枯草杆菌酶变体的制作方法

专利名称：枯草杆菌酶变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及对存在于卵中的物质如IV-0类胰蛋白酶抑制剂的抑制作用具有降低的被抑制趋势的新枯草杆菌酶(subtilase)变体。具体地说，本发明涉及这样的新枯草杆菌酶变体，该变体在位置42-43、51-55、155-160、187-189、217-218或218-219之间(按照枯草杆菌蛋白酶BPN’(BASBPN)编号，见下文)包含至少一个额外的氨基酸残基。这些枯草杆菌酶变体是有用的，当用于诸如清洁或洗涤剂组合物，如洗衣组合物和洗盘组合物，包括自动洗盘组合物中时，对卵污渍表现出优良的或改进的洗涤性能。本发明还涉及编码该变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞，以及生产和使用本发明的变体的方法。而且，本发明涉及包含本发明变体的清洁和洗涤剂组合物。
背景技术：
在洗涤剂工业，酶已在洗涤制剂中使用了30年以上。用于这些制剂的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶和其它酶或它们的混合物。商业上最为重要的酶是蛋白酶。
数量不断增长的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程化变体，如DURAZYM(Novozymes A/S)、RELASE(NovozymesA/S)、MAXAPEM(Gist-Brocades N.V.)、PURAFECT(GenencorInternational，Inc.)。
而且，本领域描述了许多蛋白酶变体。WO 99/27082中给出了现有技术中蛋白酶变体的完整列表。
虽然已描述了大量有用的蛋白酶和蛋白酶变体，但是对于许多工业应用而言，仍需要新的改进的蛋白酶或蛋白酶变体。
具体而言，由于卵清中存在的物质抑制许多种丝氨酸蛋白酶，因而已提出从如衣物或硬表面上除去卵污渍的问题。此类物质的实例包括IV-0类胰蛋白酶抑制剂(卵抑制蛋白)和III-0类胰蛋白酶抑制剂(卵类粘蛋白)。
因此，本发明的一个目的在于提供改进的枯草杆菌酶，它不被或仅有限地被此类物质抑制。本发明的又一目的是提供适于从如衣物和/或硬表面除去卵污渍的改进枯草杆菌酶。
发明概述因此，在第一方面，本发明涉及选自以下的枯草杆菌酶变体在位置42和43之间(BASBPN编号)包含至少一个额外氨基酸残基的插入的枯草杆菌酶变体；在位置51和56之间(BASBPN编号)包含至少一个额外氨基酸残基的插入的枯草杆菌酶变体；在位置155和161之间(BASBPN编号)包含至少一个额外氨基酸残基的插入的枯草杆菌酶变体；在位置187和190之间(BASBPN编号)包含至少一个额外氨基酸残基的插入的枯草杆菌酶变体；在位置216和217之间(BASBPN编号)包含至少一个额外氨基酸残基的插入的枯草杆菌酶变体；在位置217和218之间(BASBPN编号)包含至少一个额外氨基酸残基的插入的枯草杆菌酶变体；在位置218和219之间(BASBPN编号)包含至少一个额外氨基酸残基的插入的枯草杆菌酶变体。
在第二方面，本发明涉及这样的分离核酸序列，其包含编码本发明的枯草杆菌酶变体的核酸序列。
在第三方面，本发明涉及这样的核酸构建体，其包含可操作地连接至一个或多个调控序列的本发明的核酸序列，其中所述调控序列可指导枯草杆菌酶在合适宿主中表达。
在第四方面，本发明涉及包含本发明的核酸构建体、启动子以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。
在第五方面，本发明涉及包含本发明核酸构建体的重组宿主细胞。
在第六方面，本发明涉及用于产生本发明枯草杆菌酶变体的方法，所述方法包括(a)在有助于产生枯草杆菌酶的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和(b)回收枯草杆菌酶变体。
在第七方面，本发明涉及用于产生本发明枯草杆菌酶的方法，所述方法包括(a)培养来自芽胞杆菌属，优选地培养来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)种的菌株如克劳氏芽孢杆菌DSM 13585，以产生含有枯草杆菌酶变体的上清；和(b)回收枯草杆菌酶变体。
在第八方面，本发明涉及包含本发明的枯草杆菌酶变体的清洁或洗涤剂组合物，优选地为洗衣或洗盘组合物。
本发明进一步的方面涉及本发明的枯草杆菌酶在清洁或洗涤剂组合物中的用途；本发明的枯草杆菌酶或组合物用于除去卵污渍的用途；一种用于清洁或洗涤的方法，包括从硬表面或衣物上除去卵污渍的方法，所述方法包括使硬表面或衣物与本发明的组合物接触。
在第七方面，本发明涉及用于从硬表面或衣物上除去卵污渍的方法，所述方法包括使含有卵污渍的硬表面或含有卵污渍的衣物与含有本发明枯草杆菌酶变体的清洁或洗涤剂组合物接触，优选地与洗衣或洗盘组合物接触。
关于序列对比和编号参见

图1，该图显示在枯草杆菌蛋白酶BPN′(a)(BASBPN)(SEQ ID NO7)和枯草杆菌蛋白酶309(b)(BLSAVI)(SEQ IDNO8)之间的序列对比。
在本专利申请中这些序列对比(alignment)用作对残基进行编号的参照。
定义在更详细地讨论本发明之前，首先定义以下的术语和约定。
氨基酸和核酸命名法在整个说明书、图和权利要求书中使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，大部分为单字母代码形式，但也有三字母代码形式。同样，在整个说明书、图和权利要求书中使用核酸的公认IUPAC命名法。
变体名称的命名法和约定在描述本发明产生的或考虑的多种枯草杆菌酶变体时，采用以下的命名法和约定以易于参照首先通过将分离的酶或亲本酶与枯草杆菌蛋白酶BPN′(BASBPN)对比来定义参考框。
可以由GCG程序包9.1版的GAP程序获得序列对比，用于对变体进行编号，其间使用了以下参数间隔(gap)创建罚分＝8，间隔扩展罚分＝8，且所有的其它参数保持为它们的默认值。
另一种方法是使用枯草杆菌酶之间的已知公认对比，如在WO91/00345中所示的序列对比。在大部分情况下，差异并不重要。
由此，可以相对BASBPN定义缺失和插入的数目。在图1中，枯草杆菌蛋白酶309与BASBPN相比，在位置36、58、158、162、163和164位有6处缺失。这些缺失在图1中由星号(*)表示。
一般采用以下的三个元素来表示对亲本酶所进行的多种修饰原始氨基酸位置替换的氨基酸因此，符号G195E意指195位的甘氨酸被谷氨酸替换。
在原始氨基酸残基可以是任意氨基酸残基的情况下，有时可以用简略表达方式仅表示位置和替换的氨基酸位置替换的氨基酸这种符号尤其与同源枯草杆菌酶中的修饰相关(见下文)。
类似地，当替换氨基酸残基的种类不重要时
原始氨基酸位置当原始氨基酸和替换氨基酸均可以包含任意氨基酸时，则只指出位置，如170。
当原始氨基酸和/或替换的氨基酸可以包含一种以上但不是所有的氨基酸时，所选择的氨基酸表示在括号内原始氨基酸位置{替换的氨基酸1，...，替换的氨基酸n}对于具体的变体，使用具体的三个或一个字母代码，包括代码Xaa和X用来表示任何氨基酸残基。
替换用谷氨酸替换195位的甘氨酸表示为Gly195Glu或G195E或者用任意氨基酸残基替换195位的甘氨酸表示为Gly195Xaa或G195X或Glv195或G195因此用丝氨酸替换170位的任意氨基酸残基将表示为Xaa170Ser或X170S或170Ser或170S这种符号尤其与同源枯草杆菌酶的修饰相关(见下文)。因此170Ser意在包括例如，BASBPN中的Lys170Ser修饰和BLSAVI中的Arg170Ser修饰(参见图1)。
对于其中的原始氨基酸和/或替换的氨基酸可以包含一种以上但不是所有的氨基酸的修饰而言，由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸替换170位的精氨酸表示为Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}或R170{G，A，S，T}以表示变体R170G、R170A、R170S和R170T。
缺失195位甘氨酸的缺失表示为Gly195*或G195*相应地，一个以上氨基酸残基的缺失，如195和196位甘氨酸和亮氨酸的缺失表示为Gly195*+Leu196*或G195*+L196*插入额外的氨基酸残基的插入，如在G195后插入赖氨酸表示为Gly195GlyLys或G195GK；或者，当插入一个以上的氨基酸残基，如在G195后插入Lys和Ala时，这种插入表示为Gly195GlyLysAla或G195GKA在这些情况下，通过将小写字母加到插入氨基酸残基之前的氨基酸残基位置号中来对插入氨基酸残基进行编号。在以上的实例中，序列194-196因此为194 195 196BLSAVIA-G-L194 195 195a 195b 196变体 A-G-K-A-L(SEQ ID NO1)当插入与所存在的氨基酸残基相同的氨基酸残基时，显然在命名法中出现了简并性。例如，如果在以上的实施例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，则将它表示为G195GG。对从194 195 196BLSAVIA-G-L194 195 195a 196至变体A-G-G-L(SEQ ID NO2)194 194a 195 196的事实上同样的变化还可以表示为A194AG。
这些例子对本领域技术人员来说是显而易见的，因此表示法G195GG和用于此类插入的相应表示法意在包含这些等价的简并表示法。
填补间隔当与用于编号的枯草杆菌蛋白酶BPN′序列进行参照比较，在酶中存在缺失时，则对于在36位插入天冬氨酸而言，此位置处的插入表示为*36Asp或*36D多重修饰用加号分隔含多重修饰的变体，如Arg170Tyr+Gly195Glu或R170Y+G195E代表在170和195位分别用酪氨酸和谷氨酸替换精氨酸和甘氨酸的修饰。
因此，Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}表示以下变体Tyr167Gly+Arg170Gly， Tyr167Gly+Arg170Ala，Tyr167Gly+Arg170Ser， Tyr167G1y+Arg170Thr，Tyr167Ala+Arg170Gly， Tyr167Ala+Arg170Ala，Tyr167Ala+Arg170Ser， Tyr167Ala+Arg170Thr，Tyr167Ser+Arg170Gly， Tyr167Ser+Arg170Ala，Tyr167Ser+Arg170Ser， Tyr167Ser+Arg170Thr，Tyr167Thr+Arg170Gly， Tyr167Thr+Arg170Ala，Tyr167Thr+Arg170Ser， 和Tyr167Thr+Arg170Thr.
