专利名称：：利用枯草杆菌发酵生产d-核糖的方法利用枯草杆菌发酵生产D-核糖的方法
技术领域：
：本发明涉及生物技术中利用发酵的方法合成所需要的化合物的
技术领域：
，具体地说，是一种利用枯草杆菌(^3G'W^^Z^j7i's)发酵生产D-核糖的方法。
背景技术：
：D-核糖是一种具有重要生理生化功能的五碳糖，广泛存在于动物、植物和微生物的细胞中，是生物体内遗传物质，如核糖核酸(RNA)、若干辅酶和维生素的组成部分。D-核糖具有巨大的经济价值，被广泛地应用于食品、医疗和制药领域①可用于生产饲料添加剂和食品调味品；②是合成维生素B2的重要原料；③可在临床上用于治疗心肌缺血、糖尿病、肌肉疼痛等病症；④被用于生产抗病毒和抗癌的药物等等。随着行业的发展和应用研究的深入，D-核糖将在食品和医疗行业发挥越来越重要的作用。D-核糖的生产方法主要有三种水解法、化学合成法和微生物发酵法。(1)水解法。它是从酵母细胞中提取核糖核酸(RNA)，然后水解得到D-核糖的一种方法。这种方法的成本高、收率低，不适宜工业化大规模生产。(2)化学合成法。是通过化学转化，将D-阿拉伯糖、D-葡萄糖酸、D-木糖、L-谷氨酸、D-葡萄糖转化成D-核糖的一种方法。采用汞电极电解还原核糖酸-Y-内脂生产D-核糖，可应用于工业化的大规模生产，当原料浓度为180g/L时，D-核糖浓度可达到90120g/L。但是，这种方法由于使用汞电极，容易造成环境的污染，在人类重视保护生存环境、注重社会可持续发展的今天，它已属被淘汰的技术。(3)微生物发酵法。通常是以葡萄糖为碳源，利用转酮醇酶缺陷菌株发酵生产D-核糖的一种方法，它成本低、污染小、适合于工业化大规模生产的要求。目前，对利用微生物发酵生产D-核糖已有诸多报道，研究过的碳源种类包括葡萄糖、果糖、木糖、甘露醇、山梨醇、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘油、乙酸、乙醇、葡萄糖酸等等，研究过的氮源包括酵母膏、蛋白胨、酪蛋白、尿素、氨基酸、玉米桨等；其中，以葡萄糖为碳源，以玉米浆为氮源的培养基应用的最为广泛。例如如Kishimoto等人利用转酮酶缺陷型短小芽孢杆菌(A/"yzw7AATCC21951)，以200g/l葡萄糖、26g/l玉米浆为培养基进行发酵，得到92.0g/1的D-核糖，得率为0.552mol/mo1(见日本专利(JP)4，904，587〕。又如邓崇亮等人选育得到莽草酸和次黄嘌呤双营养缺陷型A^/力^7"No.271，以209g/l初糖为培养基进行发酵，获得96.4g/1的D-核糖，得率达到0.553mol/mol(见微生物学通报24:214-217，1997)。再如DeWulf利用转酮醇酶缺陷的枯草芽孢杆菌ATCC21951，以100g/l葡萄糖和50g/l葡萄糖酸为混合碳源进行发酵，得到45g/l的D-核糖，得率为O.37mol/mol(J.Appl.Microbiol.83:25-30，1997);以100g/l葡萄糖和100g/l木糖为混合碳源进行发酵时，得到60g/lD-核糖(J.Ind.Microbiol.17:104-109，1996)。尽管人们多年来对利用微生物发酵生产D-核糖进行了大量的研究，但是，目前使用的方法依然存在着发酵周期长、得率低的缺点。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌发酵生产D-核糖的方法，使D-核糖的得率有明显的提高。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产D-核糖的方法，其具体的步骤为(1)菌株的选择，选用转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌为菌株；(2)菌种培养，将转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌菌株接入种子培养基活化，得到种子液；(3)配制发酵培养基，以葡萄糖为碳源并添加有机酸；(4)将步骤(2)获得的种子液接入步骤(3)配制的发酵培养基进行发酵。步骤(3)所说的有机酸为短链有机酸。所说的短链有机酸包括柠檬酸、乳酸或其可溶性盐。柠檬酸的添加浓度为0.20.55g/l。