专利名称：从日本杜拉蚓中提取蚯吲素的方法
技术领域：
本发明涉及从蚯蚓中提取一类多肽化合物的方法。
人民卫生出版社1986年出版的《生药学》记载“蚯蚓体内含有地龙素、地龙解热碱、次黄票呤等”。实验表明地龙素和蚯蚓素是两种不同的组份，地龙素是一类大分子化合物，而蚯蚓素是一类小分子化合物。在药效学作用方面两者也相差甚远，地龙素有溶血作用，而蚯蚓素则具有消炎抗菌、抗病毒、抗过敏、改善微循环和降血压的作用。
CN1039902A，申请号93105054.5、申请日930518，公开了蚯蚓溶纤素的制备方法。CN1037345A公开了一种地龙溶栓酶的制备及其鉴定方法。蚯蚓溶纤素和地龙溶栓酶其药用功效主要是有溶血栓作用。
本发明的目的就是提供一种从蚯蚓中提取蚯蚓素的方法，用这种方法可有效地从日本杜拉蚓中提取所需的蚯蚓素。
从日本杜拉蚓中提取蚯蚓素的方法，包括蚯蚓洗涤、破碎、分离、干燥等工艺，其特征在于a、将日本杜拉蚓洗涤后，加入生理盐水进行破碎，得到匀浆液；b、将匀浆液在4℃-8℃的低温下保持6-8小时，离心收集得粗提液；c、在粗提液中加入6.45-0.55饱和度的硫酸铵盐析去杂蛋白，然后经透析24-72小时或者用1#或2#超滤膜超滤除盐得上清液；d、将上清液调PE值至6.1-6.8，取4#或5#超滤膜采用平板超滤法对上清液进行超滤，压力在35-45KPa下浓缩分离，收集超滤液得精制液；c、将精制液经真空冷冻干燥或喷雾干燥得蚯蚓素。
本发明的优点在于用这种方法可有效地从日本杜拉蚓中提取蚯蚓素，所提取的蚯蚓素对中枢神经系统、循环系统、呼吸系统和消化系统无明显影响。用蚯蚓素研制的产品系列用途广泛，可治疗哮喘、百日咳、带状疱疹、皮肤皲裂、过敏性皮炎以及烧烫伤多种疾病；还有降压作用。
实施例a、取活日本杜拉蚓清水漂洗至胃肠道中污物排泄干净，用蒸馏水反复冲洗2-3次，加入当量浓度为0.15mol/l的NaCl溶液，置高速组织捣碎机中制成组织匀浆。
b、将匀浆用搅拌机作轻微搅拌，放在4℃低温下保持6-8小时，4000转/分离心分离得粗提液。
c、将粗提液以0.45-0.55饱和度的硫酸铵盐析去杂蛋白，然后经透析24小时后得上清液。
d、上清液调PH值至6.1-6.8，取5#超滤膜采用平板超滤法将上清液进行超滤，压力在35-45KPa下浓缩分离得精制液。
e、将精制液经喷雾干燥得蚯蚓素。
以下实验可表明蚯蚓素是一类多肽化合物。
1、精确称取蚯蚓素0.001g，置100ml容量瓶中加水溶解至刻度。取该溶液用751-CW紫外分光光度计检测，在228nm和253nm处有特征吸收峰，最大吸收峰在253nm处。
2、取上述溶液5ml于试管中，加双缩脲试剂5ml，摇匀，放置到85℃水浴中保温5-8分钟，试管底部出现有红色沉淀。
3、分别取上述蚯蚓素溶液5ml于试管中，费林试验阴性，双缩脲反应阳性；再取蚯蚓素溶液5ml，加0.5mol/l的Hcl溶液1ml，放置到85℃水浴中水解30分钟后，费林试验阴性，双缩脲反应阳性。
由以上实验分析蚯蚓素不是蛋白质、核酸或多糖类，而是一类多肽化合物。
蚯蚓素毒性实验取小白鼠60只，按性别、体重均衡随机分成六组，每组10只。在Dmax(100％)致死量和Dmin(0％致死量)的范围内选择剂量，剂量的比值(1∶r)为1∶0.8，尾静脉注射给药，给药体积为0.15ml/10g体重，一次给药后，观察七天，记录动物中毒，死亡和存活的情况，按Bliss统计法测定LD50。
结果，蚯蚓素静脉注射给药后，可见动物出现不同程度的毒性反应Dmax100％致死量即注射量为4687.5毫克/公斤时，动物出现精神萎糜不振，步态不稳，活动减少，倦缩，拱背，皮毛蓬松，嗜睡，进食停止，口鼻及尾部皮肤青紫等，于给药后立即-3小时内死亡；Dimn50％致死量即注射量为2950毫克/公斤时，毒轻者，动物活动减少，拱背，倦卧，但可进食，口鼻及尾部皮肤无青紫，于给药后30分钟内症状缓解，逐渐恢复正常，连续观察七天，动物的行为、活动、呼吸、饮食、粪尿、毛色及对外界刺激反应均正常，且无动物死亡。实验测得，LD50是2914.74±305.43，表明蚯蚓素安全无毒治疗宽度大。
