专利名称：生产弹性酶的枯草杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能够生产治疗动脉硬化、脂肪肝的弹白酶，以替代胰藏分离出的弹性酶的新型枯草杆菌。
背景技术：
弹性酶是保罗和班格首先从胰脏分离纯化出来的，一直作为治疗动脉硬化、脂肪肝等的生化药物，已经被列入药典。由于该种酶原出于动物脏器，原料短缺，多年来世界上开展的是菌源性弹性酶的研究，例如用细菌、霉菌、放射菌分离弹性酶，但是其成本高，产酶率低，资源受限，价格昂贵，一直未能取得工业应用。
本发明的目的在于提供一种生产弹性酶的枯草杆菌，其产量高、适于大规模生产，可以降低成本，满足更多的患者需要。
本发明的目的是这样实现的生产弹性酶的枯草杆菌，所述的菌种为Bacillus Subtilis Hw236-5CGMCC No0652，分子量27800，其菌落为圆形，皱褶、不规则、无光泽、不透明、白色直径2-3mm，在1％葡萄糖营养琼脂试管穿刺表面生长物变厚，菌体宽度0.7-0.8μM，长度2-3μM，其运动性为鞭毛运动，芽孢为0.5×1.5-1.8、对于过氧化酶试验、沙氏葡萄糖液固基生长试验、0.001％溶菌酶生长试验、柠檬酸与盐生长产碱试验，水解酪素试验90％以上的菌株显阳性，卵黄反应试验、55℃0.02％重氮化合物试验以及7％NaCl中生长90％以上菌株呈阴性。
本发明的优点在于1.具有新的性能。本枯草菌株不同于已有的普通枯草菌，它能够产生弹性酶，替代传统的来源于胰脏或者菌源的弹性酶，其成本低，产酶率高，可利用资源丰富，可以大幅度的降低相应的药品价格，适于大规模生产，满足更多的患者需要。
2.原料价低，原材料资源易于得到，生产工艺简单，产量高，因此，价格低。目前世界上菌源类产品尚未能达到工业实施阶段，而利用胰脏生产弹性酶时，1Kg胰脏能够生产4克弹性酶，每克弹性酶的基础成本就是0.75元，是本发明生产的弹性酶价格的2.6倍，而且来源于生物的原料非常缺乏，生产的弹性酶价格偏高。本发明使用枯草菌来生产弹性酶，所生产的药品原料价格低廉，降低了弹性酶的生产成本，可以带动药价下调，适合普通消费者使用，是一种高性能的低价格药品原料，具有显著的技术上的进步。
3.随这老龄化的严重，目前我国每年死于心血管疾病的患者200余万，占死亡总数的40％，而目前生产的弹性酶几乎全部取自胰脏，资源非常有限，特别是由于弹性酶的去除脂肪和溶化血栓的双重功能是目前其他降脂性药物所不能取代的，国内外的药品价格非常高，有限的一点国产药品也都大多出口国外，国内市场供不应求。这里提供的弹性酶的生产菌种成本低，产量大，工艺简单，经济效益会十分可观，可以在低成本的情况下解决这个问题，使我国的普通患者也有可能够用上弹性酶制剂。该发明将有深远的社会意义。
实施例生产弹性酶的枯草杆菌，菌种的名称为Bacillus Subtilis Hw236-5 CGMCCNo0652，其菌落为圆形，皱褶、不规则、无光泽、不透明、白色直径2-3mm，在1％葡萄糖营养琼脂试管穿刺表面生长物变厚，菌体的宽度0.7-0.8μM，长度2-3μM，其运动性为鞭毛运动，芽孢为0.5×1.5-1.8、对于过氧化酶试验90％以上的菌株显阳性、沙氏葡萄糖液固基生长试验90％以上的菌株显阳性、0.001％溶菌酶生长试验90％以上的菌株显阳性、柠檬酸与盐生长产碱试验90％以上的菌株显阳性，水解酪素试验90％以上的菌株显阳性，卵黄反应试验90％以上菌株呈阴性、55℃0.02％重氮化合物试验90％以上菌株呈阴性以及7％NaCl中生长90％以上菌株呈阴性。
