一株生防枯草芽胞杆菌泛革素的分离纯化方法

一株生防枯草芽胞杆菌泛革素的分离纯化方法
【专利摘要】本发明涉及一株生防枯草芽胞杆菌Bs916胞外抗菌脂肽泛革素及其分离纯化方法。泛革素含有5个结构变异体，分属于两类不同的相差一个亚甲基的同系物。其分离纯化的方法是：首先通过基因敲除构建Bs916合成泛革素能力丧失的突变株BBLM；其次从BBLM的发酵液中采用酸沉淀和甲醇抽提制备泛革素的粗提物，再次经过NH2和C18层析柱分离纯化泛革素。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱分析表明制备的杆菌霉素L达到电泳纯和色谱纯。纯化的泛革素对开发为抗真菌药物具有较高的研究和应用价值，也可用作为生物化学上的标准品使用。
【专利说明】一株生防枯草芽胞杆菌泛革素的分离纯化方法

【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一株生防枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis Bs916的胞外脂肽抗生素 泛革素的分离纯化方法。

【背景技术】
[0002] 枯草芽胞杆菌能作为一种重要的生防菌，普遍认为主要归功于其能产生耐热、抗 逆的芽孢和能分泌丰富的次生抗菌代谢产物，因此具有较强的环境适用能力和生态竞争能 力，被广泛的应用于植物真菌病害和细菌病害的防治。枯草芽胞杆菌分泌的抗菌代谢产物 根据其合成途径和结构大体上可以分为四大类：1)羊毛硫抗生素（lantibiotics)，是通过 核糖体合成途径合成前导肽，再经过剪切、二硫键形成等后修饰后形成成熟的抗菌肽，主要 是作用于敏感细菌的细胞质膜导致原生质体泄露而抑制病原细菌的生长；2)脂肽类抗生 素，是通过非核糖体合成途径合成的一类由环状短肽头部和脂肪酸链尾巴组成的杂合双亲 性抗生素，具有广谱的抗菌活性和溶血性能；3)聚酮类抗生素，是通过聚酮合成酶合成的 具有结构多样性的一类生素，也表现出强烈的抗细菌活性；4)其它非蛋白质性质的结构迥 异的抗生素。
[0003] 脂肽类抗生素由于其理化性质较为稳定，具有较好的热、酸碱稳定性，对有机溶剂 和蛋白酶有较强的耐受性，特别是其广泛的抗真菌、细菌、病毒和卵菌活性，因此在生物技 术和生物制药领域都具有广泛的应用前景。在脂肽抗生素家簇中，由玫瑰孢链霉菌产生的 达托霉素（Daptomycin)是首个临床上用于治疗一些革兰氏阳性病原体所引起皮肤感染的 药物，2003年它在美国以商品名"Cubicin"批准上市。脂肽类抗生素根据其化学结构的差 异可分为表面活性素（Surfactin)、伊枯草素（Iturin)和泛革素（Fengycin)三大家簇。表 面活性素家簇结构特点是由7个氨基酸残基的多肽链通过酯键与含有13?15个碳原子 β -羟基脂肪酸交联形成内酯环状结构的极性化合物。表面活性素表现出较强溶血活性、抑 制细菌和病毒的活性。伊枯草素家簇结构特点是由7个氨基酸残基的多肽链与含有14? 17 β -氨基脂肪酸链相连形成的化合物。伊枯草素也具有较强的溶血活性和强的抗真菌 活性。泛革素家簇结构的特点是由10个氨基酸残基的多肽链通过酯键与含有14?18个 β-羟基饱和或非饱和的脂肪酸交联形成内酯环。泛革素的溶血作用虽然没有表面活性素 和伊枯草素强烈，但表现出强烈的抗真菌活性，具有潜在开发为抗真菌制剂的前景。
[0004] 目前通过构建产脂肽抗生素缺失突变株及突变株抗菌性能的研究表明脂肽抗生 素是枯草芽胞杆菌拮抗病原真菌的主要因子。一株具有优良拮抗性能的枯草芽胞杆菌菌株 通常能同时合成分泌表面活性素、伊枯草素和泛革素；其中任一一种脂肽类抗生素合成能 力的缺失都会导致突变株抗真菌活性不同程度的下降；当其中两种或者三种脂肽类抗生素 合成能力的全部缺失，会极大的降低或者导致突变株完全丧失抗真菌活性。表面活性素、伊 枯草素和泛革素对植物病原真菌具有协同增效作用。
[0005] 泛革素是脂肽类抗生素重要家簇之一，通过构建泛革素合成能力丧失突变株，及 对泛革素的生物学功能研究表明泛革素具有极高的广谱抗真菌活性，是生防枯草芽胞杆菌 抗真菌的关键因子，具有潜在开发为抗真菌制剂的应用前景。因此，建立一种高效的分离方 法纯化泛革素的方法具有重要的价值。
[0006] 通常筛选到的一株高产泛革素的枯草芽胞杆菌菌株，其还能分泌伊枯草素和表面 活性素，由于这三类脂肽类化合物的理化性质相近，因此不容易通过简单的纯化方法将它 们分开，特别是将伊枯草素和泛革素进行分离。
[0007] 枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis Bs916是江苏省农业科学院20世纪90年代分 离的生防菌，对水稻纹枯病具有很好的防治效果，已经成功进入商业化生产10多年，产生 了巨大的经济效益。该菌株于2002年09月30日在中国科学院微生物研究所内的中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 0808。经过前期研究表 明Bs916能分泌产生杆菌霉素 L、泛革素和表面活性素三类脂肽抗生素，是Bs916具有抗真 菌活性的关键因素。本发明通过构建基因突变株和色谱分离技术相结合建立一种从Bs916 中分离纯化泛革素的新方法。
[0008] 本专利提供的生物材料原件所在专利局的申请号为：CN02138379 ;公开（公告） 号-:CN1468524A。