这种命名法与针对替换、代替、插入或缺失具有特定共同性质的氨基酸残基，如带正电荷(K、R、H)、带负电荷(D、E)的残基的修饰，或诸如意味着可以用一种小氨基酸替换另一种小氨基酸的Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}的保守氨基酸修饰特别相关。进一步的详细描述参见“发明详述”部分。
蛋白酶断裂蛋白质底物中的酰胺键的酶归类为蛋白酶，或(可互换地)肽酶(见Walsh，1979，酶反应机理(Enzymatic Reaction Mechanisms).W.H.Freeman and Company，San Francisco，第3章)。
氨基酸位置/残基的编号如果没有另外指出，本文所用的氨基酸编号对应于枯草杆菌酶BPN′(BASBPN)序列的氨基酸编号。对BPN′序列的详细描述，参见图1或Siezen等人，蛋白质工程(Protein Engng.)4(1991)719-737。
丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶是一种催化肽键水解的酶，其中在活性位点存在必需的丝氨酸残基(White，Handler和Smith，1973“生物化学原理(Principles of Biochemistry)，”第五版，McGraw-Hill Book公司，纽约，第271-272页)。
细菌丝氨酸蛋白酶的分子量在20,000-45,000道尔顿的范围内。它们被二异丙基氟代磷酸抑制。它们水解简单末端脂类，且其活性与真核生物糜蛋白酶(也是一种丝氨酸蛋白酶)相似。一个更为狭义的术语，碱性蛋白酶(包括一个亚组)反映某些丝氨酸蛋白酶的高pH最适值，为pH9.0-11.0(综述参见Priest(1977)细菌学评论(BacteriologicalRev.)41711-753)。
枯草杆菌酶Siezen等人提出丝氨酸蛋白酶的一个亚组，其暂称为枯草杆菌酶(subtilase)，见蛋白质工程，4(1991)719-737和Siezen等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523。它们是通过对170多个先前称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列进行同源性分析而定义的。枯草杆菌蛋白酶以前通常被定义为由革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而现在根据Siezen等人则为枯草杆菌酶的一个亚组。已鉴定了大量的枯草杆菌酶，并已测定了一些枯草杆菌酶的氨基酸序列。对此类枯草杆菌酶及其氨基酸序列的更详细描述参见Siezen等人(1997)。
枯草杆菌酶的一个亚组，I-S1或″真″枯草杆菌蛋白酶，包含“经典的”枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶168(BSS168)、枯草杆菌蛋白酶BPN′(BASBPN)、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(BLSCAR)(ALCALASE，Novozymes A/S)和枯草杆菌蛋白酶DY(BSSDY)。令人感兴趣的其它I-S1亚组枯草杆菌酶为与BSS168密切相关的枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶Amylosacchariticus(BSSAS)、枯草杆菌蛋白酶J(BSAPRJ)、枯草杆菌蛋白酶NAT(BSAPRN)和肠膜肽酶(mesentericopeptidase)(BMSAMP)；与BLSCAR密切相关的枯草杆菌蛋白酶，如角蛋白酶(BLKERA)、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg 11594(BLSCA1)、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg 15413(BLSCA2)、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg 14353(BLSCA3)；以及枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶C(BSSPRC)和丝氨酸蛋白酶D(BSSPRD)，或者它们的功能变体，其中所述功能变体保留了亚组I-S1的特征。
Siezen等人(见上文)识别了枯草杆菌酶的另一亚组，I-S2或强碱性枯草杆菌蛋白酶。亚组I-S2蛋白酶被描述为强碱性枯草杆菌蛋白酶并包括枯草杆菌蛋白酶PB92(BAALKP)(MAXACAL，Gist-BrocadesNV)、枯草杆菌蛋白酶309(BLSAVI，BLS309)(SAVINASE，Novozymes A/S)、枯草杆菌蛋白酶147(BLS147)(ESPERASE，Novozymes A/S)和碱性弹性蛋白酶YaB(BSEYAB)。令人感兴趣的其它I-S2亚组枯草杆菌酶为枯草杆菌蛋白酶ALPI(BSAPRQ)、与BLS147密切相关的枯草杆菌蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶AprM(BSAPRM)和碱性蛋白酶AH-101(BAH101)、Savinase(BLSAVI)(或密切相关的枯草杆菌蛋白酶M-蛋白酶(BSKSMK)、枯草杆菌蛋白酶PB92(BAALKP)、枯草杆菌蛋白酶BL(BLSUBL))、碱性弹性蛋白酶YaB(BSEYAB)、Thermitase(TVTHER)、枯草杆菌蛋白酶Sendai(BSAPRS)，或者它们的功能变体，其中所述功能变体保留了亚组I-S2的特征。
″SAVINASE″SAVINASE由NOVOZYMES A/S销售。它是来自迟缓芽孢杆菌(B.Lentus)的枯草杆菌蛋白酶309，并且只在一个位置处不同于BAALKP(N87S，见此处的图1)。SAVINASE具有在图1中称为b)的氨基酸序列。
亲本枯草杆菌酶术语“亲本枯草杆菌酶”描述根据Siezen等人(1991和1997)定义的枯草杆菌酶。关于进一步的细节，参见紧上述对“枯草杆菌酶”的描述。亲本枯草杆菌酶也可以是从天然来源分离的、并随后在保持枯草杆菌酶特性的情况下经过修饰的枯草杆菌酶。而且，亲本枯草杆菌酶还可以是通过如以下文献所述的DNA改组技术制备的枯草杆菌酶J.E.Ness等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)，17，893-896(1999)。术语“亲本枯草杆菌酶”可另外称为“野生型枯草杆菌酶”。
枯草杆菌酶变体的修饰本文所用的术语“修饰”定义为包括枯草杆菌酶的化学修饰以及对编码枯草杆菌酶的DNA所进行的遗传操作。修饰可以是氨基酸侧链的取代、目标氨基酸处的替换、缺失和/或插入。
枯草杆菌酶变体在本发明的上下文中，术语枯草杆菌酶变体或突变的枯草杆菌酶指由表达突变基因或修饰基因的生物体产生的枯草杆菌酶，该基因来源于含原始或亲本基因并产生相应亲本酶的亲本微生物，为产生突变基因对所述亲本基因进行了突变，这种突变基因在适宜的宿主中表达时产生所述的突变枯草杆菌酶。类似地，所述突变基因还可以来自通过DNA改组技术产生的亲本基因。
同源枯草杆菌酶序列在本上下文中，两种氨基酸序列之间的同源性用参数“同一性”描述。
为了确定两种枯草杆菌酶之间的同一性程度，可以使用相同的设定值应用(下文)GCG程序包9.1版的GAP方法。此方法的计算结果除了氨基酸序列对比外，还有两个序列之间的“同一性百分率”的计算结果。
根据此说明书，本领域技术人员可常规地鉴定适宜的同源性枯草杆菌酶和相应的同源活性位点环区，它们可以根据本发明进行修饰。
分离的DNA序列或多核苷酸本文所用术语“分离的核酸序列”是指具有明确核酸序列的多核苷酸分子，其已经分离和纯化并因此为适用于遗传工程化的蛋白质产生体系的形式。这些分离的分子可以是与其自然环境分离的分子，包括cDNA和基因组克隆以及来自DNA改组实验或定点诱变实验的多核苷酸或核酸序列。本发明的分离的多核苷酸或核酸序列不含其它通常与之相关的基因，但可包括5′和3′非翻译区如启动子和终止子。相关区域的鉴定对本领域技术人员来说是显而易见的(例如，参见Dynan和Tijan，自然316774-78，1985)。术语“分离的核酸序列”或“分离的多核苷酸”另外可称为“分离的DNA序列”、“克隆的多核苷酸”“克隆的核酸序列”或“克隆的DNA序列”。
分离的蛋白质术语“分离的”在应用于蛋白质时指此蛋白质已从其自然环境中分离出来。
在优选的形式中，分离的蛋白质基本上不含其它蛋白质，特别是其它同源蛋白质(即“同源杂质”(参见以下))。
通过SDS-PAGE测定，分离的蛋白质的纯度大于10％，优选大于20％，更优选大于30％。还优选提供通过SDS-PAGE测定纯度大于40％，大于60％，大于80％，更优选大于95％，并最优选大于99％的高度纯化形式的蛋白质。
术语“分离的蛋白质”可另称为“纯化的蛋白质”。
同源杂质术语“同源杂质”意指任何来源于最初获得本发明枯草杆菌酶的同源细胞的杂质(如非本发明枯草杆菌酶的另一多肽)。
自……获得本文所用与特定的微生物源相关的术语“自……获得”意指该多核苷酸和/或枯草杆菌酶是由此特定来源或由如下细胞产生，其中所述细胞中已插入来自于该来源的基因。
底物本文所用的与蛋白酶的底物相关的术语“底物”应以其最广义的形式解释为包括含有至少一个易于被枯草杆菌蛋白酶水解的肽键(酰胺键)的化合物。
产物本文所用的与来自蛋白酶酶促反应的产物有关的术语“产物”在本发明的上下文中应解释为包括涉及蛋白酶枯草杆菌酶的水解反应的产物。产物可以是随后的水解反应的底物。
洗涤性能在本发明上下文中，术语“洗涤性能”用以表示酶在例如洗涤或硬表面清洁过程中除去存在于待清洁物体上的卵污渍的能力。还参见本文实施例3中的“标准的洗涤剂洗涤性能试验”。
性能因子用下式定义术语“性能因子”
P＝R变体-R亲本其中，P为性能因子，R变体为按“标准的洗涤剂洗涤性能试验”中所述采用枯草杆菌酶变体处理之后的试验材料的反射能力(reflectance)(于460nm处测定)，而R亲本为按“标准的洗涤剂洗涤性能试验”中所述采用对应的亲本枯草杆菌酶处理之后的试验材料的反射能力(于460nm处测定)。进一步的详情参见本文实施例3中的“标准的洗涤剂洗涤性能试验”。
剩余活性术语“剩余活性”的定义见本文在“卵抑制测定”中的描述(见实施例3)。
附图简述图1表示使用上述的GAP法进行的枯草杆菌蛋白酶BPN′(a)和Savinase(b)之间的序列对比。
发明详述本发明人发现，其中某些区域较目前已知的区域长的枯草杆菌蛋白酶变体较亲本枯草杆菌酶相比被存在于卵中的物质如IV-0类胰蛋白酶抑制剂抑制的程度显著地降低，因此本发明的变体对卵污渍的清除表现出改进的洗涤性能。
其鉴定已在构建枯草杆菌蛋白酶的变体，尤其是枯草杆菌蛋白酶309(BLSAVI或Savinase)的变体的过程中进行。不被任何特定的理论所束缚，目前认为由于空间位阻和/或构象变化，卵清抑制剂与枯草杆菌酶变体底物结合区的结合受阻。
因此，认为适于此处所述用途的变体是这样的变体，其中当与野生型枯草杆菌酶比较时，在以下位置的一处或多处已插入了一个或多个氨基酸残基位置42和43之间、位置51和52之间、位置52和53之间、位置53和54之间、位置54和55之间、位置55和56之间、位置155和156之间、位置156和157之间、位置157和158之间、位置158和159之间、位置159和160之间、位置160和161之间、位置187和188之间、位置188和189之间、位置189和190之间、位置216和217之间、位置217和218之间、或位置218和219之间(BASBPN编号)，特别是在位置217和218之间。
本发明第一方面的枯草杆菌酶变体可为从自然界中鉴定并分离的亲本或野生型枯草杆菌酶。
这样的亲本野生型枯草杆菌酶可通过本领域公知的标准技术进行特异性筛选。
进行特异性筛选的一种优选方式为通过特异性PCR从许多不同的微生物，优选地从不同的芽孢杆菌菌株扩增已知编码枯草杆菌酶中活性位点环的DNA区域。
枯草杆菌酶为一组保守的酶，这是从它们的DNA和氨基酸序列具有同源性这一意义上说的。因此可在活性位点环的侧翼构建相对特异的引物。
构建相对特异引物的一种方式是研究不同枯草杆菌酶的序列对比(参见如Siezen等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523)。根据此常规工作，本领域技术人员可以构建位于任一I-S1组或I-S2组如BLSAVI的上述位置侧翼的PCR引物。使用此类PCR引物从许多不同的微生物(优选地不同的芽孢杆菌菌株)扩增DNA，然后对该扩增的PCR片段进行DNA测序，可鉴定到产生属于这些组的、与如BLSAVI的序列相比包含插入的枯草杆菌酶的菌株。鉴定完菌株及此目标枯草杆菌酶的部分DNA序列后，克隆、表达和纯化此枯草杆菌酶为本领域技术人员的常规工作。
但是，可以想到的是，本发明的枯草杆菌酶变体主要是亲本枯草杆菌酶的变体。
适用于此处所述用途的枯草杆菌酶变体可通过本领域公知的标准技术构建，如对不同枯草杆菌酶序列进行定点/随机诱变或DNA改组。进一步的详情参见本文的″材料和方法″部分(下文)。
本领域技术人员将认识到本文所述的变体可包含一个或多个其它的修饰，尤其是一个或多个其它的插入或替换。
而且，在本文所述区域中的插入可包括一个以上氨基酸残基的插入。例如，本发明的变体可包含一个插入、两个插入或两个以上的插入，如三个、四个或五个插入。
在本发明的一个令人感兴趣的实施方案中，在位置42和43之间插入额外的氨基酸残基。
在位置42和43之间的插入优选为选自以下的插入(BASBPN编号)X42X{A，T，G，S}，如X42XA，X42XT，X42XG，X42XS；X42X{D，E，K，R}，如X42XD，X42XE，X42XK，X42XR；X42X{H，V，C，N，Q}，如X42XH，X42XV，X42XC，X42XN，X42XQ；以及X42X{F，I，L，M，P，W，Y}，如X42XF，X42XI，X42XL，X42XM，X42XP，X42XW，X42XY；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为D42D{A，T，G，S}，如D42DA，D42DT，D42DG，D42DS；D42D{D，E，K，R}，如D42DD，D42DE，D42DK，D42DR；D42D{H，V，C，N，Q}，如D42DH，D42DV，D42DC，D42DN，D42DQ；以及D42D{F，I，L，M，P，W，Y}，如D42DF，D42DI，D42DL，D42DM，D42DP，D42DW，D42DY。
在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，在位置51和52之间插入额外的氨基酸残基。
在位置51和52之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)X51X{A，T，G，S}，如X51XA，X51XT，X51XG，X51XS；X51X{D，E，K，R}，如X51XD，X51XE，X51XK，X51XR；X51X{H，V，C，N，Q}，如X51XH，X51XV，X51XC，X51XN，X51XQ；以及
X51X{F，I，L，M，P，W，Y}，如X51XF，X51XI，X51XL，X51XM，X51XP，X51XW，X51XY；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为V51V{A，T，G，S}，例如，V51VA，V51VT，V51VG，V51VS；V51V{D，E，K，R}，例如，V51VD，V51VE，V51VK，V51VR；V51V{H，V，C，N，Q}，例如，V51VH，V51VV，V51VC，V51VN，V51VQ；和V51V{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，V51VF，V51VI，V51VL，V51VM，V51VP，V51VW，V51VY.