一般药理实验一、对中枢神经系统的作用(一)镇痛作用1、扭体法取小鼠30只，18-22g，雌雄各半，随机分为三组1组为蚯蚓素组(0.09g/kg)；2组为阿斯匹林组(0.3g/kg)；3组为生理盐水组(10ml/kg)。1、3组小鼠肌肉注射给药，2组小鼠灌胃给药，每天一次，连续三天，于末次给药30分钟后，用0.6％冰醋酸0.2ml/只腹腔注射致痛，计算15分钟内小鼠扭体次数，进行统计学处理，结果见表一。
2、热板法取经过挑选的小鼠30只，18-22g，雌雄各半，随机分为三组；1组为蚯蚓素(0.09g/kg)。2组为阿斯匹林组(0.03g/kg)；3组为生理盐水组(10ml/kg)。1组、3组肌肉注射给药，2组灌胃给药，于末次给药后30分钟按热板法实验，结果见表二。
蚯蚓素肌肉注射0.03g/kg，从表一、表二可以看出，无论是扭体法还是热板法均无镇痛作用，而阿斯匹林则有显著的镇痛作用。
(二)镇静作用取小鼠30只，18-22g，雌雄各半，随机分为三组1组为蚯蚓素组(0.09g/kg)；2组为养血安神片组(3g/kg)；3组为生理盐水组(10ml/kg)，1、3组小鼠肌肉注射给药，2组小鼠灌胃给药，每天一次，连续三天，于末次给药30分钟，小鼠腹腔注射戊巴比妥纳35mg/kg，以翻正反射消失为睡眠指标，观察各组小鼠睡眠时间的长短，进行统计学处理，结果见表三。
蚯蚓素对小鼠腹腔注射戊巴比妥纳引起的睡眠无协同作用，而养血安神片则有明显镇静作用。
二、对消化系统的作用(一)对大鼠原位肠(空肠)的作用；取体重226-269g大鼠30只，每10只为一组，共分三组，即蚯蚓素组、阿托品组和生理盐水组。分别戊巴比妥纳35mg/kg剂量腹腔注射麻醉下，取大鼠空肠悬吊于拉力换能器上，换能器连接台式平衡仪，平衡15分钟，然后分别注射蚯蚓素、阿托品和生理盐水，观察3小时，记录3小时内大鼠空肠活动曲线，曲线记录速度为6mm/min。
1、蚯蚓素组大鼠空肠活动曲线见
图1蚯蚓素肌肉注射剂量112.5mg/kg，从图1不难发现，注射蚯蚓素前后，大鼠空肠收缩频率、振幅、肌张力均无明显改变。
2、阿托品组大鼠空肠活动曲线见图2阿托品注射剂量为0.5mg/kg，从图2可以看出，注射阿托品后大鼠空肠收缩频率减慢，振幅低，肌张力下降。
3、生理盐水组大鼠空肠曲线见图3生理盐水注射剂量为2mg/kg，注射前后，大鼠空肠收缩频率、振幅、肌张力均无明显变化。
(二)对豚鼠离体肠(回肠)的作用取体重240-280g豚鼠30只，每10只为一组，共为三组，即蚯蚓素组、阿托品组和生理盐水组。分别击头处死，取出回肠，剪取1.0-1.5cm段肠管，一端悬吊于麦氏浴槽中，另一端连接在拉力换能器上，换能器连接台式平衡仪，负重2g，平衡15-20分钟后，分别在浴槽中加入蚯蚓素、阿托品、生理盐水，观察3小时，记录3小时内豚回肠活动曲线。记录速度为4mm/min。
1、蚯蚓素组，蚯蚓素对豚鼠回肠活动曲线见图4蚯蚓素溶液浓度为1×10-4g/l，由图4可看出豚鼠回肠收缩频率减慢，振幅降低，肌张力下降。
2、阿托品组，阿托品对鼠离体回肠的影响见图5阿托品溶液浓度为1×10-4g/l，注入阿托品1小时后，豚鼠回肠收缩频率减慢，振幅降低，肌张力下降。
3、生理盐水组，生理盐水注入后豚鼠回肠活动曲线见图6生理盐水注入前后，豚鼠回肠收缩频率、振幅、肌张力均无变化。