【发明内容】

[0009] 本发明的目的在于：提供枯草芽胞杆菌抗菌脂肽泛革素，以及一种枯草芽胞杆菌 胞外抗菌脂肽泛革素的分离纯化方法。
[0010] 本发明的目的是这样实现的：枯草芽胞杆菌抗菌脂肽泛革素，其特征在于：从枯 草芽胞杆菌Bs916的杆菌霉素 L基因突变株BBLM的胞外产物中分离纯化后获得；通过 电喷雾四级杆飞行时间串联质谱测定包含有分子量为1449. 8、1463. 9、1477. 9、1491. 9和 1505. 9等5个泛革素变异体。
[0011] 一种枯草芽胞杆菌胞外抗菌脂肽的分离纯化方法，其特征在于：
[0012] a、以新霉素抗性基因作为筛选标记基因，杆菌霉素 L合成基因部分核酸序列作为 双交换同源片段，构建整合敲除载体pUC19-ne〇-bac ;将构建的整合敲除载体转化至枯草 芽胞杆菌Bs916,构建杆菌霉素 L基因簇突变株BBLM。突变株BBLM合成杆菌霉素 L的能力 丧失，但保持合成分泌产生泛革素的能力。
[0013] b、将突变株BBLM转接到LB培养液中，在28°C、180r/min条件下振荡培养72h，发 酵液离心除去菌体，用浓盐酸调至PH2. 0沉淀过夜。8 000g离心25min得到沉淀，沉淀采用 甲醇抽提，抽提物经〇. 22 μ mol · Γ1微孔滤膜后，即为粗制备的泛革素样品。
[0014] C、将粗提物采用去离子水稀释为含30%甲醇水溶液，pH值调至7. 0,然后上样于 NH2固相萃取柱，分别用含50%甲醇水溶液，100%甲醇，含0. 5%甲酸甲醇溶液，1%甲酸甲 醇溶液，2%甲酸甲醇溶液梯度洗脱。在紫外光0D 205nm处检测，其中在含1%甲酸甲醇洗 脱溶液中检测到泛革素。
[0015] d、将含1%甲酸甲醇洗脱溶液的pH值调至7.0,氮气吹干浓缩、再用去离子水稀释 为30%甲醇水溶液，然后上样于C18固相萃取柱；采用梯度洗脱30%，50%，70%，90%甲醇 水溶液洗脱。在紫外光〇D 205nm处检测，其中在含90%甲醇水洗脱溶液中检测到泛革素。
[0016] e、将90%甲醇水洗脱溶液氮气吹干后再稀释为40%甲醇水溶液，再上样于C18固 相萃取柱；采用10倍柱体积的70%，75%，80%，85%，90%，95 %甲醇水溶液梯度洗脱，其 中在80^^85%洗脱液得到目标化合物杆菌霉素 L。合并80^^85%洗脱液氮气吹干浓缩后 真空干燥，得到泛革素的纯品。
[0017] f、提取的泛革素采用Tricine-SDS-PAGE检测，已经达到电泳纯，即只有一条带。 提取的杆菌霉素 L高效液相色谱的检测条件为：采用α8(5μπι;250 by 4.6mm;VYDAC 218 丁卩；￥￥0八(：，拖8?61^&，04)柱；流动相为乙腈 ：水：三氟乙酸（50:50:0.5￥〇1八〇1);流速 为lmL · min-1 ;紫外检测波长为205nm ;已经达到色谱纯。
[0018] 本发明的优点在于：本发明建立了一种从生防枯草芽胞杆菌BS916中分离纯化获 得胞外抗菌脂肽泛革素的方法。该方法通过基因敲除和色谱分离建立了高效快速制备高纯 度的泛革素样品的技术体系。泛革素纯品具有抑菌谱广、热稳定性好、对蛋白酶不敏感、对 高压和有机溶剂都具有一定耐受性的特点，对于开发广谱抗真菌药物具有极高的研究和应 用价值。