根据《伯杰鉴定手册》第九版及《一般细菌常用鉴定方法》的要求与中科院鉴定的的枯草芽苞杆菌为模式株，根据以上性能认定，该菌属于枯草芽孢菌系。
上述的生产弹性酶的枯草杆菌，所述的菌种也可以采用标准的枯草杆菌诱变取得，能够生产弹性蛋白酶。
本产品的培植方法1.所用培养基a.弹性蛋白0.3-0.9，加酵母膏0.1-0.4，葡萄糖0.1-0.5，硫酸镁0.01。磷酸氢二钾和磷酸二氢钾0.15，中性。
b.干酪素2-5，葡萄糖2-5，玉米提取液0.1-0.5，磷酸氢二钾0.1-0.5，硫酸镁0.01，基本为中性。
c.重量基本相等的牛肉膏、蛋白冻、蔗糖，加少许氯化钠，基体为中性。
2.培养方法将稻草数根剪碎，至于三角瓶中，加水没过干草，装量不超过瓶容量的1/2，加石灰少许，塞好棉塞，煮沸5分钟，杀死无芽孢菌，于28-42度培养45小时，液面出现白色菌膜后，取培养液在平面培养基c上涂布、划线，进行菌种分离，将单菌落划线到斜面培养基c上。
3.菌种筛选将菌种稀释涂布到另一培养基b上，形成单菌落后，点种于培养基a，选择水解弹性蛋白所形成的透明圈直径与菌径比较大的菌落划线到另一培养基b上，进行摇瓶发酵，然后采用国家卫生部药品标准测定弹性蛋白酶的活力。
其中进行菌种诱变的方法可以采用硫酸二乙脂诱变法，也可以采用钴60诱变法。
4.实际置备时，从稻草中筛出了17株可以使弹性蛋白溶解的杆菌，经液体培养后复筛出4株产弹性酶比较高的菌株，再次进行诱变，又得到17株，经比较弹性蛋白的溶解透明圈与菌径之比，选取较大的4株进行液体发酵试验，选定具有上述特征的菌株作为产弹性蛋白酶的菌株。重复以上筛选操作3-6次后，得到高产量的弹性酶，在完成上述操作过程中，干酪素和葡萄糖均是生产蛋白酶的比较适合的氮、碳源，其价格性能比比较高。置备过程中，以pH8.5为最佳值，培养温度以28、32、37℃的产酶活力相近，42℃产率较佳，在操作过程中通气量大的产率也相应提高，在发酵20-28小时间产酶率较高，由此得到了稳定的产弹性酶高的菌种和高产量的弹性酶，经测定，蛋白酶活力118.1μ/ml，弹性酶活力达到122μ/ml。
由上可以看出，生产弹性酶的管养要求简单，产酶迅速，经过中试证实可以作为工业菌种应用于弹性酶生产过程。
5.酶的提取方法将发酵液离心弃菌体，浓缩后，将预冷丙酮按适当比例加入离心液体中沉淀出弹性酶，将其真空干燥后得到弹性酶粗粉。
或者将发酵液离心弃菌体，以硫酸铵分级沉淀盐析，离心分离，弃菌体，用0.05mol/L的Tris-CI(pH8.5)缓冲液透析后，再经过DETA-纤维素柱并洗涤，然后用pH8.0的0.1mol/L的Tris-cl洗脱，收集活性部分于透析袋中，以聚乙二醇浓缩后以平衡好的Scphadex G-7.5柱进行凝胶过滤，收集活性峰冷冻后得到弹性酶的精酶粉。
实施例2提供一种实验室实施的过程1.菌种置备，将试管中的菌活化后转接到茄子瓶培养基中，培养基的成份同上，在25-42℃恒温培养18-36小时，取瓶中的菌接入灭菌的三角瓶培养基中，至于旋转摇床上以180r/min培养18-36小时，培养温度25-45℃，按10％接种量将将三角瓶菌种接入已经灭菌的种子罐的培养基中，搅拌通风，在25-45℃下恒温培养18-36小时，制成种子液。