在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，在位置52和53之间插入额外的氨基酸残基。
在位置52和53之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)X52X{A，T，G，S}，例如，X52XA，X52XT，X52XG，X52XS；X52X{D，E，K，R}，例如，X52XD，X52XE，X52XK，X52XR；X52X{H，V，C，N，Q}，例如，X52XH，X52XV，X52XC，X52XN，X52XQ；和X52X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X52XF，X52XI，X52XL，X52XM，X52XP，X52XW，X52XY；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为P52P{A，T，G，S}，例如，P52PA，P52PT，P52PG，P52PS；P52P{D，E，K，R}，例如，P52PD，P52PE，P52PK，P52PR；P52P{H，V，C，N，Q}，例如，P52PH，P52PV，P52PC，P52PN，P52PQ；和P52P{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，P52PF，P52PI，P52PL，P52PM，P52PP，P52PW，P52PY.
在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，在位置53和54之间插入额外的氨基酸残基。
在位置53和54之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)X53X{A，T，G，S}，例如，X53XA，X53XT，X53XG，X53XS；X53X{D，E，K，R}，例如，X53XD，X53XE，X53XK，X53XR；X53X{H，V，C，N-，Q}，例如，X53XH，X53XV，X53XC，X53XN，X53XQ；和X53X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X53XF，X53XI，X53XL，X53XM，X53XP，X53XW，X53XY；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为G53G{A，T，G，S}，例如，G53GA，G53GT，G53GG，G53GS；G53G{D，E，K，R}，例如，G53GD，G53GE，G53GK，G53GR；G53G{H，V，C，N，Q}，例如，G53GH，G53GV，G53GC，G53GN，G53GQ；和G53G{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，G53GF，G53GI，G53GL，G53GM，G53GP，G53GW，G53GY.
又在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，在位置54和55之间插入额外的氨基酸残基。
在位置54和55之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)X54X{A，T，G，S}，例如，X54XA，X54XT，X54XG，X54XS；X54X{D，E，K，R}，例如，X54XD，X54XE，X54XK，X54XR；X54X{H，V，C，N，Q}，例如，X54XH，X54XV，X54XC，X54XN，X54XQ；和X54X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X54XF，X54XI，X54XL，X54XM，X54XP，X54XW，X54XY；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为E54E{A，T，G，S}，例如，E54EA，E54ET，E54EG，E54ES；E54E{D，E，K，R}，例如，E54ED，E54EE，E54EK，E54ER；E54E{H，V，C，N，Q}，例如，E54EH，E54EV，E54EC，E54EN，E54EQ；和E54E{F ，I，L，M，P，W，Y}，例如，E54EF，E54EI，E54EL，E54EM，E54EP，E54EW，E54EY.
在本发明再一个令人感兴趣的实施方案中，在位置55和56之间插入额外的氨基酸残基。
在位置55和56之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)X55X{A，T，G，S}，例如，X55XA，X55XT，X55XG，X55XS；X55X{D，E，K，R}，例如，X55XD，X55XE，X55XK，X55XR；X55X{H，V，C，N，Q}，例如，X55XH，X55XV，X55XC，X55XN，X55XQ；和X55X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X55XF，X55XI，X55XL，X55XM，X55XP，X55XW，X55XY；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为P55P{A，T，G，S}，例如，P55PA，P55PT，P55PG，P55PS；P55P{D，E，K，R}，例如，P55PD，P55PE，P55PK，P55PR；P55P{H，V，C，N，Q}，例如，P55PH，P55PV，P55PC，P55PN，P55PQ；和P55P{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，P55PF，P55PI，P55PL，P55PM，P55PP，P55PW，P55PY.
在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，在位置155和156之间插入额外的氨基酸残基。
在位置155和156之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)X155X{A，T，G，S}，例如，X155XA，X155XT，X155XG，X155XS；X155X{D，E，K，R}，例如，X155XD，X155XE，X155XK，X155XR；X155X{H，V，C，N，Q}，例如，X155XH，X155XV，X155XC，X155XN，X155XQ；和X155X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X155XF，X155XI，X155XL，X155XM，X155XP，X155XW，X155XY；
或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为N155N{A，T，G，S}，例如，N155NA，N155NT，N155NG，N155NS；N155N{D，E，K，R}，例如，N155ND，N155NE，N155NK，N155NR；N155N{H，V，C，N，Q}，例如，N155ANH，N155NV，N155NC，N155NN，N155NQ；和N155N{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，N155NF，N155NI，N155NL，N155NM，N155NP，N155NW，N155NY.
在本发明的又一个令人感兴趣的实施方案中，在位置156和157之间插入额外的氨基酸残基。
在位置156和157之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)X156X{A，T，G，S}，例如，X156XA，X156XT，X156XG，X156XS；X156X{D，E，K，R}，例如，X156XD，X156XE，X156XK，X156XR；X156X{H，V，C，N，Q}，例如，X156XH，X156XV，X156XC，X156XN，X156XQ；和X156X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X156XF，X156XI，X156XL，X156XM，X156XP，X156XW，X156XY；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为S156S{A，T，G，S}，例如，S156SA，S156ST，S156SG，S156SS；S156S{D，E，K，R}，例如，S156SD，S156SE，S156SK，S156SR；S156S{H，V，C，N，Q}，例如，S156SH，S156SV，S156SC，S156SN，S156SQ；和S156S{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，S156SF，S156SI，S156SL，S156SM，S156SP，S156SW，S156SY.
又在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，在位置157和158之间插入额外的氨基酸残基。
在位置157和158之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)
X157X{A，T，G，S}，例如，X157XA，X157XT，X157XG，X157XS；X157X{D，E，K，R}，例如，X157XD，X157XE，X157XK，X157XR；X157X{H，V，C，N，Q}，例如，X157XH，X157XV，X157XC，X157XN，X157XQ；和X157X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X157XF，X157XI，X157XL，X157XM，X157XP，X157XW，X157XY；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为G157G{A，T，G，S}，例如，G157GA，G157GT，G157GG，G157GS；G157G{D，E，K，R}，例如，G157GD，G157GE，G157GK，G157GR；G157G{H，V，C，N，Q}，例如，G157GH，G157GV，G157GC，G157GN，G157GQ；和G157G{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，G157GF，G157GI，G157GL，G157GM，G157GP，G157GW，G157GY.
在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，在位置158和159之间插入额外的氨基酸残基。
在位置158和159之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)X158X{A，T，G，S}，例如，X158XA，X158XT，X158XG，X158XS；X158X{D，E，K，R}，例如，X158XD，X158XE，X158XK，X158XR；X158X{H，V，C，N，Q}，例如，X158XH，X158XV，X158XC，X158XN，X158XQ；和X158X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X158XF，X158XI，X158XL，X158XM，X158XP，X158XW，X158XY；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为*158{A，T，G，S}，例如，*158A，*158T，*158G，*158S；*158{D，E，K，R}，例如，*158D，*158E，*158K，*158R；*158{H，V，C，N，Q}，例如，*158H，*158V，*158C，*158N，*158Q；和*158{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，*158F，*518I，*158L，*158M，*158P，*158W，*158Y.
在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，在位置159和160之间插入额外的氨基酸残基。
在位置159和160之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)X159X{A，T，G，S}，例如，X159XA，X159XT，X159XG，X159XS；X159X{D，E，K，R}，例如，X159XD，X159XE，X159XK，X159XR；X159X{H，V，C，N，Q}，例如，X159XH，X159XV，X159XC，X159XN，X159XQ；和X159X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X159XF，X159XI，X159XL，X159XM，X159XP，X159XW，X159XY；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为A159A{A，T，G，S}，e.g.，A159AA，A159AT，A159AG，A159AS；A159A{D，E，K，R}，e.g.，A159AD，A159AE，A159AK，A159AR；A159A{H，V，C，N，Q}，e.g.，A159AH，A159AV，A159AC，A159AN，A159AQ；和A159A{F，I，L，M，P，W，Y}，e.g.，A159AF，A159AI，A159AL，A159AM，A159AP，A159AW，A159AY.
又在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，在位置160和161之间插入额外的氨基酸残基。
在位置160和161之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)X160X{A，T，G，S}，例如，X160XA，X160XT，X160XG，X160XS；X160X{D，E，K，R}，例如，X160XD，X160XE，X160XK，X160XR；X160X{H，V，C，N，Q}，例如，X160XH，X160XV，X160XC，X160XN，X160XQ；和X160X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X160XF，X160XI，X160XL，X160XM，X160XP，X160XW，X160XY；
或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为G160G{A，T，G，S}，例如，G160GA，G160GT，G160GG，G160GS；G160G{D，E，K，R}，例如，G160GD，G160GE，G160GK，G160GR；G160G{H，V，C，N，Q}，例如，G160GH，G160GV，G160GC，G160GN，G160GQ；和G160G{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，G160GF，G160GI，G160GL，G160GM，G160GP，G160GW，G160GY.
在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，在位置187和188之间插入额外的氨基酸残基。
在位置187和188之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)X187X{A，T，G，S}，例如，X187XA，X187XT，X187XG，X187XS；X187X{D，E，K，R}，例如，X187XD，X187XE，X187XK，X187XR；X187X{H，V，C，N，Q}，例如，X187XH，X187XV，X187XC，X187XN，X187XQ；和X187X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X187XF，X187XI，X187XL，X187XM，X187XP，X187XW，X187XY；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为A187A{A，T，G，S}，例如，A187AA，A187AT，A187AG，A187AS；A187fA{D，E，K，R}，例如，A187AD，A187AE，A187AK，A187AR；A187A{H，V，C，N，Q}，例如，A187AH，A187AV，A187AC，A187AN，A187AQ；和A187A{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，A187AF，A187AI，A187AL，A187AM，A187AP，A187AW，A187AY.
在本发明的又一个令人感兴趣的实施方案中，在位置188和189之间插入额外的氨基酸残基。
在位置188和189之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)
X188X{A，T，G，S}，例如，X188XA，X188XT，X188XG，X188XS；X188X{D，E，K，R}，例如，X188XD，X188XE，X188XK，X188XR；X188X{H，V，C，N，Q}，例如，X188XH，X188XV，X188XC，X188XN，X188XQ；和X188X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X188XF，X188XI，X188XL，X188XM，X188XP，X188XW，X188XY；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为S188S{A，T，G，S}，例如，S188SA，S188ST，S188SG，S188SS；S188S{D，E，K，R}，例如，S188SD，S188SE，S188SK，S188SR；S188S{H，V，C，N，Q}，例如，S188SH，S188SV，S188SC，S188SN，S188SQ；andS188S{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，S188SF，S188SI，S188SL，S188SM，S188SP，S188SW，S188SY.
