5千亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法

专利名称：5千亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法
技术领域：
本发明涉及5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数含量生物检测技 术领域，更具体涉及一种5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法。
背景技术：
20世纪50年代以来，抗生素作为疾病治疗剂和动物生长促进剂对畜禽、水 产养殖业发展发挥了重大作用。然而，由于抗生素负面效果越来越严重，世界卫 生组织己禁止在饲料中使用任何抗菌药物，饲料和养殖业以添加抗生素预防和促 进动物生长的饲养方式已经受到了很大冲击，抗生素替代品的开发和推广使用成 为世界性的重要课题，其中的益生菌受到广泛关注。
益生菌又称微生态制剂，是指有益微生物经过特殊驯化和加工制成的活菌制 剂，益生菌可以改善动物肠道中微生物的菌群平衡，防治某些细菌性疾病的发生， 能提高动物的饲料利用率、提高机体免疫力，促进生长和改善生产性能，得到安 全无药物残留的产品。现已开发成商品制剂的益生菌有芽胞杆菌类、酵母、乳 酸菌、双歧杆菌、链球菌、曲霉等，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillus简称Bs) 是最重要的品种。
与食用益生菌一样，饲用益生菌制造业十分年轻。为规范益生菌产业健康有 序发展，美国FDA正式规定42种微生物可用作益生菌，其中属于芽胞杆菌的有 枯草芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌、迟缓芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和短小芽胞杆菌， 枯草芽胞杆菌名列首位。中国农业部公布用于词料的微生物添加剂的有12种 干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌、屎链球菌、乳酸片球菌、枯草芽胞杆菌、 纳豆芽胞杆菌、嗜酸乳杆菌、乳链球菌、啤酒酵母、产配假丝酵母、沼泽红假单 胞菌等，枯草芽胞杆菌也榜上有名。
据全球产业分析公司(GIA)发表的《益生菌全球战略经营报告》，预计 到2010年，全球益生菌市场的销售规模(包括医用、食品和饲用)将达到200亿美元。另一市场调研机构BCC公司发布的市场研究报告《益生菌市场原料、 补充剂及食品》显示2007年，全球益生菌原料、补充剂及食品的市场规模达
到149亿美元，到2013年将达到196亿美元，年均复合增长率(CAGR)为4.3%,
两份权威调研报告的结论颇为相近。
我国至今没有饲用益生菌销售的官方统计数字，但"山寨版"Bs产品充斥 市场，产品纯度低，价格混乱的现象比比皆是，尽管如此，Bs制剂带来的效果， 如提高机体免疫力，提高词料利用率、加快动物生长速率等经济效果还是得到广 大用户的认同。
国际市场需要包括Bs的益生菌高端产品，国内随着需求量的增加需要安全、 规范的益生菌中低端产品。在这种背景下，科诺公司进入益生菌制造行业。为了 提高竞争力，我们利用响应面方法对枯草芽胞杆菌发酵培养基进行筛选，得到一 个发酵水平最佳的配方，再进行发酵过程控制的研究，发酵水平大幅度提高。发 酵液水平达到200亿cfu/g，原药水平达到5,000亿cfu/g以上，远高于国内通常 采用的固体发酵方式生产的枯草杆菌制剂(有效活菌数一般在150亿cfu/g左右) 和部分厂家采用液体发酵生产的制剂(芽胞数一般为1000-2000亿cfu/g)。
根据联合国粮农组织(FAO)的规定，益生菌剂应用应该是含有足够数量的 活微生物制剂，并能有利于宿主的健康。高含量枯草芽孢杆菌制剂功能性、安全 性及其注明产品质量的检测尤为重要，而衡量产品的质量标准主要是含有活菌数 量及微生物的种类是否与商标一致。益生菌剂含有足够数量的活菌数，是衡量其 质量的一个重要指标。大量研究证明，含有的活菌数越多，对机体的益生作用越 显著。常规生物检测法取一定量的菌剂与无菌水混合，进行系列稀释，然后涂 布或倾注平板，通过培养，统计平板上的单菌落数，计算菌剂中的活菌数量。对 于高含量枯草芽胞杆菌原药芽胞高度粘结与集聚，分散难的问题，常规的生物检 测方法的检测结果误差大，重复性低。
活菌计数技术作为常规的微生物学技术，是衡量细胞生物量和产率的重要手 段，广泛用于微生物发酵行业。然而，对于高含量枯草芽胞杆菌原药(5,000亿 cfu/g)，由于芽胞的高度粘结与集聚，不易分散，且不同芽胞的热稳定性和生物 活性也不相同，造成芽胞检测的困难，因此，如何准确、快速地检测高含量枯草 芽胞芽胞成为本项目质量控制的关键。

