专利名称：一种具有电泳纯的蚓激酶及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种自赤子爱胜蚓(Eisenia foelide)中提取的可用于缺血性脑血管疾病治疗的蚓激酶及其制备方法和用途。
背景技术：
心脑血管病是严重危害人类健康和生命的主要疾病，血浆中含量最高的凝血因子纤维蛋白原(Fg，凝血因子I)，是心脑血管疾病的独立危险因子。降低纤维蛋白原是治疗脑梗等血栓性疾病主要的临床手段，因此研制降纤药物有重大的经济和社会效益。
目前临床用于注射治疗缺血性脑血管疾病的药物有不少，包括链激酶、尿激酶、巴曲酶、组织型纤溶酶原激活剂等等。这些药物有的抗原性强，治疗效果不明显，有的半衰期短，原材料来源困难，有的制备工艺复杂，价格昂贵，依赖进口，而大多数此类药物共同的缺点是具有出血毒性。
临床常见的可用于降纤，抗栓的口服类药物，如百奥蚓激酶胶囊(国药准字H11021129)，该药是从赤子爱胜蚓中提取的含有多个纤溶活性蛋白同功酶组分的蚓激酶原料药制备而成，目前已经广泛用于脑血栓的预防和治疗，其疗效和安全性已得到医生和患者的肯定。但是口服药物发挥作用时间较慢，且蛋白类药物的最佳给药途径为注射给药。由于蛋白同功酶理化性质较接近而导致分离纯化困难，并且这些同功酶有不同的含量、活性和毒性，如果选用了毒性大的组分，则很难制成安全的药品，纯度和毒性这两个问题成为蚓激酶注射剂难以面世的主要困难。
各国的研究人员都在努力发展分离纯化技术，力图从蚯蚓中提取毒性低，溶栓性能好的高纯度蛋白。日本人Mihara等从粉正蚓(Lumbricus rubellus)中纯化出6个具有纤溶活性的蛋白酶组分(美国专利号4,568,545)，其小鼠静脉注射半数致死量分别为33，38，114，135，88和27毫克/公斤，各组分毒性相差较大。但是，其分离纯化工艺复杂，难以工业化扩大生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用阴离子交换层析及超滤法从赤子爱胜蚓中提取电泳纯度的蚓激酶，并作为用于制备降纤药物的原料。本发明采用的方法所涉及的离子交换介质重复使用次数远远大于常见报道中纯化蛋白质常用的疏水层析和亲和层析介质，从而很好的降低了产品成本，利于工业放大。
本发明进一步的目的是提供蚓激酶在制备低毒、高效的注射用降纤药物中的应用。
本发明的蚓激酶是通过如下步骤制备得到的a.将赤子爱胜蚓粗提物或从赤子爱胜蚓中分离纯化而得的口服用蚓激酶原料药配制成上样缓冲液；b.高载量或高流速的阴离子交换层析柱用缓冲液平衡，上样并冲洗后，用含有0-1M的NaCl缓冲液梯度洗脱，收集蛋白峰；c.将步骤b中所获的蛋白峰常规超滤浓缩脱盐，或用Sephadex G-25进行缓冲液替换并脱盐；d.高分辨率的阴离子交换层析柱用缓冲液平衡，将步骤c中所获样品上样并冲洗后，用0-1M的NaCl缓冲液梯度洗脱，收集蛋白峰，经过常规超滤或Sephadex G-25层析脱盐处理后即可得电泳纯的蚓激酶。
其中步骤a、b、d中优先采用磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl)或巴比妥-氯化钠缓冲液；步骤b中优先选用阴离子交换介质商品名为Q Sepharose XL、Q Sepharose Fast Flow或DEAE Sepharose FastFlow；步骤b中优先选用含0-0.5M的NaCl缓冲液梯度洗脱；步骤d中优选阴离子交换介质商品名为Q Sepharose High Performance；步骤d中优选用含0-0.3MNaCl缓冲液梯度洗脱；步骤c、d中优选装有截留分子量为1K、3K或5K膜包的超滤系统，或含有相同截留分子量膜片的超滤杯。