又在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，在位置189和190之间插入额外的氨基酸残基。
在位置189和190之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)X189X{A，T，G，S}，例如，X189XA，X189XT，X189XG，X189XS；X189X{D，E，K，R}，例如，X189XD，X189XE，X189XK，X189XR；X189X{H，V，C，N，Q}，例如，X189XH，X189XV，X189XC，X189XN，X189XQ；和X189X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X189XF，X189XI，X189XL，X189XM，X189XP，X189XW，X189XY；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为F189F{A，T，G，S}，例如，F189FA，F189FT，F189FG，F189FS；F189F{D，E，K，R}，例如，F189FD，F189FE，F189FK，F189FR；F189F{H，V，C，N，Q}，例如，F189FH，F189FV，F189FC，F189FN，F189FQ；和F189F{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，F189FF，F189FI，F189FL，F189FM，F189FP，F189FW，F189FY.
在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，在位置216和217之间插入额外的氨基酸残基。
在位置216和217之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)X216X{A，T，G，S}，例如.，X216XA，X216XT，X216XG，X216XS；X216X{D，E，K，R}，例如.，X216XD，X216XE，X216XK，X216XR；X216X{H，V，C，N，Q}，例如.，X216XH，X216XV，X216XC，X216XN，X216XQ；和X216X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如.，X216XF，X216XI，X216XL，X216XM，X216XP，X216XW，X216XY；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为S216S{A，T，G，S}，例如.，S216SA，S216ST，S216SG，S216SS；S216S{D，E，K，R}，例如.，S216SD，S216SE，S216SK，S216SR；S216S{H，V，C，N，Q}，例如.，S216SH，S216SV，S216SC，S216SN，S216SQ；和S216S{F，I，L，M，P，W，Y}，例如.，S216SF，S216SI，S216SL，S216SM，S216SP，S216SW，S216SY.
在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，在位置217和218之间插入额外的氨基酸残基。
在位置217和218之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)X217X{A，T，G，S}，例如.，X217XA，X217XT，X217XG，X217XS；X217X{D，E，K，R}，例如.，X217XD，X217XE，X217XK，X217XR；X217X{H，V，C，N，Q}，例如.，X217XH，X217XV，X217XC，X217XN，X217XQ；和X217X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如.，X217XF，X217XI，X217XL，X217XM，X217XP，X217XW，X217XY；
或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为L217L{A，T，G，S}，例如.，L217LA，L217LT，L217LG，L217LS；L217L{D，E，K，R}，例如.，L217LD，L217LE，L217LK，L217LR；L217L{H，V，C，N，Q}，例如.，L217LH，L217LV，L217LC，L217LN，L217LQ；和L217L{F，I，L，M，P，W，Y}，例如.，L217LF，L217LI，I217LL，L217LM，L217LP，L217LW，L217LY.
又在本发明的另一个令人感兴趣的实施方案中，在位置218和219之间插入额外的氨基酸残基。
在位置218和219之间的插入优选是选自以下的插入(BASBPN编号)X218X{A，T，G，S}，例如.，X218XA，X218XT，X218XG，X218XS；X218X{D，E，K，R}，例如.，X218XD，X218XE，X218XK，X218XR；X218X{H，V，C，N，Q}，例如.，X218XH，X218XV，X218XC，X218XN，X218XQ；和X218X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如.，X218XF，X218XI，X218XL，X218XM，X218XP，X218XW，X218XY ；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，为N218N{A，T，G，S}，例如.，N218NA，N218NT，N218NG，N218NS；N218N{D，E，K，R}，例如.，N218ND，N218NE，N218NK，N218NR；N218N{H，V，C，N，Q}，例如.，N218NH，N218NV，N218NC，N218NN，N218NQ；和N218N{F，I，L，M，P，W，Y}，例如.，N218NF，N218NI，N218NL，N218NM，N218NP，N218NW，N218NY.
而且，据认为除了根据本发明进行上述的插入外，在位置95至103(BASBPN编号)的活性位点环(b)区域中插入至少一个额外的氨基酸残基将会进一步降低由IV-0类胰蛋白酶抑制剂引起的抑制。可以想到，在位置98和99之间的额外插入和/或在位置99和100之间的插入将尤其有益。此类额外插入的实例为X98X{A，T，G，S}，如X98XA，X98XT，X98XG，X98XS；X98X{D，E，K，R}，如X98XD，X98XE，X98XK，X98XR；X98X{H，V，C，N，Q}，如X98XH，X98XV，X98XC，X98XN，X98XQ；以及X98X{F，I，L，M，P，W，Y}，如X98XF，X98XI，X98XL，X98XM，X98XP，X98XW，X98XY；优选地为X98XD和X98XE；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶，为A98A{A，T，G，S}，如A98AA，A98AT，A98AG，A98AS；A98A{D，E，K，R}，如A98AD，A98AE，A98AK， A98AR；A98A{H，V，C，N，Q}，如A98AH，A98AV，A98AC，A98AN，A98AQ；A98A{F，I，L，M，P，W，Y}，如A98AF，A98AI，A98AL，A98AM，A98AP，A98AW，A98AY；优选地为A98AD和A98AE。
另外的实例包括X99X{A，T，G，S}，如X99XA，X99XT，X99XG，X99XS；X99X{D，E，K，R}，如X99XD，X99XE，X99XK，X99XR；X99X{H，V，C，N，Q}，如X99XH，X99XV，X99XC，X99XN，X99XQ；以及X99X{F，I，L，M，P，W，Y}，如X99XF，X99XI，X99XL，X99XM，X99XP，X99XW，X99XY；优选地为X99XD和X99XE；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶，为S99S{A，T，G，S}，如S99SA，S99ST，S99SG，S99SS；S99S{D，E，K，R}，如S99SD，S99SE，S99SK，S99SR；S99S{H，V，C，N，Q}，如S99SH，S99SV，S99SC，S99SN，S99SQ；S99S{F，I，L，M，P，W，Y}，如S99SF，S99SI，S99SL，S99SM，S99SP，S99SW，S99SY；优选地为S99SD和S99SE。
对于位置99和100之间的插入，优选该插入与在位置99的替换相结合。因此，除了上述所考虑到的插入外，还认为在位置99的下列替换是适当的X99{A，T，G，S}，如X99A，X99T，X99G，X99S；X99{D，E，K，R}，如X99D，X99E，X99K，X99R；X99{H，V，C，N，Q}，如X99H，X99V，X99C，X99N，X99Q，以及X99{F，I，L，M，P，W，Y}，如X99F，X99I，X99L，X99M，X99P，X99W，X99Y；或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶，为S99{A，T，G}，如S99A，S99T，S99G；S99{D，E，K，R}，如S99D，S99E，S99K，S99R；S99{H，V，C，N，Q}，如S99H，S99V，S99C，S99N，S99Q；以及S99{F，I，L，M，P，W，Y}，如S99F，S99I，S99L，S99M，S99P，S99W，S99SY。
在一个优选的实施方案中，在位置99处的替换选自X99{A，T，G，S}，特别是X99A，或更具体地，对枯草杆菌蛋白酶309和密切相关的枯草杆菌酶为S99{A，.T，G}，特别是S99A。
现有技术中已知，用类似的氨基酸残基对某氨基酸残基进行的所谓保守替代预期将仅造成酶特征的微小变化。
下列表I列出了保守氨基酸替换的组表I保守氨基酸替换共性氨基酸碱性(带正电荷)K＝赖氨酸H＝组氨酸酸性(带负电荷)E＝谷氨酸D＝天冬氨酸极性 Q＝谷氨酰胺N＝天冬酰胺疏水 L＝亮氨酸I＝异亮氨酸V＝缬氨酸M＝甲硫氨酸芳族 F＝苯丙氨酸W＝色氨酸Y＝酪氨酸小G＝甘氨酸A＝丙氨酸S＝丝氨酸T＝苏氨酸根据这个原则，包含保守替换的枯草杆菌酶变体预期不会显示出彼此之间具有明显不同的特性。
基于此处公开的和/或示例性的枯草杆菌酶变体，确定可对这些变体进行的合适保守修饰以获得显示出类似改进洗涤性能的其它枯草杆菌酶变体为本领域技术人员的常规工作。
对于从自然或人工的多样性创建体中分离酶，及对于从亲本枯草杆菌酶设计并产生变体，均优选亲本枯草杆菌酶属于亚组I-S1和1-S2，尤其是亚组I-S2。
对于来自亚组I-S1的变体，亲本枯草杆菌酶优选地选自BSS168(BSSAS、BSAPRJ、BSAPRN、BMSAMP)、BASBPN、BSSDY、BLSCAR(BLKERA、BLSCA1、BLSCA2、BLSCA3)、BSSPRC、和BSSPRD，或它们的保留了亚组I-S1特性的功能性变体。
对于来自亚组I-S2的变体，亲本枯草杆菌酶优选地选自BSAPRQ、BLS147(BSAPRM、BAH101)、BLSAVI(BSKSMK、BAALKP(BAPB92)、BLSUBL)、BSEYAB、TVTHER和BSAPRS，或它们的保留了亚组I-S2特性的功能性变体。
尤其是，亲本枯草杆菌酶可以是BLSAVI(savinase，NOVOZYMESA/S)，并且本发明优选的枯草杆菌酶变体因此为Savinase的变体。
本发明也包含其氨基酸序列中组合有任何其它修饰的任一上述枯草杆菌酶变体。特别是可以想到与本领域公知的能提供改良的酶性质的其它修饰进行组合。现有技术描述了一些具有不同改良性质的枯草杆菌酶变体，其中的一些在本文的“发明背景”部分中已有提及(见上)。这些参考文献在此处公开作为参考，用来鉴定枯草杆菌酶变体，其可有利地与此处描述的枯草杆菌酶变体组合。
此类组合包含位置222(提高氧化稳定性)、218(提高热稳定性)、在稳定酶的Ca-结合位点如位置76处的替换、以及从现有技术显而易见的许多其它位置。
在进一步的实施方案中，此处描述的枯草杆菌酶变体可有利地与任一下列位置处(BASBPN编号)的一个或多个修饰组合27，36，56，76，87，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，120，123，129，131，132，133，143，159，167，170，192，194，206，217，218，222，224，232，235，236，245，248，252或274尤其是，枯草杆菌蛋白酶Savinase(BLSAVI)、BLSUBL、BSKSMK和BAALKP的以下变体被认为适于组合K27R，*36D，T56P，N76D，N87S，A97N，A98AT，A98AS，N99ND，N99NR，N99A，N99T，R101G，P103A，V104A，V104I，V104N，V104Y，D120H，N123S，P129K，P131H，A133P，A133D，A133E，T143K，*159D，*159E，Y167X，Y167A，R170X，R170S，A194P，Q206E，F217R，N218S，M222S，M222A，T224S，A232V，K235L，Q236H，Q245R，N248D，N252K和T274A.