三、对大鼠血压、心电作用的影响取大鼠30只，体重220-250克，雌雄均用。先取10只大鼠以戊巴比妥钠35mg/kg行腹腔注射麻醉，描记右侧颈总动脉血压及导程心电图，待血压稳定15分钟后，记录二次血压与心电(取其平均值)。然后肌肉注射112.5mg/kg蚯蚓素，每隔半小时记录一次血压和心电，连续3小时。结果比较血压波动在26.66/23.99kpa之间，10只大鼠结果相似；导程心电频率、P波、QRS波、ST段和T波无明显差异。另取10只大鼠，实验方法同上，肌肉注射生理盐水2ml/kg，每隔半小时记录一次血压和心电，连续3小时。结果比较血压波动在26.66/23.99之间；导程心电电频率、P波、QRS波、ST段和T波无明显差异。
再取10只大鼠，实验方法同上，肌肉注射生理盐水2ml/kg，每隔半小时记录一次血压的心电，连续3小时。结果比较血压波动在26.66/23.99之间；导程心电频率、P波、QRS波、ST段和T波无明显差异。
四、对大鼠呼吸功能作用的影响取大鼠30只，体重220-250克，雌雄均用，先取10只用戊巴经妥纳35mg/kg腹腔注射麻醉，在大鼠胸廓皮肤穿一缝线打结，另一端联于拉力换能器上，拉力换能器与台式平等记录仪相联，待呼吸平稳后，描记大鼠正常呼吸曲线。然后肌肉注射蚯蚓素112.5mg/kg，每隔半小时记录一次呼吸，连续3小时，结果比较9只大鼠呼吸频率无明显变化，1只大鼠于给药后至2小时内呼吸频率增快30％，深度变浅，2小时后逐渐恢复正常。
另取10只大鼠，实验方法同上，肌肉注射可刹米375mg/kg，每隔半小时记录一次呼吸，连续3小时。结果比较10只大鼠呼吸频率稍慢，呼吸度增加一倍，表现出呼吸兴奋现象。
再取10只大鼠，实验方法同上，肌肉注射生理盐水2ml/kg，每隔半小时记录一次呼吸，连续3小时。结果比较呼吸频率和深度均无明显差异。
由一般药理实验可以看出蚯蚓素对小鼠的中枢神经系统和空肠无明显影响，对回肠则有减缓蠕动的作用。对大鼠的血压、心电频率、P波、QRS波、ST段和T波、呼吸的深度和频率无明显影响。
表一 蚯蚓素对醋酸所致小鼠疼痛的影响(扭体法)组 别 剂 量动物数 扭体次数(X±SD)蚯蚓素组 0.09g/kg1010.40±4.81*阿斯匹林组0.30g/kg105.20±10.12**生理盐水组10ml/kg 1012.10±10.12表二蚯蚓素对疼痛的影响(热板法)组 别 剂 量动物数扭体次数(X±SD)蚯蚓素组 0.09g/kg10 26.10±5.82*阿斯匹林组0.30g/kg10 32.40±9.03**生理盐水组0.30g/kg10 24.40±5.27表三蚯蚓素对小鼠的镇静作用组 别 剂 量动物数 扭体次数(X±SD)蚯蚓素组 0.09g/kg10 48.40±19.03*养血安神片组 3g/kg 10 64.60±9.69**生理盐水组10ml/kg 10 45.70±23.19与生理盐水组比较*P＞0.05 **P＜0.0权利要求
1.从日本杜拉蚓中提取蚯蚓素的方法，包括蚯蚓洗涤、破碎、分离、干燥等工艺，其特征在于a、将日本杜拉蚓洗涤后，加入生理盐水进行破碎，得到匀浆液；b、将匀浆液在4℃-8℃的低温下保持6-8小时，离心收集得粗提液；c、在粗提液中加入0.45-0.55饱和度的硫酸铵盐析去杂蛋白，然后经透析24-72小时或者用1#或2#超滤膜超滤除盐得上清液；d、将上清液调PH值至6.1-6.8，取4#或5#超滤膜采用平板超滤法对上清液进得超滤，压力在35-45KPa下浓缩分离，收集超滤液得精制液；c、将精制液经真空冷冻干燥或喷雾干燥得蚯蚓素。
全文摘要
从日本杜拉蚓中提取蚯蚓素的方法,a．将日本杜拉蚓洗涤后破碎,得到匀浆液;b．将匀浆液在4℃—8℃的低温下保持6—8小时,离心收集得粗提液;c．在粗提液中加入硫酸铵盐析去杂蛋白,然后经透析或者用超滤膜超滤除盐得上清液;d．将上清液调pH值至6.1—6.8,取文档编号A61P17/00GK1200927SQ97111350
公开日1998年12月9日 申请日期1997年5月29日 优先权日1997年5月29日
发明者陈可夫 申请人:湖北省荆门卫生学校