本发明涉及的从赤子爱胜蚓中分离纯化的上述方法中获得的蚓激酶，具有如下生化特性(1)包含两主要组分A和B，分子量分别为24000±1000和24000±1000；(2)组分A和B的等电点分别为4.5±1.0和4.0±1.0；(3)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一条带；
(4)高效液相凝胶过滤色谱为单一峰；(5)小鼠静脉注射半数致死量为55～65毫克/公斤；(6)该酶组分的纤溶活性为120000±24000蚓激酶单位/毫克。
本发明的方法是根据蚓激酶是酸性蛋白酶的特点，先用高载量或高流速的阴离子交换介质对目标蛋白进行捕获，然后采用高分辨率的阴离子交换介质进一步细分。该制备方法简单，重复性好，易放大，所用层析介质均可多次使用，有利于作为工业放大的药物制备。所获蚓激酶可达电泳纯，在毛细管等电聚焦测定蚓激酶等电点和MALDI-TOF-MS测定蚓激酶分子量时，蚓激酶中的两组分表现出的生化性质极为相近，经测定蚓激酶毒性低(半数致死量为60.13毫克/公斤)，纤溶活性高(比活力为120000±24000蚓激酶单位/毫克)，安全有效，适用于制备静脉注射用冻干粉针和水针。
图1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蚓激酶纯度其中泳道1为10μg样品的电泳情况；泳道2为分子量标记；泳道3为20μg样品的电泳情况。
图2.高效液相凝胶过滤色谱测定蚓激酶纯度图3.聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蚓激酶纯度图4.毛细管等电聚焦测定蚓激酶的组分A的等电点图5.毛细管等电聚焦测定蚓激酶的组分B的等电点图6.基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定蚓激酶的组分A的分子量图7.基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定蚓激酶的组分B的分子量具体实施方式
本发明在制备蚓激酶过程中所用层析介质均为安法玛西亚有限公司产品。
实施例1取5克北京百奥药业有限责任公司生产的口服蚓激酶原料药，批号20010913-3，比活力为12090.8单位/毫克，用pH7.5的0.02M磷酸盐缓冲液充分溶解并定容到100毫升，0.45μm微孔滤膜过滤取滤液。20毫升的DEAESepharose Fast Flow阴离子交换层析柱用pH7.5的0.02M磷酸盐缓冲液平衡，上样20毫升后冲洗一个柱体积，用0-0.5M NaCl磷酸盐缓冲液梯度洗脱，洗脱时间为30分钟，收集有纤溶活性的蛋白峰约15毫升。将5次DEAESepharose Fast Flow阴离子交换层析柱层析所得样品合并后用3K超滤杯脱盐并浓缩，用pH7.8的0.02M巴比妥—氯化钠缓冲液替换到体积为10毫升。分两次用20毫升Q Sepharose HP阴离子层析柱层析，Q Sepharose HP阴离子交换层析柱用pH8.0的0.02M巴比妥—氯化钠缓冲液平衡，上样后冲洗一个柱体积，用含0-0.3M NaCl的巴比妥—氯化钠缓冲液梯度洗脱，洗脱时间40分钟，收集0.15-0.20M NaCl范围内的活性洗脱单峰共计22毫升，用SephadexG-25柱脱盐，所得样品再用1K超滤杯浓缩即得40毫克电泳纯蚓激酶。该制备方法在多次小试和中试试验中均表现了良好的重现性和可放大性。