发明内容
本发明的目的是在于提供了一种5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽 胞数的检测方法，该方法操作简便，灵敏度高、适合大量样品的检测，是测定样 品含有的活菌数和菌株鉴定的经典方法。 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施-
本发明涉及活芽胞检测技术作为常规的微生物学技术，是衡量细胞生物量和 产率的重要手段。针对高含量枯草芽胞杆菌原粉制剂(5,000亿cfu/g)不易检测 的难点，如枯草芽胞杆菌原粉制剂中芽胞的高度粘结与集聚，不易分散，不同的 稀释程序、不同的涂布方式和次数，对检测准确性和稳定的影响很大。建立良好 的高含量枯草芽胞杆菌原粉芽胞数的检测技术，可以准确的检测出产品中活芽胞 的数量。利用这一技术，在一般实验室及相对简单的实验设备都能进行检测。
检测操作流程称取适量0.99g—1.01g (准确至0.0002g) 5,000亿活芽胞/ 克枯草芽胞杆菌原粉样品与混有10% (体积比)吐温-80溶液的生理盐水混匀， (吐温-80作为表面活性剂，能有效的分散聚集的芽胞)，放磁力搅拌器(CJJ-4上 海君竺仪器制造有限公司)上混合，28-32min后放入超声波水浴器(KQ-600B昆 山市超声仪器有限公司)超声波处理13-17min，再用匀质器(Bagmixer 400W/P/VW)处理8-12min，(超声波与匀质器处理，能有效分散粉剂中粘结集 聚的芽胞)进行稀释，稀释至10—s水浴28-32min (68-72°C)，然后再稀释至IO力 取O.lmL涂布。5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌制剂样品培养涂布完成后的平 板放入37。C恒温培养箱(WMK-02湖北黄石市医疗器械厂)中16-20hr。计数 5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品培养16-20hr后，统计平板上的单菌落 数，计算菌剂中的活菌数量，得到了 5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品的 准确的芽胞数。
一种5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，其步骤是 1、试剂及培养基的配制
(1) 10% (体积比)吐温-80溶液准确移取10mL吐温-80于100mL容量瓶 中，用蒸熘水定容至100mL，配制成10% (体积比)吐温-80溶液，121'C灭菌 30min备用。
(2) 生理盐水8.5gNaCl用蒸馏水定容至1000mL，分装400mL每瓶，121°C灭菌30min备用。
(3) 配制营养琼脂培养基胰蛋白胨5g 、酵母浸粉2.5g 、氯化钠5g 、 葡萄糖lg 、琼脂15g 、蒸馏水1000mL 、 pH 6.8-7.2 、121'C灭菌30min;
(4) 营养琼脂培养基灭菌后降温48-52'C时，倒平板，待平板培养基凝固后， 用灭菌好的牛皮纸包好，底朝上斜放在37'C恒温培养箱中培养18-22hr,以保证 平板干燥、无污染。
2、 5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品的预处理
(1) 按照1% (体积比)的比例在无菌生理盐水中加入灭好菌的10% (体积比) 吐温-80溶液，混合均匀，待用；
(2) 称取0.99g—1.01g (准确至0.0002g)的试样于中性瓶中。猛烈摇动，使 之混合均匀。
(3) 把中性瓶放在磁力搅拌器平台上，混合28-32min;在13-17min时剧烈摇 动lmin,再次将磁力搅拌混合13-17min。
(4) 将已混合好的试样放入超声波水浴器中(超声波水浴器水平面必须等同于 试样液面，试样瓶应放在超声波振源处)，共超声13-17min (7min时停止，猛烈 摇动试样瓶lmin，然后再超声8min)。
(5) 在超声波处理之后，再次用匀质器(速度6 9次挤压/秒)处理8-12min。
3、 5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品的稀释
(1) 向7支无菌试管分别加入4.5mL生理盐水和10% (体积比)吐温-80溶液 混合的稀释液，试管上标记样品号和稀释倍数的字样。操作在超净工作台中进行。
(2) 吸取0.5mL已处理好的试样溶液到第一支1支试管中，再从第1支试管 吸取0.5mL试样溶液于第2支试管，依次进行到第6支试管，稀释浓度至10—8