更让人特别感兴趣的为这样的本发明的枯草杆菌酶变体，其中的修饰包含以下任一种修饰R101G+V104N，S101G+V104N，S87N+S101G+V104N，K27R+V104Y+N123S+T274A，N76D+V104A，或R101G+P103A+V104I+*159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K；或这些修饰(K27R，N76D，R101G，S101G，P103A，V104I，V104N，V104A，V104Y，N123S，*159D，A232V，Q236H，Q245R，N248D，N252K，T274A)的其它组合，以及任意一种或多种上述或下述显示出改进特性的修饰。
特别令人感兴趣的变体为这样的变体，其中除了根据本发明的插入外，还包含下列替换S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K。
而且，本发明主要方面的枯草杆菌酶变体优选与一个或多个在位置129、131和194之任一处的修饰组合，所述修饰优选地为129K、131H和194P修饰，且最优选地为P129K、P131H和A194P修饰。在生产枯草杆菌酶变体时，预期所有这些修饰都可以提供更高的枯草杆菌酶变体表达水平。
如上所述，本发明的变体只有限地被IV-0类胰蛋白酶抑制剂抑制，结果它们呈现出对卵污渍良好的洗涤性能。因此，为了使技术人员在其进行工作的早期阶段可选出有效且优选的变体用于此目的，本发明人提供了适当的预试验，该试验易于被技术人员实施，旨在初步评估所讨论的变体的性能。
因此，可采用在本文实施例4中所公开的″卵抑制测定″来初步评估所选择变体的潜力。换言之，可采用″卵抑制测定″来评估所选择的变体是否被IV-0类胰蛋白酶抑制剂抑制，以及抑制程度如何。应用这种测试可评估所选择的变体在去除卵污渍方面的适用性，其原理为如果所选择的变体被IV-0类胰蛋白酶抑制剂强烈抑制，则通常无需进行进一步的测试实验。
因此，对于此处描述的目的而言，尤其令人感兴趣的变体为这样的变体，当在本文实施例4中描述的″卵抑制测定″试验中测试时其具有至少15％(如至少20％)，优选地至少25％(如至少30％)，更优选地至少35％的剩余活性。在本发明的一个尤其令人感兴趣的实施方案中，当在本文实施例4中描述的″卵抑制测定″试验中测试时，变体具有至少40％的剩余活性，如至少45％，诸如至少50％，优选地至少55％的剩余活性，如至少60％，更优选地至少65％，如至少70％，甚至更优选地至少75％，如至少80％，诸如至少90％的剩余活度。
明显地，优选本发明的变体至少在所述的最低水平上，更优选在所述的中等水平上，最优选在所述的最高水平上符合上述标准。
作为备选方案或联合上述试验，所选择变体的适用性可用本文实施例3中所公开的“标准的洗涤剂洗涤性能试验”进行测试。可以将变体掺入标准的洗涤剂组合物中，与参照体系即亲本枯草杆菌酶进行比较(将亲本枯草杆菌酶掺入同样的标准洗涤剂体系并在相同的条件下测试)，用“标准的洗涤剂洗涤性能试验”评价变体除去标准纺织物上的卵污渍的能力。利用这种试验，可以初步研究所选择的变体除去卵污渍的适用性，其原理是如果所选择的变体在试验中没有表现出相对于亲本枯草杆菌酶的明显改进，则一般不需要进行进一步的试验。
因此，对于此处描述的目的而言，尤其令人感兴趣的变体为这样的变体如本文“标准的洗涤剂洗涤性能试验”中所述，当它在包含以下成分的标准洗涤剂组合物中试验时，与在相同条件下试验的亲本枯草杆菌酶相比表现出改进的卵污渍洗涤性能，标准的洗涤剂组合物包含6.2％ LAS(Nansa 80S)2％ C16-C18脂肪酸的钠盐4％ 非离子表面活性剂(Plurafax LF404)22％ 沸石P10.5％Na2CO34％ Na2Si2O52％ 羧甲基纤维素(CMC)6.8％ 丙烯酸盐液体CP540％20％ 过硼酸钠(经验式NaBO2.H2O2)0.2％ EDTA21％ Na2SO4水(平衡量)可以采用在本文的实施例3中定义的所谓“性能因子”对洗涤性能的改进进行定量。
在本发明的一个非常令人感兴趣的实施方案中，本发明的变体在“洗涤性能试验”中测试时，其性能因子至少为1，如至少为1.5，例如至少为2，优选至少为2.5，如至少为3，例如至少为3.5，特别是至少为4，如至少为4.5，例如至少为5。
明显地，优选本发明的变体至少在所述的最低水平上，更优选在所述的中等水平上，最优选在所述的最高水平上符合上述标准。
产生枯草杆菌酶变体用于克隆枯草杆菌酶的许多方法和用于将插入物导入基因(如枯草杆菌酶基因)的许多方法在本领域是熟知的，参见在“发明背景”部分引用的参考文献。
通常可以采用用于克隆基因和向该基因引入插入物(随机和/或定点)的标准方法以获得本发明的枯草杆菌酶变体。对于适宜的技术的进一步描述，参照本文的实施例(见下文)和(Sambrook等人，(1989)，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel，F.M.等人(编辑)“分子生物学最新方法”(“Current protocols in Molecular Biology”)，John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编辑)“用于芽孢杆菌的分子生物学方法”(“Molecular Biological Methods forBacillus”)，John Wiley和Sons，1990)；和WO 96/34946。
而且，枯草杆菌酶变体可以通过用于人工产生多样性的标准技术构建，如通过不同枯草杆菌酶基因的DNA改组构建(参见WO 95/22625；Stemmer WPC，自然370389-91(1994))。例如将编码Savinase的基因与一种或多种部分枯草杆菌酶序列进行DNA改组，其中所述一种或多种部分枯草杆菌酶序列实际上已鉴定出与BLSAVI(Savinase)相比在任一上述位置处包含插入，在随后进行卵抑制测定筛选后，即可提供适用于此处所述目的的枯草杆菌酶变体。
表达载体包含编码本发明酶的DNA构建体的重组表达载体可以是任何可方便地进行重组DNA操作的载体。载体的选择一般取决于它将被导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体而存在的载体，这种载体的复制独立于染色体的复制，如质粒。
另外，所述载体可以在导入宿主细胞后被部分或全部整合入宿主细胞基因组中，并与其整合的染色体一起复制。
所述载体优选为这样的表达载体，其中编码本发明的酶的多核苷酸可操作地与DNA转录所需的其它片段相连接。一般来说，表达载体来自质粒或病毒DNA，或可以含有两者的元件。术语“可操作地连接”指将诸片段以使其能按它们的预期目的协同发挥功能的方式排列，如转录在启动子中引发并前行通过编码此酶的DNA序列。
所述的启动子可以是任何在所选择的宿主细胞内表现出转录活性的多核苷酸序列，并可以得自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。
用于细菌宿主细胞的适宜的启动子的实例包括以下基因的启动子嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)碱性蛋白酶基因或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因或λ噬菌体的PR或PL启动子或大肠杆菌的lac、trp-或tac-启动子。
如果需要，编码本发明酶的DNA序列还可以可操作地连接到适宜的终止子上。
本发明的重组载体还可包含能够使所述载体在所讨论的宿主细胞中复制的多核苷酸。
所述载体还可以包含可选择的标记，例如其产物弥补宿主细胞缺陷的基因，或编码如对抗生素像卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素等的抗性，或对重金属或除草剂的抗性的基因。
为了指导本发明的酶进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列或前序列)。可以将分泌信号序列在正确读框中连接编码酶的DNA序列。分泌信号序列一般位于编码此酶的DNA序列的5’端。所述分泌信号序列可以是通常与该酶相关的或来自编码另一种分泌蛋白质的基因。
分别用于连接编码本发明酶的DNA序列、启动子和任选地终止子和/或分泌信号序列，或通过适宜的PCR扩增方案组装这些序列和将它们插入含有复制或整合所需信息的适宜载体的方法对本领域技术人员来说是已知的(参见例如，Sambrook等人，前引书)。
宿主细胞具有编码本发明酶的DNA序列并导入到宿主细胞中的多核苷酸可以与所讨论的宿主同源或异源。如果与所述宿主细胞同源，即由该宿主细胞天然产生，则该多核苷酸一般可操作地与非其天然环境中存在的另一启动子序列相连接，或者适当时与另一分泌信号序列和/或终止子序列相连接。术语″同源″旨在包括编码天然存在于所讨论的宿主生物体中的酶的DNA序列。术语“异源的”旨在包括所述宿主细胞本身不表达的DNA序列。因此DNA序列可以来源于另一生物体或者是合成的序列。
导入本发明的DNA构建体或重组载体的宿主细胞可以包括任何能够产生本发明的酶的细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞，包括植物。
通过培养能够产生本发明的酶的细菌宿主细胞的实例是革兰氏阳性细菌，如芽孢杆菌菌株，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)或苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，或链霉菌菌株(streptomyces)，如变铅青链霉菌(S.lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(Echerichia coli)。
细菌的转化可以通过已知的方式用原生质体转化、电穿孔、接合或使用感受态细胞进行(参见Sambrook等人，见上)。
当在细菌如大肠杆菌中表达酶时，该酶一般以非溶解性颗粒驻留于细胞质中(称作包涵体)，或可以由细菌分泌序列引导到周质间隙。在前一种情况下，将细胞裂解，回收所述颗粒，变性，其后通过稀释变性试剂使酶重新折叠。后一种情况下，该酶可以通过以下操作从周质间隙中回收如超声或渗透压休克破坏细胞，使所述的周质间隙的内容物释放，再回收该酶。
当在革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属或链霉菌属菌株中表达该酶时，该酶可以驻留于细胞质中，或由细菌分泌序列引导到胞外培养基中。在后一种情况下，该酶可按下述方法从培养基中回收。
产生枯草杆菌酶变体的方法本发明提供了产生本发明的分离的酶的方法，其中在允许该酶产生的条件下培养已用具有编码该酶的DNA序列的多核苷酸转化的合适宿主细胞，以及从培养物中回收所得的酶。
当将含有编码该酶的DNA序列的表达载体转化入异源宿主细胞中时即可使本发明的酶异源重组产生。
由此可以产生以不含同源杂质为特征的高度纯化的枯草杆菌酶组合物。
本文中，同源杂质是指来源于最初获得本发明的酶的同源细胞的任何杂质(例如除本发明的酶之外的其他多肽)。
用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是任何适合于所讨论的宿主细胞生长的常规培养基。所表达的枯草杆菌酶可方便地分泌到培养基中，然后可以通过已知的方法回收，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，再利用盐如硫酸铵沉淀培养基中的蛋白质性成分，接下来进行层析，如离子交换层析、亲和层析等。
清洁和洗涤剂组合物一般来说，清洁和洗涤剂组合物已在本领域中有充分描述，对合适的清洁和洗涤剂组合物的进一步描述可以参见WO 96/34946；WO97/07202；WO 95/30011。
而且本文的实施例证明许多枯草杆菌酶变体对卵污渍具有改进的洗涤性能。
洗涤剂组合物枯草杆菌酶变体可以添加到洗涤剂组合物中而成为其中的组分。
例如，本发明的洗涤剂组合物可以制成用于手洗或机洗的洗涤剂组合物，包括适用于预处理污染织物的洗涤添加剂组合物和漂洗添加的织物柔顺剂组合物，或制成用于清洁普通家庭硬表面的洗涤剂组合物，或配制以用于手洗或机洗的洗盘操作。
在一特定的方面，本发明提供一种包含本发明的枯草杆菌酶的洗涤添加剂。所述的洗涤添加剂和洗涤剂组合物可以包含一种或多种其它的酶如另一种蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、例如漆酶，和/或过氧化物酶。
一般来说，所选择的酶的性能应当与所选择的洗涤剂相适应(即最适pH，与其它酶和非酶组分具相容性等)，且所述的酶应以有效剂量存在。
蛋白酶合适的蛋白酶包括来自动物、植物、微生物的蛋白酶。来源于微生物的蛋白酶是优选的。也包括经化学修饰或蛋白工程化的突变体。所述的蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是来自芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，例如，枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如来自猪或牛的)和如WO 89/06270和WO 94/25583中所公开的镰孢霉属(Fusarium)的蛋白酶。
有用的蛋白酶的实例是如WO 92/19729，WO 98/20115，WO98/20116和WO 98/34946所描述的变体，特别是在一个或多个下述位置发生替换的变体27，36，57，76，87，97，101，104，120，123，167，170，194，206，218，222，224，235和274。
优选的可商购的蛋白酶包括AlcalaseTM，SavinaseTM，PrimaseTM，DuralaseTM，EsperaseTM和KannaseTM(Novozymes A/S)，MaxataseTM，MaxacalTM，MaxapemTM，ProperaseTM，PurafectTM，Purafect OxPTM，FN2TM和FN3TM(Genencor International Inc.)。
脂肪酶合适的脂肪酶包括那些来源于细菌或真菌的脂肪酶。也包括经化学修饰或蛋白工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(Humicola)(Thermomyces与之同物异名)，如EP 258 068和EP 305 216中所述的来自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶或如WO 96/13580中所述的来自H.Insolens的脂肪酶；假单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)，施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，荧光假单胞菌(P.fluorescens)，假单胞菌菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，P.wisconsinensis(WO 96/1201)；芽孢杆菌脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人(1993)，生物化学与生物物理学学报(Biochemica et Biophysica Acta)，1131，253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.Pumilus)(WO 91/16422)。