【专利附图】

【附图说明】
[0019] 图1泛革素化学结构示意图
[0020] 图2杆菌霉素 L操纵子单交换突变示意图
[0021] 图3泛革素的Tricine-SDS-PAGE电泳图
[0022] 图4泛革素的高效液相色谱分析
[0023] 图5电喷雾四级杆飞行时间串联质谱对泛革素同系物的解析图
[0024] 图6泛革素对西瓜枯萎抗菌活性

【具体实施方式】：
[0025] 下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
[0026] 实施例1杆菌霉素 L合成基因突变株的构建
[0027] 采用酶切方法从质粒载体PBEST501切下新霉素抗性基因片段，克隆至pUC19质粒 载体构建重组质粒载体pUC19-neo ;采用多聚酶链式反应（PCR)方法从枯草芽胞杆菌Bs916 基因组DNA中扩增杆菌霉素 L合成基因部分片段IBacD，扩增片段经过酶切和酶连接克隆至 pUC19-neo质粒载体，构建单交换敲除质粒载体pUC19-ne〇-bac ;构建的单交换敲除质粒载 体pSG1164-Fen通过化学转化的方法转化至野生型枯草芽胞杆菌Bs916,筛选正确的转化 子，获得泛革素合成基因的突变株BBLM。
[0028] 实施例2泛革素粗提物的制备
[0029] 将生防枯草芽胞杆菌Bs916的突变株BBLM转接到LB培养液中（所述的LB培养 液，为胰蛋白胨l〇g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L，pH7. 0,在28°C、180r/min条件下振荡培 养72h。发酵液在4°C，5000r/min，离心30min除去菌体，对上清夜用浓盐酸调至pH2. 0沉 淀过夜。8000r/min离心25min得到沉淀，沉淀采用甲醇抽提，抽提物经0. 22 μ mol .L-l微 孔滤膜后，即为粗制备的泛革素样品。
[0030] 实施例3泛革素的纯化
[0031] 将粗提物采用去离子水稀释为含30%甲醇水溶液，pH值调至7. 0,然后上样于NH2 固相萃取柱，分别用含50%甲醇水溶液，100%甲醇，含0. 5%甲酸甲醇溶液，1%甲酸甲醇 溶液，2%甲酸甲醇溶液梯度洗脱，在1%甲酸甲醇洗脱溶液中含有目标化合物。
[0032] 将含1%甲酸甲醇洗脱溶液的pH值调至7. 0,氮气吹干浓缩后用去离子水稀释为 30%甲醇水溶液，然后上样于C18固相萃取柱；采用3倍柱体积的30%，50%，70%，90% 甲醇水溶液梯度洗脱，其中在含90%甲醇水洗脱液中得到泛革素的纯品，纯度为95%，共 50mg〇
[0033] 90%甲醇水洗脱液氮气吹干浓缩后用再稀释为40%甲醇水溶液，重新上样于C18 固相萃取柱；采用10倍柱体积的70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %甲醇水溶液梯度洗脱， 其中在80%洗脱液、85%洗脱液得到目标化合物杆菌霉素 L同系物A、B的纯化物。上述洗 脱液氮气吹干浓缩后真空干燥，分别得到泛革素的纯品30mg，纯度约为98%。
[0034] 实施例4泛革素的Tricine-SDS-PAGE电泳
[0035] Tricine-SDS-PAGE中分离胶浓度为16. 5%，夹层胶浓度为10%，浓缩胶浓度为 4%。将泛革素纯品1. 0 μ g和蛋白质标准品10 μ L上样于凝|父中加样孔，然后在4 C中，110V 电泳4小时；电泳后凝胶采用考马斯亮蓝染色，然后采用乙酸：甲醇：水（1 : 1 : 8)溶液 脱色至呈现出清晰的条带。
[0036] 实施例5泛革素的高效液相色谱分析
[0037] 提取的泛革素高效液相色谱的检测条件为：采用C18 (5 μ m ;250 by 4. 6mm ;VYDAC 218TP ;VYDAC，Hesperia，CA)柱；流动相为乙腈：水：三氟乙酸（50 : 50 : 0· 5vol/vol); 流速为0. 5mL ·π?η-1 ;紫外检测波长为205nm。泛革素5个变异体泛革素 A、泛革素 B、泛革 素 C、泛革素 D、泛革素 E的保留时间分别为22. 6分钟、30. 1分钟、32. 0分钟、43. 6分钟和 46. 1分钟。
[0038] 实施例6泛革素的质谱分析