乳酸的添加浓度为37g/l。本发明利用枯草杆菌发酵生产D-核糖的方法的积极效果是(1)选用转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌为菌株，在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中添加了有机酸，使D-核糖的产量增加达29.2%，得率增加达34.8%。(2)克服了发酵过程中D-核糖得率低的问题，使D-核糖的得率达到0.67mol/mol，远高于现有技术的水平。(3)发酵液中的副产物减少，有利于D-核糖的分离提取。(4)对发酵代谢过程的控制简单易行，易于产业化。具体实施方式以下通过实施例对本发明利用枯草杆菌发酵生产D-核糖的方法作进一步说明，提供6个实施例，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。实施例l一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产D-核糖的方法，其具体的步骤为(1)选用转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌为菌株；(2)菌种培养，A、将冷冻保存的转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌EC2甘油悬液接于斜面培养基，于恒温培养箱中37。C培养40小时；斜面培养基的组分为山梨醇5g/1、蛋白胨IOg/1、NaCl2g/1、酵母膏2g/1、KH2P04lg/l、K2HP042g/l、琼脂20-22g/1，去离子水配制，pH7.07.2。B、在无菌条件下，将两接种环斜面菌种接入装有已灭菌的20ml种子培养基的250mL摇瓶中，于220rpm的摇床上37。C培养47小时，作为一级种子；种子培养基的组分为一水葡萄糖20g/1、KH2P04lg/l、K2HP043g/l、酵母膏3g/1、蛋白胨10g/1，自来水配制，pH6.87.0。C、按照10%的接种量将7.5mL的一级种子液，接入装有己灭菌的67.5mL种子培养基的500mL摇瓶中，于220rpm的摇床上37。C培养9小时，得到二级种子。(3)配制发酵培养基，其组分为一水合葡萄糖180g/l、玉米浆27g/l、(NH4)2S049g/l、CaC0320g/l、MnS04H200.05g/l、MgS040.05g/l，自来水配制，pH6.0。(4)将2.5ml二级种子液接入装有25ml发酵培养基的250ml摇瓶中，于220rpm的摇床上37。C培养70小时。发酵结束后，发酵液中的菌体干重为4.93g/l，D-核糖浓度为41.1g/l，对葡萄糖得率为0.333mol/mol。实施例2按照实施例1所述的方法进行摇瓶发酵，但在实施例1所述的发酵培养基中分别添加了0.2g/l、0.3g/l、0.55g/l的柠檬酸，构成三组实验组，发酵70小时后，与实施例1的发酵结果进行对比，结果见表l:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实验结果:添加所示量的柠檬酸能提高转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌在发酵过程中D-核糖的产量与得率，其中尤以添加0.3g/l柠檬酸时D-核糖产量增加最多，比对照组产量增加10.7%，得率增加10.8%。实施例3按照实施例1所述的方法进行摇瓶发酵，但在实施例1所述的发酵培养基中分别添加了3g/l、4g/l、6g/l、7g/1的乳酸，构成四组实验组，发酵70小时后，与实施例1的发酵结果进行对比，结果见表2:表2添加乳酸浓度菌体干重耗葡萄糖核糖对葡萄糖得率g/1g/1g/1g/1(mol/mol)04.9314841.10.33335.4014843.20.35045.5114844.70,36265.5614850.30.40875.6314444.60.372实验结果添加所示量的乳酸能提高转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌在发酵过程中D-核糖的产量与得率，其中尤以添加6g/l乳酸时D-核糖产量增加最多，比对照组产量增加22.4%，得率增加22.5%。