2.发酵液的制备按培养基b的配方作培养基，置备的发酵液在0.1MPa压力下进行灭菌，20-40min冷却到30℃以下，按10％接种量接入种子液。在25-45℃下通风、搅拌发酵培养18-36小时，中止发酵。
3.弹性酶粗粉的提取将已经发酵好的发酵液离心弃菌体，将离心上清液冷却至10℃左右，打入沉淀罐中，加入预冷丙酮，沉淀，离心后脱水处理，真空干燥得到弹性酶粉。
4.弹性酶精粉的提取将已经发酵好的发酵液离心弃菌体，调pH3.0-6.0后打入D-152树脂吸附，2-10小时，洗涤后洗脱，收集峰液，浓缩后加入预冷的丙酮，沉淀，离心到出现沉淀后进行脱水，得到精粉。
5.茄子瓶培养基推荐的其他配方干酪素1-5％，葡萄糖1-6％，玉米浆0.1-0.4％，磷酸氩二钾0.1-0.4％，硫酸镁0.1以下。pH值应当在6.0-9.0。
如果制成斜面，加入1-3％的琼脂即可。
在0.1MPa高压蒸气灭菌20-40分钟后备用。
6.发酵液培养基推荐的其他配方干酪素1-5％，马铃薯淀粉/大麦皮/葡萄糖1-8％，玉米浆0.1-0.4％，磷酸氢而钾0.1-0.4％，硫酸镁0.1以下。其pH应当在6.0-9.0。应当在D.1MPa高压蒸气下灭菌20-40分钟，冷却后备用。
权利要求
1.一种生产弹性酶的枯草杆菌，其特征是所述的菌种为BacillusSubtilis Hw236-5 CGMCC No0652，分子量27800，其菌落为圆形，皱褶、不规则、无光泽、不透明、白色直径2-3mm，在1％葡萄糖管养琼脂试管穿刺表面生长物变厚，菌体宽度0.7-0.8μM，长度2-3μM，其运动性为便毛运动，芽孢为0.5×1.5-1.8、对于过氧化酶试验、沙氏葡萄糖液固基生长试验、0.001％溶菌酶生长试验、柠檬酸与盐生长产碱试验，水解酪素试验90％以上的菌株显阳性，卵黄反应试验、56℃0.02％重氮化合物试验以及7％NaCl中生长90％以上菌株呈阴性。
2.根据权利要求1所述的生产弹性酶的枯草杆菌，其特征是所述的菌种采用标准的枯草杆菌经3-6次诱变取得，置备过程中，以pH8.5为最佳值，培养温度以28、32、37℃的产酶活力相近，42℃产率较佳，在操作过程中通气量大的产率也相应提高，在发酵20-28小时间产酶率较高，能够生产弹性蛋白酶。
全文摘要
生产弹性酶的枯草杆菌,是一种能够生产治疗动脉硬化、脂肪肝的弹白酶,以替代胰藏分离出的弹性酶的新型枯草杆菌。现有的菌源弹性酶成本高,产酶率低。本发明的菌种其菌落为圆形,皱褶、不规则、无光泽、不透明、白色直径2－3mm,在1%葡萄糖营养琼脂试管穿刺表面生长物变厚,菌体宽度0.7－0.8μM,长度2－3μM,其运动性为便毛运动,芽孢为0.5×1.5－1.8、对于过氧化酶、沙氏葡萄糖液固基生长、0.001%溶菌酶生长、柠檬酸与盐生长产碱,水解酪素时90%以上的菌株均显阳性,在卵黄反应、55℃0.02%重氮化合物以及7%NaCl中生长90%以上菌株呈阴性。
文档编号C12N9/66GK1369551SQ0113881
公开日2002年9月18日 申请日期2001年12月9日 优先权日2001年12月9日
发明者刘宇峰, 奚新伟, 王金英 申请人:黑龙江省科学院应用微生物研究所