(每次加液后，需混合均匀，再进行下一次操作)。
(3) 将5，000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品至10-H式管放入68-72'C水浴 锅中水浴28-32min取出后立即冷却至25-30°C。然后准确吸取0.5mL该试管试 样溶液于第7支试管，稀释浓度至10'9，混匀，备用。
4、 5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品涂布及培养
将稀释至10—9试样各准确吸取O.lmL到5个营养琼脂平板中，各平板均标 上样品号、日期、稀释度。使用l支涂棒，将已放在平板中的试样涂布到全部被
7培养基吸收，涂布3个平板后用涂棒在空白的营养琼脂平板上来回涂布20次； 换1支涂棒将其余两个平板中的试样涂布到全部被培养基吸收，再用涂棒在空白
的营养琼脂平板上来回涂布20次。涂布完成后，将其放在37T:恒温培养箱中 16hr-20hr。
5、计数5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品培养16-20hr后，统计平板 上的单菌落数，计算原粉中的活芽胞数含量。 本发明与现有技术相比具有以下优点和效果
(1) 处理方法能有效分散粉剂中粘结集聚的芽胞、杀灭热稳定性和生物活性不 稳定的无效芽胞，准确的检测出产品中有效活芽胞的数量；
(2) 重复性好；
(3) 检测过程不需要特殊昂贵的仪器；
(4) 成本低；
(5) 可以同时检测8-10个样品；
(6) 操作简单便于推广。
具体实施例方式
一种5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，包括下列步骤
1、 试剂、培养基的配制及平板培养基的制备
(1) 10% (体积比)吐温-80溶液准确移取10mL吐温-80于lOOmL容量瓶 中，用蒸馏水定容至100mL，配制成10%吐温-80溶液，12rC灭菌30min备用。
(2) 生理盐水8.5gNaCl用蒸馏水定容至1000mL，分装400mL每瓶，121°C 灭菌30min备用。
(3) 配制营养琼脂培养基胰蛋白胨5g 、酵母浸粉2.5g 、氯化钠5g 、 葡萄糖lg 、琼脂15g 、 蒸馏水1000mL、 pH 6.8-7.2 、 12rC灭菌30min;
(4) 营养琼脂培养基灭菌后降温48-52'C时，倒平板，待平板培养基凝固后， 用灭菌好的牛皮纸包好，底朝上斜放在37'C恒温培养箱中培养18-22hr,以保证 平板干燥、无污染。
2、 5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品的预处理
(1)按照1% (体积比)的比例在无菌生理盐水中加入灭好菌的10% (体积比) 吐温-80溶液，混合均匀，待用；
8(2) 称取0.99g—1.01g (准确至(X0002g)的试样于中性瓶中。猛烈摇动，使 之混合均匀。
(3) 把中性瓶放在磁力搅拌器平台上，混合28-32min;在13-17min时剧烈摇 动lmin，再次将磁力搅拌混合13-17min。
(4) 将己混合好的试样放入超声波水浴器中(超声波水浴器水平面必须等同于 试样液面，试样瓶应放在超声波振源处)，共超声13-17min (7min时停止，猛烈 摇动试样瓶lmin，然后再超声8min)。
(5) 在超声波处理之后，再次用匀质器(速度6 9次挤压/秒)处理8-12min。
3、 5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品的稀释
(1) 向7支无菌试管分别加入4.5mL生理盐水和10% (体积比)吐温-80溶液 混合的稀释液，试管上标记样品号和稀释倍数的字样。操作在超净工作台中进行。
(2) 吸取0.5mL已处理好的试样溶液到第1支试管中，再从第1支试管吸取 0.5mL试样溶液于第2支试管，依次进行到第6支试管，稀释浓度至l(T8 (每次 加液后，需混合均匀，再进行下一次操作)。
(3) 将5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品至1(rS试管放入68-72'C水浴 锅中水浴28-32min取出后立即冷却至25-30°C。然后准确吸取0.5mL该试管试 样溶液于第7支试管，稀释浓度至10—9，混匀，备用。
4、 5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品涂布及培养