实施例4按照实施例1所述的方法制得二级种子液150mL。将二级种子液接入装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵，初始通气量1.6vvm，初始搅拌速率为600rpm，控制pH值为6.0，在37。C条件下恒温培养，通过调节通气量和搅拌转速控制溶氧不低于30%，以葡萄糖完全消耗作为发酵的终点。结果，发酵在39.5小时结束，最终获得的菌体干重达到11.3g/l，D-核糖产量为70.9g/l，得率为0.497mol/mol;发酵液中主要的副产物为葡萄糖酸和乙酸，其中，葡萄糖酸浓度为27.5g/1，乙酸浓度为12.3g/l。实施例5按照实施例4所述的方法采用5L发酵罐发酵生产D-核糖，但在发酵培养基中添加0.3g/1柠檬酸，以葡萄糖完全消耗作为发酵的终点。结果，发酵在42.5小时后结束，最终获得的菌体干重为10.6g/l，D-核糖产量为83.4g/l，得率为0.587mol/mo1，发酵液中主要的副产物为葡萄糖酸和乙酸，其中，葡萄糖酸浓度为25.5g/1，乙酸浓度为8.70g/l;与实施例4不添加柠檬酸的发酵培养基生产结果对比D-核糖产量增加了17.6%，得率增加了18.1%，副产物葡萄糖酸和乙酸的浓度分别降低了7.3%和29.3%。实施例6按照实施例4所述的方法采用5L发酵罐发酵生产D-核糖，但在发酵培养基中添加6g/1乳酸，以葡萄糖完全消耗作为发酵的终点。结果，发酵在54.4小时后结束，最终获得的菌体千重为10.4g/l，D-核糖产量为91.5g/l，得率为0.671mol/mo1，发酵液中主要的副产物为葡萄糖酸和乙酸，其中，葡萄糖酸浓度为13.3g/l，乙酸浓度为l.18g/l;与实施例4不添加乳酸的发酵培养基生产结果对比D-核糖产量增加了29.2%，得率增加了34.8%，副产物葡萄糖酸和乙酸的浓度分别降低了51.7%和90.0%。结论(1)选用转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌为菌株来生产D-核糖，在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中添加有机酸，如柠檬酸或乳酸，可明显增加D-核糖的产量，提高D-核糖的得率。(2)柠檬酸的添加量以0.3g/1为最佳。(3)乳酸的添加量以6g/1为最佳。权利要求1、一种利用枯草杆菌发酵生产D-核糖的方法，其具体的步骤为(1)菌株选用转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌；(2)种子培养，将转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌菌株接入种子培养基活化，得到种子液；(3)配制发酵培养基，以葡萄糖为碳源并添加有机酸；(4)将步骤(2)获得的种子液接入步骤(3)配制的发酵培养基进行发酵。2、根据权利要求1所述的利用枯草杆菌发酵生产D-核糖的方法，其特征在于，步骤(3)所说的有机酸为短链有机酸。3、根据权利要求2所述的利用枯草杆菌发酵生产D-核糖的方法，其特征在于，所说的短链有机酸包括柠檬酸、乳酸或其可溶性盐。4、根据权利要求3所述的利用枯草杆菌发酵生产D-核糖的方法，其特征在于，柠檬酸的添加浓度为0.20.55g/l。5、根据权利要求3所述的利用枯草杆菌发酵生产D-核糖的方法，其特征在于，乳酸的添加浓度为37g/1。全文摘要本发明利用枯草杆菌发酵生产D-核糖的方法，其具体步骤包括(1)将转酮醇酶缺陷型枯草芽孢杆菌生产菌株接入种子培养基活化，得到种子液；(2)配制以葡萄糖为碳源的发酵培养基，并添加有机酸，如柠檬酸或乳酸；(3)将种子液接入发酵培养基进行发酵。本发明的积极效果是能明显增加D-核糖的产量，提高得率；发酵液中的副产物减少，有利于D-核糖的分离和提取；对发酵代谢过程的控制简单易行，易产业化。文档编号C12P19/00GK101338331SQ20081004114公开日2009年1月7日申请日期2008年7月29日优先权日2008年7月29日发明者勤叶,琳吴,李志敏申请人:华东理工大学