其它的实例为如WO 92/05249，WO94/01541，EP 407 225，EP 260105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO 94/25578，WO95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202中所述的脂肪酶变体。
优选的可商购的脂肪酶包括LipolaseTM和LipolaseUltraTM(Novozymes A/S)。
淀粉酶合适的淀粉酶(α和/或β)包括那些来源于细菌或真菌的淀粉酶。也包括经化学修饰或蛋白工程化的突变体。淀粉酶包括例如来源于芽孢杆菌的α-淀粉酶，例如来自地衣芽孢杆菌的特定菌株，详细内容参见GB 1,296,839。
有用的淀粉酶的实例是如WO 94/02597，WO 94/18314，WO96/23873和WO 97/43424中所描述的变体，尤其是那些在一个或多个下列位置发生替换的变体15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408和444。
可商购的淀粉酶是DuramylTM，TermamylTM，FungamylTM和BANTM(Novozymes A/S)，RapidaseTM和PurastarTM(来自GenencorInternational Inc.)。
纤维素酶合适的纤维素酶包括来源于细菌或真菌的纤维素酶。也包括其经化学修饰或蛋白工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属(Humicola)、镰孢霉属(Fusarium)、草根霉属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶，例如可由在US 4,435,307，US 5,648,263，US 5,691,178，US 5,776,757和WO 89/09259中公开的Humicola insolens、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)和尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。
特别合适的纤维素酶是具有颜色保护优势的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的实例为如EP 0 495 257，EP 0 531 372，WO 96/11262，WO 96/29397，WO 98/08940中所公开的纤维素酶。其它的实例为如那些在WO 94/07998，EP 0 531 315，US 5,457,046，US 5,686,593，US5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和PCT/DK98/00299中所公开的纤维素酶变体。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(NovozymesA/S)，ClazinaseTM和Puradax HATM(Genencor International Inc.)和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
过氧化物酶/氧化酶合适的过氧化物酶/氧化酶包括那些来源于植物、细菌或真菌的过氧化物酶/氧化酶。也包括化学修饰或蛋白工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括如WO 93/24618，WO 95/10602和WO 98/15257所述的来自鬼伞属(Coprinus)(例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus))和其变体的过氧化物酶。
可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(Novozymes A/S)。
所述的洗涤剂酶可以通过添加含一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加含所有这些酶的组合添加剂而被包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，也就是独立添加剂或组合添加剂可以制成例如颗粒状、液体、浆状等等。优选的洗涤剂添加剂形式为颗粒状(特别是无粉尘颗粒)、液体(特别是稳定的液体)或浆。
无粉尘颗粒可依照例如US 4,106,991和4,661,452所述进行生产并可任选地用已知的方法加包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000到20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；含有16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基脂肪醇，其中，醇含12到20个碳原子且其中存在15到80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、二-和三酸甘油酯。GB 1483591中给出了适合于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。液体酶制剂可以依照现成的方法通过例如添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸得以稳定。受保护的酶可依照EP 238,216中所公开的方法进行制备。
本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如棒状、片状、粉末、颗粒、粘团或液体。液体洗涤剂可以是含水的，一般含高达70％的水和0-30％的有机溶剂，或不含水的。
所述的洗涤剂组合物一般包含一种或多种表面活性剂，它们可以是非离子(包括半极性的)和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子表面活性剂。所述的表面活性剂一般占到0.1％到60％的重量。当包含在所述洗涤剂中时，通常包含约1％到约40％的阴离子表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐、α-烯属磺酸盐、硫酸烷基酯(硫酸脂肪醇酯)、乙氧基硫酸醇酯、仲链烷磺酸酯、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或链烯基琥珀酸或皂。
当包含在所述洗涤剂中时，通常含有约0.2％到约40％的非离子表面活性剂例如乙氧基化脂肪醇、乙氧基化壬基酚、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
所述的洗涤剂可以包含0-65％的洗涤剂增洁剂或络合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或链烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层叠式硅酸盐(例如购自Hoechst的SKS-6)。
所述的洗涤剂还可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸如聚丙烯酸、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂醇酯/丙烯酸共聚物。
所述的洗涤剂还可以含有可以包含H2O2来源的漂白体系，如可以与形成过酸的漂白活化剂如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐结合的过硼酸盐或过碳酸盐。可选择地，所述的漂白体系可以包含例如酰胺、二酰亚胺或砜类的过氧酸。
本发明的洗涤剂组合物中的酶可以通过诸如以下的常规稳定剂稳定多元醇如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，且所述的组合物也可以按WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制。
所述的洗涤剂还可以包含其它的常规洗涤剂成分例如织物调理剂包括黏土、增泡剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污物悬浮剂、抗污物再沉淀剂、染料、杀菌剂、光学增白剂、助溶剂、失泽抑制剂或香料。
目前认为在所述洗涤剂组合物中任何酶，特别是本发明的酶可以以相当于每升洗涤液中具有0.01-100mg酶蛋白质，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白质，特别优选每升洗涤液中具有0.1-1mg酶蛋白质的量加入。
此外，本发明的酶可以添加到如WO 97/07202所公开的洗涤剂制剂中，该文献引入本文作为参考。
通过下述的实施例对本发明进行更详细说明，这些实施例不作为对本发明请求保护范围的任何限制。
在洗涤剂组合物中，简写成分的意义如下
LAS 直链C12烷基苯磺酸钠TAS 牛油烷基硫酸钠XYASC1x-C1y烷基硫酸钠SS 式2-丁基辛酸的仲皂化表面活性剂25EY与平均为Y摩尔的环氧乙烷缩合的主要为C12-C15的直链伯醇45EY与平均为Y摩尔的环氧乙烷缩合的主要为C14-C15的直链伯醇XYEZS 每摩尔与平均Z摩尔的环氧乙烷缩合的C1x-C1y烷基硫酸钠非离子表面活性剂平均乙氧基化程度为3.8而平均丙氧基化程度为4.5的C13-C15混合的乙氧基化/丙氧基化脂肪醇，由BASF GmbH售出，商品名为PlurafaxLF404CFAAC12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺TFAAC16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺硅酸盐 无定型硅酸钠(SiO2∶Na2O比率＝2.0)NaSKS-6 分子式为δ-Na2Si2O5的晶状多层硅酸盐碳酸盐 无水碳酸钠磷酸盐 三磷酸钠MA/AA 1∶4马来酸/丙烯酸共聚物，平均分子量约为80,000聚丙烯酸平均分子量为8,000的聚丙烯酸均聚物，由BASF GmbH销售，商品名为PA30沸石A 基本颗粒大小在1-10微米范围内的分子式为Na12(AlO2SiO2)12·27 H2O的水合硅铝酸钠柠檬酸盐二水合三柠檬酸钠Citric 柠檬酸过硼酸盐无水过硼酸钠一水合物漂白剂，经验式为NaBO2·H2O2PB4 无水过硼酸钠四水合物过碳酸盐经验式为2Na2CO3·3H2O2的无水过碳酸钠漂白剂
TAED 四乙酰基乙二胺CMC羧甲基纤维素钠DETPMP 二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)，由Monsanto出售，商品名为Dequest 2060PVP聚乙烯吡咯烷酮聚合物EDDS 钠盐形式的乙二胺-N，N′-二琥珀酸[S，S]异构体抑泡剂 25％固体石蜡，熔点温度50℃，17％疏水硅石，58％石蜡油粒状抑泡剂 12％硅氧烷/硅石，18％十八烷醇，70％粒状淀粉硫酸盐 无水硫酸钠HMWPEO 高分子量聚环氧乙烷TAE 25 乙氧基(25)化牛油醇洗涤剂实施例I本发明的粒状织物清洁组合物可如下制备直链C12烷基苯磺酸钠 6.5硫酸钠 15.0沸石A26.0次氮基三乙酸钠 5.0酶 0.1PVP 0.5TAED 3.0硼酸 4.0过硼酸盐 18.0苯酚磺酸盐 0.1次要组分 补充至100％
洗涤剂实施例II本发明的致密颗粒织物清洁组合物(密度800g/l)可依照下述制备45AS 8.025E3S 2.025E5 3.025E3 3.0TFAA 2.5沸石A 17.0NaSKS-6 12.0柠檬酸3.0碳酸盐7.0MA/AA 5.0CMC 0.4酶0.1TAED 6.0过碳酸盐 22.0EDDS 0.3粒状抑泡剂3.5水/次要组分 补充至100％
洗涤剂实施例III本发明的对洗涤彩色织物特别有用的粒状织物清洁组合物可依照下述制备LAS 10.7 -TAS 2.4-TFAA- 4.045AS3.110.045E74.0-25E3S - 3.068E11 1.8 -25E5- 8.0柠檬酸盐15.0 7.0碳酸盐 - 10.0柠檬酸 2.53.0沸石A 32.1 25.0Na-SKS-6- 9.0MA/AA 5.05.0DETPMP 0.20.8酶 0.10 0.05硅酸盐 2.5-硫酸盐 5.23.0PVP 0.5-聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/ - 0.2乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物过硼酸盐1.0 -苯酚磺酸盐 0.2 -水/次要组分 补充至100％
洗涤剂实施例IV本发明的提供“洗涤过程中的柔顺处理”能力的粒状织物清洁组合物可依照下述制备45AS-10.0LAS 7.6 -68AS1.3 -45E74.0 -25E3- 5.0椰油-烷基-二甲基羟基乙基氯化铵 1.4 1.0柠檬酸盐5.0 3.0Na-SKS-6- 11.0沸石A 15.0 15.0MA/AA 4.0 4.0DETPMP 0.4 0.4过硼酸盐15.0 -过碳酸盐- 15.0TAED5.0 5.0绿土黏土10.0 10.0HMWPEO - 0.1酶 0.10 0.05硅酸盐 3.0 5.0碳酸盐 10.0 10.0粒状抑泡剂 1.0 4.0CMC 0.2 0.1水/次要组分 补充至100％
洗涤剂实施例V本发明的重垢型液体织物清洁组合物可依照下述制备酸式LAS- 25.0柠檬酸 5.0 2.0酸式25AS 8.0 -酸式25AE2S 3.0 -25AE7 8.0 -CFAA 5 -DETPMP 1.0 1.0脂肪酸 8 -油酸 - 1.0乙醇 4.0 6.0丙二醇 2.0 6.0酶 0.10 0.05椰油-烷基二甲基羟基乙基氯化铵 - 3.0绿土黏土 - 5.0PVP2.0 -水/次要组分 补充至100％粉末自动洗盘组合物I

粉末自动洗盘组合物II

粉末自动洗盘组合物III

粉末自动洗盘组合物IV

粉末自动洗盘组合物V

粉末和液体的具洗涤表面活性剂系统的洗盘组合物VI

非水性液态自动洗盘组合物VII

非水性液态洗盘组合物VIII

触变性液体自动洗盘组合物IX

液体自动洗盘组合物X

含被保护的漂白颗粒的液体自动洗盘组合物XI

XII如I、II、III、IV、VI和X所述的自动洗盘组合物，其中，由过碳酸盐替代过硼酸盐。
XIII如I-VI所述的自动洗盘组合物，其还含有锰催化剂。所述的锰催化剂可以是例如，在“用于低温漂白的高效锰催化剂”(“Efficientmanganese catalysts for low-temperature bleaching”)，自然，(1994)，369，637-639中所述的化合物中的一种。
材料和方法织物WFK10N标准织物片(卵污渍)由德国的WFK Testgewebe GmbH(Christenfeld 10，D-41379 Bruggen-Bracht)获得。
菌株枯草芽孢杆菌DN1885(Diderichsen等人，1990)。