将稀释至10—9试样各准确吸取O.lmL到5个营养琼脂平板中，各平板均标 上样品号、日期、稀释度。使用l支涂棒，将已放在平板中的试样涂布到全部被 培养基吸收，涂布3个平板后用涂棒在空白的营养琼脂平板上来回涂布20次； 换1支涂棒将其余两个平板中的试样涂布到全部被培养基吸收，再用涂棒在空白 的营养琼脂平板上来回涂布20次。涂布完成后，将其放在37'C恒温培养箱中 16hr-20hr。
5、 计数
a) 培养16hr-20hr后，统计平板上的单菌落数，计算试样中的活芽胞数。
b) 小于30个或大于300个菌落的平板不计数。
c) 计算
试样中枯草芽孢杆菌的芽孢数N (单位为cfu/g)，按式(1)计算 N=c/m*1010.........式中
C---几个有效平板的平均菌落数，单位为个; M---试样的称样量，单位为克(g); 1CT…试样稀释倍数。 两次平行测定相对偏差不大于12%。
权利要求
1、一种5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法，包括下列步骤A、试剂、培养基的配制及平板培养基的制备(1)10％吐温-80溶液移取10mL吐温-80于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，配制成10％吐温-80溶液，121℃灭菌30min备用；(2)生理盐水8.5gNaCl用蒸馏水定容至1000mL，分装400mL每瓶，121℃灭菌30min备用；(3)配制营养琼脂培养基胰蛋白胨5g、酵母浸粉2.5g、氯化钠5g、葡萄糖1g、琼脂15g、蒸馏水1000mL、pH 6.8-7.2、121℃灭菌30min；(4)营养琼脂培养基灭菌后降温48-52℃时，倒平板，待平板培养基凝固后，用灭菌好的牛皮纸包好，底朝上斜放在37℃恒温培养箱中培养18-22hr；B、5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品的预处理(1)按照1％的比例在无菌生理盐水中加入灭好菌的10％吐温-80溶液，混合均匀，待用；(2)称取0.99g-1.01g的试样于中性瓶中，摇动，混合均匀；(3)把中性瓶放在磁力搅拌器平台上，混合28-32min；在13-17min时摇动1min，再次将磁力搅拌混合13-17min；(4)将已混合好的试样放入超声波水浴器中，共超声13-17min；(5)在超声波处理之后，再次用匀质器速度6～9次挤压，处理8-12min；C、5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品的稀释(1)向无菌试管分别加入4.5mL生理盐水和10％吐温-80溶液混合的稀释液，试管上标记样品号和稀释倍数的字样，操作在超净工作台中进行；(2)吸取0.5mL已处理好的试样溶液到第1支试管中，再从第1支试管吸取0.5mL试样溶液于第2支试管，依次进行到第6支试管，稀释浓度至10-8；(3)将稀释至10-8试样放入68-72℃水浴锅中水浴28-32min取出后冷却，然后吸取0.5mL该试管试样溶液于第7支试管，稀释浓度至10-9，混匀，备用；D、5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉样品涂布及培养将稀释至10-9试样各吸取0.1mL到5个营养琼脂平板中，各平板均标上样品号、日期、稀释度，使用1支涂棒，将已放在平板中的试样涂布到全部被培养基吸收，涂布3个平板后用涂棒在空白的营养琼脂平板上来回涂布20次；换1支涂棒将两个平板中的试样涂布到全部被培养基吸收，再用涂棒在空白的营养琼脂平板上来回涂布20次，涂布完成后，将其放在37℃恒温培养箱中16hr-20hr；E、计数培养16hr-20hr后，统计平板上的单菌落数，计算试样中的活菌数量。
全文摘要
本发明公开了一种5,000亿活芽胞/克枯草芽胞杆菌原粉活芽胞数的检测方法。其步骤是A.试剂、培养基的配制及平板培养基的制备；B.样品的预处理C.样品的稀释D.试样涂布及培养将稀释至10^-9试样各吸取0.1mL到5个营养琼脂平板中，各平板均标上样品号、日期、稀释度，使用1支涂棒，将已放在平板中的试样涂布到全部被培养基吸收，涂布3个平板后用涂棒在空白的营养琼脂平板上来回涂布20次；换1支涂棒将其余两个平板中的试样涂布到全部被培养基吸收，再用涂棒在空白的营养琼脂平板上来回涂布20次，涂布完成后，将其放在37℃恒温培养箱中16hr-20hr；E.计数。该方法操作简便，灵敏度高、适合大量样品的检测，计平板上的单菌落数，计算试样中枯草芽胞杆菌的芽胞数。
文档编号C12Q1/06GK101586144SQ20091006296
公开日2009年11月25日 申请日期2009年7月3日 优先权日2009年7月3日
发明者娜 余, 刘华梅, 刘荷梅, 青 李, 杨克华, 王巧梅, 程治国, 缪华军, 翔 谢, 陈又香, 陈振民, 黄志远 申请人:武汉科诺生物科技股份有限公司