[0039] 将分离纯化后的泛革素甲醇溶解后，通过电喷雾四极杆飞行时间串联质谱 Q-T0F2,在正离子方式下测定结果显示泛革素包含有5个主要的质荷比峰，分别代表泛革 素5个变异体，分属于两类不同同系物。泛革素 A、泛革素 B和泛革素 C的质子化峰分子量 分别为1449. 8、1463. 9、1477. 9 ;属于相差一个（-CH2)亚甲基的同系物，一级结构为[cycl 0-([cyclo-(Glu-0rn-Tyr-Thr-Glu-Ala-Pr0-Gln-Tyr-β -amino fatty acid)];泛革素 D 和泛革素 E的质子化峰分子量分别为1491. 8和1505. 8,也属于相差一个（-CH2)亚甲基的 同系物，一级结构为[cyclo- ([cyclo- (Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Val-Pro-Gln-Tyr- β -amino fatty acid)]，相对于同系物1其第6位的Ala氨酸残基变为Val氨酸残基。
[0040] 实施例7泛革素的抗菌性能
[0041] 采用平板对峙法和带毒平板法测定泛革素对水稻纹枯病、西瓜枯萎病菌都具有较 强的抑制活性，抑制的IC 5(I分别为1. 5 μ g/ml和3. 2 μ g/ml。
【权利要求】
1. 一株枯草芽胞杆菌胞外脂肽抗生素泛革素，其特征在于：从枯草芽胞杆菌胞外产物 中分离纯化后获得；通过电喷雾四级杆飞行时间串联质谱测定，分子量为1449. 8U463. 9、 1477. 9、1491. 9和1505. 9等相差一个亚甲基（_CH2)的泛革素5个变异体。
2. -种如权利要求1所述的一株枯草芽胞杆菌胞外杆菌霉素 L的分离纯化方法，其特 征在于： a、 从保藏号为CGMCC No. 0808的枯草芽胞杆菌B. subtilis 916中构建脂肽抗生素杆 菌霉素 L合成缺失的突变株BBLM ; b、 从突变株BBLM的发酵液中采用酸沉淀甲醇抽提分离泛革素的粗提物； c、 将粗提物采用去离子水稀释为含30%甲醇水溶液，pH值调至7. 0,然后上样于NH2固 相萃取柱，分别用含50%甲醇水溶液，100%甲醇，含0. 5%甲酸甲醇溶液，1%甲酸甲醇溶 液，2%甲酸甲醇溶液梯度洗脱，在紫外光205nm处检测，其中在含1%甲酸甲醇洗脱溶液中 检测到泛革素； d、 将含1 %甲酸甲醇洗脱溶液的pH值调至7. 0,氮气吹干浓缩、再用去离子水稀释为 30 %甲醇水溶液，然后上样于C18固相萃取柱；采用梯度洗脱30 %，50 %，70 %，90 %甲醇水 溶液洗脱，在紫外波长205nm处检测，其中在含90%甲醇水洗脱溶液中检测到杆菌霉素 L ; e、 将90%甲醇水洗脱溶液氮气吹干后再用去离子水稀释为40%甲醇水溶液，再上样 于C18固相萃取柱；采用10倍柱体积的70%，75%，80%，85%，90%，95%甲醇水溶液梯度 洗脱，其中在80^^85%洗脱液得到目标化合物泛革素，合并80^^85%洗脱液氮气吹干浓 缩后真空干燥，得到泛革素的纯品； f、 提取的泛革素采用Tricine-SDS-PAGE检测，已经达到电泳纯，即只有一条带。提 取的泛革素高效液相色谱的检测条件为：采用α8(5μπι ;250 by4.6mm;VYDAC 218 TP; VYDAC，Hesperia，CA)柱；流动相为乙腈：水：三氟乙酸（50 : 50 : 0. 5vol/vol);流速为 lmL · min-1 ;紫外检测波长为205nm ;已经达到色谱纯。
3. 根据权利要求2所述的一种枯草芽胞杆菌胞外泛革素的分离纯化方法，其特征在 于：从保藏号为CGMCC No. 0808的双突变株BBLM中分离脂肽粗提物是：将突变株BBLM 转接到LB培养液中，在28°C、180r/min条件下振荡培养72h，发酵液离心除去菌体，用 浓盐酸调至pH2. 0沉淀过夜，8000g离心25min得到沉淀，沉淀采用甲醇抽提，抽提物经 0. 22 μ mol · Γ1微孔滤膜后，即为粗制备的泛革素样品。
【文档编号】C12P21/02GK104098660SQ201410322606
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】罗楚平, 陈志谊, 孙熠静, 王晓宇, 张荣胜, 周华飞, 向亚萍 申请人:江苏省农业科学院