迟缓芽孢杆菌309和147为迟缓芽孢杆菌的特定菌株，保藏在NCIB且保藏号为NCIB 10309和10147，在美国专利号3,723,250(此处引用作为参考)中进行了描述。
大肠杆菌MC 1000(M.J.Casadaban和S.N.Cohen(1980)；分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)138 179-207)通过常规方法成为r-，m+，也在美国专利申请系列号039,298中进行了描述。
质粒pJS3包含编码枯草杆菌酶309的合成基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体(Jacob Schiφdt等人在蛋白质和肽通讯(Protein and Peptideletters)339-44(1996)中描述)。
pSX222枯草芽孢杆菌表达载体(描述见WO 96/34946)。
常规的分子生物学方法除非另外指出，DNA操作和转化使用分子生物学标准方法进行(Sambrook等人，(1989)，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel，F.M.等人(编辑)“分子生物学最新方法”(“Currentprotocols in Molecular Biology”)，John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编辑)“用于芽孢杆菌的分子生物学方法”(“Molecular Biological Methods for Bacillus”)，John Wiley和Sons，1990)。
DNA操作中使用的酶按照供应商的说明书进行操作。
用于DNA操作的酶除非另外指出，所有用于DNA操作的酶如限制性内切酶、连接酶等均来自New England Biolabs，Inc。
蛋白水解活性在本发明的上下文中蛋白水解活性是用Kilo NOVO蛋白酶单位(KNPU)表示的。所述的活性相对于酶标准品(SAVINASE)而确定，所述的测定是基于在标准条件下蛋白水解酶对二甲基酪蛋白(DMC)溶液的消化进行的，所述的标准条件为50℃，pH8.3，反应时间9分钟，测定时间3分钟。需要时可向Novozymes A/S，Denmark索取AF 220/1文件夹(folder)，该文件夹特此包括在此作为参考。
GU是甘氨酸单位，定义为蛋白水解酶活性，即在标准条件下，N-乙酰基酪蛋白作为底物在40℃温育15分钟，产生相当于1毫摩尔甘氨酸的NH2-基团量。
也可以用PNA试验根据与在美国油脂化学家学会会志(Journal ofAmerican Oil Chemists Society)，Rothgeb，T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison，P.H.和Smith，L.A.，(1988)中描述的可溶性底物琥珀酰丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯基-丙氨酸-对硝基苯酚反应测定酶活性。
发酵产生枯草杆菌酶的发酵是通过将含有100ml BPX培养基的500ml带挡板的三角瓶在回转式摇床上(300转/分钟)于30℃培养5天而进行的。
因此，为了制备如2升的肉汤，同时发酵了20个三角瓶。
培养基BPX培养基组成(每升)马铃薯淀粉100g大麦粉50g大豆粉20gNa2HPO4×12H2O 9g泊洛尼克(Pluronic)0.1g酪蛋白酸钠10g培养基中的淀粉用α-淀粉酶液化，并将培养基于120℃加热灭菌45分钟。灭菌后通过加入NaHCO3至0.1M，将培养基的pH调节至9。
实施例1酶变体的构建和表达定点诱变包含特定插入并包含特定替换的本发明的枯草杆菌酶309(savinase.)定点变体通过DNA片段的常规克隆(Sambrook等人，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港，1989)制备，其中所述DNA片段通过用包含所需插入的寡聚物进行PCR而产生(见下面)。
模板质粒DNA为pJS3(见下面)，或为其包含枯草杆菌酶309的变体的类似物。
通过寡聚物定向诱变导入插入和替换来构建变体。
将枯草杆菌酶309变体转化入大肠杆菌。从这些转化体的过夜培养物中纯化的DNA通过限制性内切酶消化、DNA片段的纯化、连接、枯草芽孢杆菌的转化，从而转化入枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌的转化如Dubnau等人，1971，分子生物学杂志，56，209-221页中所述进行。
定点诱变以在特定区域导入插入和替换用于进行定点诱变的总体策略是合成对应于插入和替换位点侧翼DNA序列的诱变引物(寡核苷酸)，通过限定插入和替换的DNA碱基对区分。
接下来，所得的诱变引物用于PCR反应，模板为改变了的质粒pJS3(见上面)。纯化得到的PCR片段，并在第二轮PCR反应中延伸，纯化所得的PCR产物并在第三轮PCR反应中延伸，然后用内切酶消化，并克隆入大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体(见下面)。PCR反应在通常条件下进行。
遵循这个策略，在savinase中构建了两个插入和一个替换，其中插入分别在位置99(*99aD)和217(*217aP)导入，替换在位置S99A导入(见下面)。
在位置99处的插入和替换是通过诱变引物(5′CCG AAC CTG AACCAT CCG CGG CCC CTA GGA CTT TAA CAG C 3′(有义)(SEQ IDNO3)与反向引物(5′GAG TTA AGC CCA GAA GAT GTG GAC GCG3′(反义)(SEQ ID NO4)进行PCR反应而导入的。
所产生的PCR片段通过第二轮PCR向Savinase的C-端延伸，用引物5′CAT CGA TGT ACC GTT TGG TAA GCT GGC ATA TGT TG 3′(SEQ ID NO5)在位置217处导入插入。第二轮PCR产物用引物5′AACCGC ACA GCG TTT TTT TAT TGA TTA ACG CGT TGC3′(SEQ IDNO6)通过第三轮PCR向Savinase的C-端延伸，该引物位于pJS3中MluI位点下游。所有的PCR反应使用质粒pJS3作为模板。将从第三轮PCR得到的延伸DNA片段克隆入改变了的质粒pJS3(见上面)的Sal I-和Mlu I-位点。
通过公知的技术将质粒DNA转化入大肠杆菌，并对一个大肠杆菌菌落测序，以证实所设计的突变。
为了纯化本发明的枯草杆菌酶变体，将包含本发明变体的枯草芽孢杆菌pJS3表达质粒转化入感受态枯草芽孢杆菌菌株，并如上所述在含有10μg/ml氯霉素(CAM)的培养基中发酵。
实施例2酶变体的纯化该过程涉及到对在芽孢杆菌宿主细胞中产生本发明的枯草杆菌酶的2升规模发酵物进行纯化。
用1升的烧杯于5000转/分钟离心约1.6升发酵肉汤35分钟。用10％醋酸将上清调节至pH6.5，并通过Seitz Supra S100过滤板过滤。
用配备有Amicon SLY10 UF柱体的Amicon CH2A UF单元浓缩滤液至约400ml。离心并过滤该UF浓缩物，然后室温下吸附于pH7的杆菌肽亲和柱上。使用pH调节至7的25％异丙醇和1M氯化钠(在具有0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钙的缓冲液中)将蛋白酶从该杆菌肽柱上室温洗脱下来。
合并来自杆菌肽纯化步骤的具蛋白酶活性的级分，并加至用pH调节至6.5的含0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙的缓冲液平衡过的750ml Sephadex G25柱(直径为5cm)。
合并来自Sephadex G25柱的具蛋白水解活性的级分，并加至用pH调节至6.5的含0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙的缓冲液平衡过的150ml CM Sepharose CL 6B阳离子交换柱(直径为5cm)。
使用在2升同一缓冲液中的0-0.1M氯化钠线性梯度洗脱蛋白酶(对于枯草杆菌蛋白酶147，用0-0.2M氯化钠)。
在最后的纯化步骤中，合并来自CM Sepharose柱的含蛋白酶的级分，并在配备有GR81PP膜(来自Danish Sugar Factories Inc.)的Amicon超滤室中浓缩。
通过使用实施例1的技术来构建和发酵，并通过以上的分离步骤，产生并分离了下列枯草杆菌蛋白酶309变体L42LN+P129PAS99SD+L42LNL42LN+L217LPL42LN+S99SD+P129PAS99A+S99SD+N155NA＝S99AD+N155NAS99A+S99SD+N155ND＝S99AD+N155NDS99A+S99SD+N155NR＝S99AD+N155NRS99A+S99SD+N155NF＝S99AD+N155NFS99A+S99SD+S188SE＝S99AD+S188SES99A+S99SD+S188SD＝S99AD+S188SDS99A+S99SD+S188SK＝S99AD+S188SKS99A+S99SD+S188SL＝S99AD+S188SLS99A+S99SD+S188SA＝S99AD+S188SAS99A+S99SD+S216SP＝S99AD+S216SPS99A+S99SD+S216SDP＝S99AI+S216SDPS99A+S99SD+S216SPD＝S99AD+S216SPDS99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+S216SDS99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+S216SEL217LPL217LAL217LDPS99SD+L217LPP129PA+L217LPS99A+S99SD+L217LP＝S99AD+L217LPS99A+S99SD+L217LDP＝S99AD+L217LDPS99A+S99SD+L217LPD＝S99AD+L217LPDS99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+L217LDS99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+L217LES99A+S99SD+N218NP＝S99AD+N218NPS99A+S99SD+N218NDP＝S99AD+N218NDPS99A+S99SD+N218NPD＝S99AD+N218NPD
实施例3“标准的洗涤剂洗涤性能试验”为评估所选择的枯草杆菌酶变体在标准洗涤剂组合物中的洗涤性能，用下述的实验条件进行了标准洗涤实验洗涤剂 标准洗涤剂洗涤剂剂量4.0g/lpH10.1洗涤时间 20分钟温度30℃水硬度 15°dH酶浓度 10nm(在洗涤剂溶液中)测试系统10ml烧杯和搅拌棒织物/体积 5件织物(2.5cm)/50ml洗涤剂溶液测试材料WFK10N(卵污渍)所述的标准洗涤剂的组成如下6.2％LAS(Nansa 80S)2％ C16-C18脂肪酸钠盐4％ 非离子表面活性剂(Plurafax LF404)22％ 沸石P10.5％ Na2CO34％ Na2Si2O52％ 羧甲基纤维素(CMC)6.8％丙烯酸液体CP5 40％20％ 过硼酸钠(经验式NaBO2·H2O2)0.2％EDTA21％ Na2SO4水(平衡量)
通过添加HCl或NaOH将洗涤剂溶液的pH调节到10.1。通过向测试系统中添加CaCl2和MgCl2(Ca2+∶Mg2+＝4∶1)将水硬度调节到15°dH。洗涤后织物用自来水冲洗并于空气中干燥。
对试验材料的反射能力(R变体)的测定是用Macbeth ColorEye 7000光度计(Macbeth，Division of Kollmorgen Instruments Corporation，德国)在460nm下进行的。测定按照制造商的方法进行。
为确定空白值，进行了不添加酶的类似洗涤实验。接下来如上述进行反射能力(R空白)的测定。
然后如上所述进行参考实验，其中测定了亲本酶的洗涤性能。接下来，如上所述测定了反射能力(R亲本)。
洗涤性能用下述公式定义的性能因子(P)进行评估P＝(R变体-R空白)-(R亲本-R空白)＝R变体-R亲本实施例4″卵抑制测定″如下抑制试验基于的原理是待试验的枯草杆菌酶变体将催化肽-pNA键的水解，因此释放黄色的pNA，其在405nm处可方便地检测。在一段给定的时间后释放的pNA量为对枯草杆菌酶活性的直接测定值。分别在存在或不存在抑制剂时实施此水解实验，可获得特定枯草杆菌酶变体被抑制程度的定量测定值。
反应条件酶浓度 0.0003mg/mlIV-0类胰蛋白酶抑制剂的浓度 0.0015mg/ml起始底物浓度 0.81mM反应时间 11分钟试验温度 25℃试验pH 8.6吸光度的测定波长在 405nm
试验溶液底物溶液(2mM)将500mg Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA溶于4mlDMSO(200mM)。用下述缓冲液将该溶液稀释100倍。在所得底物溶液中底物浓度为2mM。
抑制剂溶液(0.005mg/ml)将5mg IV-0类胰蛋白酶抑制剂(SigmaT-1886)溶于10ml水。用下述缓冲液将该溶液稀释100倍。在所得抑制剂溶液中抑制剂浓度为0.005mg/ml。
酶溶液(0.001mg/ml)将1mg酶溶于10ml水。用下述缓冲液将该溶液稀释100倍。在所得酶溶液中酶浓度为0.001mg/ml。
缓冲液(pH8.6)将15.7mg Tris溶于适量水中，并加入0.75ml 30％(w/v)BRIJ(BRIJ 35聚氧乙烯十二烷基醚，30％(w/v)，Sigma目录号430AG-6)。用4M NaOH将pH调节至8.6，并用水稀释该溶液至1升。
存在抑制剂的试验将1体积单位(如80μl)抑制剂溶液与1体积单位(如80μl)酶溶液在合适的反应容器(如分光光度计小室或微滴定板)中混合，并在25℃平衡15分钟。向该反应容器中加入1.375体积单位(如110μl)底物溶液，此后于405nm处测定吸光度11分钟(如每10秒或每30秒测定一次)。用线性回归分析计算吸光度曲线的斜率。吸光度曲线的斜率表示为α抑制剂。
不存在抑制剂的试验将1体积单位(如80μl)缓冲液与1体积单位(如80μl)酶溶液在合适的反应容器(如分光光度计小室或微滴定板)中混合，并在25℃平衡15分钟。向该反应容器中加入1.375体积单位(如110μl)底物溶液，此后于405nm处测定吸光度11分钟(如每10秒或每30秒测定一次)。用线性回归分析计算吸光度曲线的斜率。吸光度曲线的斜率表示为α。
空白将1体积单位(如80μl)抑制剂溶液与1体积单位(如80μl)缓冲液在合适的反应容器(如分光光度计小室或微滴定板)中混合，并在25℃平衡15分钟。向该反应容器中加入1.375体积单位(如110μl)底物溶液，此后于405nm处测定吸光度15分钟。这些测定值不用于计算，仅用作对照，即缓冲液和/或底物溶液中没加入酶的情况。
剩余活性(RA)的计算根据下列公式计算酶剩余活性(RA)RA＝(α抑制剂/α)×100％用上述试验获得了下列结果

序 列 表<110> 诺和酶股份有限公司(Novozymes A/S)<120> 枯草杆菌酶变体<130> 10081.204-WO<140>
<141>