实施例2取10克北京百奥药业有限责任公司生产口服蚓激酶原料药，批号20010913-3，比活力为12090.8单位/毫克，用pH7.8的0.02M巴比妥—氯化钠缓冲液充分溶解并定容到100毫升，0.45μm微孔滤膜过滤取滤液。20毫升的Q Sepharose XL阴离子交换层析柱用pH7.8的0.02M巴比妥—氯化钠缓冲液平衡，上样25毫升后冲洗一个柱体积，用0-1M NaCl的巴比妥—氯化钠缓冲液梯度洗脱，洗脱时间为50分钟，收集有纤溶活性的蛋白峰约20毫升。将4次Q Sepharose XL阴离子交换层析柱层析所得样品合并后用3K超滤杯脱盐并浓缩，用pH8.0的0.02M Tris-HCl缓冲液替换到体积为12毫升。分三次用20毫升Q Sepharose HP阴离子交换层析柱层析，Q Sepharose HP阴离子交换层析柱用pH8.5的0.02M Tris-HCl缓冲液平衡，上样后冲洗一个柱体积，用0-0.3M NaCl Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，洗脱时间40分钟，收集0.20-0.25M NaCl范围内的活性洗脱单峰共计28毫升。用1K超滤杯浓缩脱盐即得75毫克电泳纯蚓激酶。
实施例3取50克北京百奥药业有限责任公司生产口服蚓激酶原料药，批号2002120，比活力为15507.6单位/毫克，用pH7.5的0.02M磷酸盐缓冲液充分溶解并定容到1000毫升，0.45μm微孔滤膜过滤取滤液。300毫升的QSepharose XL阴离子交换层析柱用pH7.5的0.02M磷酸盐缓冲液平衡，上样500毫升后冲洗一个柱体积，用0-0.5M NaCl磷酸盐缓冲液梯度洗脱，洗脱时间为75分钟，收集有纤溶活性的蛋白峰约300毫升。将2次Q Sepharose XL阴离子交换层析柱层析所得样品合并后用5K超滤系统浓缩，用pH7.8的0.02M巴比妥—氯化钠缓冲液替换到体积为200毫升。分五次用300毫升QSepharose HP阴离子交换层析柱层析，Q Sepharose HP阴离子交换层析柱用pH7.8的0.02M巴比妥—氯化钠缓冲液平衡，上样后冲洗一个柱体积，用0-0.3M NaCl巴比妥—氯化钠缓冲液梯度洗脱，洗脱时间1.5小时，收集0.10-0.15M范围内的活性洗脱单峰共计1200毫升。用1K超滤系统浓缩脱盐即得400毫克电泳纯蚓激酶。
实施例4对实施例1中纯化所得蚓激酶的鉴定如下(1)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为10％，电泳浓缩时间1小时，电压80V；电泳分离时间为2小时，电压200V，蚓激酶YJM-IV上样量分别为10μg和20μg，所用标样的分子量为97400，66200，42700，31000，14400。电泳结束后用考马斯亮蓝染色仅得到单一条带，该结果显示蚓激酶为电泳纯，电泳图如图1所示。
(2)高效液相凝胶过滤色谱用高效液相凝胶过滤色谱，进一步对蚓激酶进行鉴定。凝胶柱为SEC250(7.8×300mm)，用pH6.8，0.2M的磷酸盐缓冲液，以1.0毫升/分钟的流速洗脱，所得主峰面积为99.8％，层析图谱见图2。
高效液相凝胶过滤色谱试验结果进一步证实蚓激酶有很高的纯度。
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶浓度为12％，电泳浓缩时间2小时，电压200V；蚓激酶上两个平行样，上样量为5μg，电泳结束后用1％硝酸银染色，蚓激酶显色为两条带，电泳图如图3所示，主带为组分A，次带为组分B。两组分百分含量分别为90±5％，10±5％。
(4)毛细管等电聚焦测定蚓激酶的等电点用毛细管等电聚焦法测定蚓激酶中组分A和组分B的等电点。采用Beckman公司P/ACE5000型毛细管电泳仪，27cm×50Hm毛细管。电压13.75KV，聚焦2分钟，压力迁移。阳极液91mmol/l磷酸凝胶液，阴极液20mmol/lNaOH溶液，检测280nm，柱温20℃。分别测定蚓激酶中组分A和组分B的等电点为4.72和3.78，图谱见图3，4。
