浆
加入PH为7.8的缓冲液，每克重量蚯蚓加入2ml缓冲液，于匀浆器中匀浆10分钟，破坏蚯蚓细胞膜，使蚓激酶从蚯蚓细胞中释放出来，置于4°C冰箱中冷藏4小时，在4 °C离心机中高速离心10分钟，取上清液；
(3)盐析
向步骤(2 )中的上清液加入硫酸铵，使硫酸铵在溶液中的质量分数为18.5%，高速离心10分钟，收集上清液。再加入硫酸铵使其在溶液中的质量分数为35.9%，于4°C冰箱中静置过夜，高速离心1分钟，收集沉淀；
(4)超滤
向盐析后的沉淀物中加入缓冲液，使其溶解，对溶液进行超滤，去除溶液中的盐和其它小分子物质，同时浓缩溶液体积；
(5)真空冷冻干燥
将超滤后的溶液进行真空冷冻干燥，冷冻温度_60°C以下，升华温度不高于30°C，干燥时间12小时，即可获得蚓激酶干粉。
[0005]本发明优点
本发明采用了分段盐析的方法进行蚓激酶的提取，由于不同的蛋白质的溶解度与等电点不同，沉淀时所需的离子强度也不同，改变盐的浓度与溶液的PH值，可将混合液中的蛋白质分批盐析出来。一般蛋白质在质量分数为15%的硫酸铵溶液中开始沉淀，而当硫酸铵质量分数达到18.5%后，沉淀基本不再增加，故第一次盐析的最佳浓度为18.5%。第二次盐析中硫酸铵的质量分数在32%以上时，都可以算是最佳浓度。虽然当硫酸铵浓度较高时可以沉淀全部蛋白质，但多出来的沉淀很可能不是蚓激酶，反而会使产品纯度降低，所以选择35.9%作为第二次盐析的浓度。
【具体实施方式】
实施例
[0006](I)清洗蚯蚓
取活蚯蚓，使用自来水洗涤蚯蚓数次，清洗蚯蚓表面并刺激其排出体内污物，将蚯蚓从水中捞出后，用滤纸吸去多余水分；
(2)匀浆
称取清洗沥干后的蚯蚓10g，加入200 ml pH为7.8的缓冲液(磷酸氢二钠3.58g，加水溶解并稀释至100 ml为A液，取磷酸二氢钠0.78g，加水溶解并稀释至500 ml为B液，将A、B两液混合至PH为7.8)，于匀浆器中匀浆10分钟，破坏蚯蚓细胞膜，使蚓激酶从蚯蚓细胞中释放出来，置于4 °C冰箱中冷藏4小时，在4 °C离心机中10000 rpm离心1分钟，取上清液；
(3)盐析
向步骤(2 )中的上清液加入硫酸铵，使硫酸铵在溶液中的质量分数为18.5%，高速离心10分钟，收集上清液。再加入硫酸铵使其在溶液中的质量分数为35.9%，于4°C冰箱中静置过夜，高速离心1分钟，收集沉淀；
(4)超滤
向盐析后的沉淀物中加入200 ml缓冲液，使其溶解，使用截留分子量为7k的超滤膜对溶液进行超滤，去除溶液中的盐和其它小分子物质，200 ml的溶液，超滤后体积为50 ml，浓缩4倍；
(5)真空冷冻干燥
超滤后的溶液进行真空冷冻干燥，冷冻温度_60°C以下，升华温度不高于30°C，干燥时间12小时，蚓激酶酶粉产率为蚯蚓重量的3-5%，经酶活测定，所得蚓激酶酶粉的酶活为1250u/mgo
【主权项】
1.一种蚓激酶的高效提取方法，其特征在于: (1)使用pH为7.8的磷酸盐作为缓冲液，每克重量艇蚓加入2ml缓冲液； (2)采用分段盐析提取蚓激酶，向匀浆离心后的上清液中加入硫酸铵，使硫酸铵的质量分数为18.5%，高速离心1分钟，收集上清液。2.再加入硫酸铵至质量分数为35.9%，于4°C冰箱中静置过夜，高速离心10分钟，收集沉淀。3.根据权利要求1所述的蚓激酶高效提取方法，其特征在于所述第(I)步中使用pH为7.8的磷酸盐作为缓冲液。4.根据权利要求1所述的蚓激酶高效提取方法，其特征在于所述第(I)步中每克重量蚯虫弓丨加入2ml缓冲液。5.根据权利要求1所述的蚓激酶高效提取方法，其特征在于所述第(2)步中采用分段盐析提取蚓激酶，第一次盐析硫酸铵的质量分数为18.5%，第二次盐析硫酸铵质量分数为.35.9%o
【文档编号】C12N9/68GK105907738SQ201610525548
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】黄访, 王红, 李维尊, 王强, 黄磊, 胡会信
【申请人】奥为（天津）环保科技有限公司