(5)用质谱测定蚓激酶的分子量用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分别测定蚓激酶中组分A和组分B的分子量为24177和24227，图谱见图5，6。
(6)比活力测定通过纤维平板法(国家药品标准WS1-(X-053)-20012)测定蚓激酶的比活力为120,000蚓激酶单位/毫克。
(7)蚓激酶-I的半数致死量(LD50)测定。按国家新药审评要求，采用Bliss法测定蚓激酶-I的半数致死量。昆明小鼠尾静脉注射给药，给药剂量为32.8mg/kg-100.0mg/kg，剂距为0.8，共6个剂量，测得半数致死量为60.13mg/kg。
权利要求
1.一种具有电泳纯的蚓激酶，它是由如下步骤制得的a.将从赤子爱胜蚓中所得的粗提物或从赤子爱胜蚓中分离纯化而得的口服用蚓激酶原料药配制成上样缓冲液；b.高载量或高流速阴离子交换层析柱用缓冲液平衡，上样并冲洗后，用含有0-1M的NaCl缓冲液梯度洗脱，收集蛋白峰；c.将步骤b中所获的蛋白峰超滤浓缩脱盐，或用Sephadex G-25进行缓冲液替换并脱盐；d.高分辨率阴离子交换层析柱用缓冲液平衡，将步骤c中所获样品上样并冲洗后，用0-1M的NaCl缓冲液梯度洗脱，收集蛋白峰经过超滤或Sephadex G-25层析脱盐处理后获得电泳纯的蚓激酶。
2.如权利要求1所述的具有电泳纯的蚓激酶，其特征在于，所述的步骤a、b、d中所采用的缓冲液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液或巴比妥-氯化钠缓冲液。
3.如权利要求1所述的具有电泳纯的蚓激酶，其特征在于，所述的步骤b中用含0-0.5M的NaCl缓冲液梯度洗脱。
4.如权利要求1所述的具有电泳纯的蚓激酶，其特征在于，所述的步骤d中用含0-0.3M的NaCl的缓冲液梯度洗脱。
5.如权利要求1所述的具有电泳纯的蚓激酶，其特征在于，所述的步骤b中阴离子交换介质为Q Sepharose Fast Flow或Q Sepharose XL或DEAESepharose Fast Flow。
6.如权利要求1所述的具有电泳纯的蚓激酶，其特征在于，所述的步骤d中阴离子交换介质为Q Sepharose High Performance。
7.如权利要求1所述的具有电泳纯的蚓激酶，其特征在于，所述的步骤c、d中超滤用装有截留分子量为1K或3K或5K膜包的超滤系统，或含有相同截留分子量膜片的超滤杯。
8.一种权利要求1所述的方法制备的具有电泳纯的蚓激酶，具有如下生化特性(1)包含两主要组分A和B，分子量分别为24000±1000和24000±1000；(2)组分A和B的等电点分别为4.5±1.0和4.0±1.0；(3)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一条带；(4)高效液相凝胶过滤色谱为单一峰；(5)小鼠静脉注射半数致死量为55～65毫克/公斤；(6)该酶组分的纤溶活性为120000±24000蚓激酶单位/毫克。
9.一种权利要求1或8所述的具有电泳纯的蚓激酶在用于制备降纤药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种自赤子爱胜蚓中提取的具有电泳纯的蚓激酶，可用于缺血性脑血管疾病的治疗。采用的分离制备方法主要包括阴离子交换层析、超滤法、凝胶过滤脱盐，所获蛋白酶可达电泳纯，可用于制备静脉注射用冻干粉针和水针的原料。本发明制备方法简单，重复性好，易放大。用本发明的制备方法所获得的蚓激酶毒性低，纤溶活性高，安全有效。
文档编号C12N9/64GK1506459SQ0314669
公开日2004年6月23日 申请日期2003年7月14日 优先权日2002年7月12日
发明者刘建蓉, 梅运红, 李树东, 侯全民 申请人:北京百奥药业有限责任公司