<160> 8<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 5<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述命名法举例<400> 1Ala Gly Lys Ala Leu1 5<210> 2<211> 4<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述命名法举例<400> 2Ala Gly Gly Leu1<210> 3<211> 40<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述有义引物<400> 3ccgaacctga accatccgcg gcccctagga ctttaacagc 40<210> 4<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述反义引物<400> 4gagttaagcc cagaagatgt ggacgcg 27<210> 5<211> 35<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物<400> 5catcgatgta ccgtttggta agctggcata tgttg 35<210> 6<211> 36<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物<400> 6aaccgcacag cgttttttta ttgattaacg cgttgc36<210> 7
<211> 275<212> PRT<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) (枯草杆菌蛋白酶BPN′)<400> 7Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala35 40 45Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu85 90 95Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu100 105 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly115 120 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala130 135 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145 150 155 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val180 185 190Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr195 200 205Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser
210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225 230 235 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys245 250 255Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala260 265 270Ala Ala Gln275<210> 8<211> 269<212> PRT<213> 迟缓芽孢杆菌(B.Lentus)(枯草杆菌蛋白酶309)<400> 8Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala1 5 10 15His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp20 25 30Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser35 40 45Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr50 55 60His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu65 70 75 80Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala85 90 95Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala100 105 110Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly130 135 140Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser145 150 155 160Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln165 170 175Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile180 185 190Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr195 200 205Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala210 215 220Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile225 230 235 240Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu245 250 255Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg260 26权利要求
1.选自以下的枯草杆菌酶变体在位置42和43之间(BASBPN编号)包含至少一个额外氨基酸残基的插入的枯草杆菌酶变体；在位置51和56之间(BASBPN编号)包含至少一个额外氨基酸残基的插入的枯草杆菌酶变体；在位置155和161之间(BASBPN编号)包含至少一个额外氨基酸残基的插入的枯草杆菌酶变体；在位置187和190之间(BASBPN编号)包含至少一个额外氨基酸残基的插入的枯草杆菌酶变体；在位置216和217之间(BASBPN编号)包含至少一个额外氨基酸残基的插入的枯草杆菌酶变体；在位置217和218之间(BASBPN编号)包含至少一个额外氨基酸残基的插入的枯草杆菌酶变体；在位置218和219之间(BASBPN编号)包含至少一个额外氨基酸残基的插入的枯草杆菌酶变体。
2.根据权利要求1的变体，其中所述插入选自在位置51和52之间的插入、在位置52和53之间的插入、在位置53和54之间的插入、在位置54和55之间的插入、在位置55和56之间的插入(BASBPN编号)。
3.根据权利要求1的变体，其中所述插入选自在位置155和156之间的插入、在位置156和157之间的插入、在位置157和158之间的插入、在位置158和159之间的插入、在位置159和160之间的插入、在位置160和161之间的插入(BASBPN编号)。
4.根据权利要求1的变体，其中所述插入选自在位置187和188之间的插入、在位置188和189之间的插入、以及在位置189和190之间的插入(BASBPN编号)。
5.根据前面的权利要求中任意一项所述的变体，其中，当在本说明书实施例4中公开的“卵抑制测定”中测试时变体具有至少10％的剩余活性。
6.根据权利要求5的变体，其中变体具有至少15％、优选地至少20％、更优选地至少25％的剩余活性。
7.根据前面的权利要求中任意一项所述的变体，其中变体在所述位置之间包含一个以上的插入。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的变体，其中变体在不同的上述位置组之间包含两个或多个插入。
9.根据权利要求8的变体，其中变体在每一所述位置组之间包含两个以上的插入。
10.根据前面的权利要求中任意一项所述的变体，其中变体包含至少一个其它的修饰。
11.根据权利要求10的变体，其中修饰为替换。
12.根据权利要求1的变体，其中所述插入选自X42XA，X42XT，X42XG，X42XS，X42XD，X42XE，X42XK，X42XR，X42XH，X42XV，X42XC，X42XN，X42XQ，X42XF，X42XI，X42XL，X42XM，X42XP，X42XW和X42XY。
13.根据权利要求2的变体，其中所述插入选自X51XA，X51XT，X51XG，X51XS，X51XD，X51XE，X51XK，X51XR，X51XH，X51XV，X51XC，X51XN，X51XQ，X51XF，X51XI，X51XL，X51XM，X51XP，X51XW和X51XY。
14.根据权利要求2的变体，其中所述插入选自X52XA，X52XT，X52XG，X52XS，X52XD，X52XE，X52XK，X52XR，X52XH，X52XV，X52XC，X52XN，X52XQ，X52XF，X52XI，X52XL，X52XM，X52XP，X52XW和X52XY。
15.根据权利要求2的变体，其中所述插入选自X53XA，X53XT，X53XG，X53XS，X53XD，X53XE，X53XK，X53XR，X53XH，X53XV，X53XC，X53XN，X53XQ，X53XF，X53XI，X53XL，X53XM，X53XP，X53XW和X53XY。
16.根据权利要求2的变体，其中所述插入选自X54XA，X54XT，X54XG，X54XS，X54XD，X54XE，X54XK，X54XR，X54XH，X54XV，X54XC，X54XN，X54XQ，X54XF，X54XI，X54XL，X54XM，X54XP，X54XW和X54XY。
17.根据权利要求2的变体，其中所述插入选自X55XA，X55XT，X55XG，X55XS，X55XD，X55XE，X55XK，X55XR，X55XH，X55XV，X55XC，X55XN，X55XQ，X55XF，X55XI，X55XL，X55XM，X55XP，X55XW和X55XY。
18.根据权利要求3的变体，其中所述插入选自X155XA，X155XT，X155XG，X155XS，X155XD，X155XE，X155XK，X155XR，X155XH，X155XV，X155XC，X155XN，X155XQ，X155XF，X155XI，X155XL，X155XM，X155XP，X155XW和X155XY。
19.根据权利要求3的变体，其中所述插入选自X156XA，X156XT，X156XG，X156XS，X156XD，X156XE，X156XK，X156XR，X156XH，X156XV，X156XC，X156XN，X156XQ，X156XF，X156XI，X156XL，X156XM，X156XP，X156XW和X156XY。
20.根据权利要求3的变体，其中所述插入选自X157XA，X157XT，X157XG，X157XS，X157XD，X157XE，X157XK，X157XR，X157XH，X157XV，X157XC，X157XN，X157XQ，X157XF，X157XI，X157XL，X157XM，X157XP，X157XW和X157XY。
21.根据权利要求3的变体，其中所述插入选自X158XA，X158XT，X158XG，X158XS，X158XD，X158XE，X158XK，X158XR，X158XH，X158XV，X158XC，X158XN，X158XQ，X158XF，X158XI，X158XL，X158XM，X158XP，X158XW和X158XY。
22.根据权利要求3的变体，其中所述插入选自X159XA，X159XT，X159XG，X159XS，X159XD，X159XE，X159XK，X159XR，X159XH，X159XV，X159XC，X159XN，X159XQ，X159XF，X159XI，X159XI，X159XM，X159XP，X159XW和X159XY。
23.根据权利要求3的变体，其中所述插入选自X160XA，X160XT，X160XG，X160XS，X160XD，X160XE，X160XK，X160XR，X160XH，X160XV，X160XC，X160XN，X160XQ，X160XF，X160XI，X160XL，X160XM，X160XP，X160XW和X160XY。
24.根据权利要求4的变体，其中所述插入选自X187XA，X187XT，X187XG，X187XS，X187XD，X187XE，X187XK，X187XR，X187XH，X187XV，X187XC，X187XN，X187XQ，X187XF，X187XI，X187XL，X187XM，X187XP，X187XW和X187XY。
25.根据权利要求4的变体，其中所述插入选自X188XA，X188XT，X188XG，X188XS，X188XD，X188XE，X188XK，X188XR，X188XH，X188XV，X188XC，X188XN，X188XQ，X188XF，X188XI，X188XL，X188XM，X188XP，X188XW和X188XY。
26.根据权利要求4的变体，其中所述插入选自X189XA，X189XT，X189XG，X189XS，X189XD，X189XE，X189XK，X189XR，X189XH，X189XV，X189XC，X189XN，X189XQ，X189XF，X189XI，X189XL，X189XM，X189XP，X189XW和X189XY。
27.根据权利要求1的变体，其中所述插入选自X216XA，X216XT，X216XG，X216XS，X216XD，X216XE，X216XK，X216XR，X216XH，X216XV，X216XC，X216XN，X216XQ，X216XF，X216XI，X216XL，X216XM，X216XP，X216XW和X216XY。
28.根据权利要求1的变体，其中所述插入选自X217XA，X217XT，X217XG，X217XS，X217XD，X217XE，X217XK，X217XR，X217XH，X217XV，X217XC，X217XN，X217XQ，X217XF，X217XI，X217XI，X217XM，X217XP，X217XW和X217XY。
29.根据权利要求1的变体，其中所述插入选自X218XA，X218XT，X218XG，X218XS，X218XD，X218XE，X218XK，X218XR，X218XH，X218XV，X218XC，X218XN，X218XQ，X218XF，X218XI，X218XL，X218XM，X218XP，X218XW和X218XY。
30.根据前面的权利要求中任意一项所述的变体，其中亲本枯草杆菌酶属于亚组I-S1。
31.根据权利要求30的变体，其中亲本枯草杆菌酶选自BSS168，BSSAS，BSAPRJ，BSAPRN，BMSAMP，BASBPN，BSSDY，BLSCAR BLKERA，BLSCA1，BLSCA2，BLSCA3，BSSPRC和BSSPRD，或它们的保留了亚组I-S1特性的功能性变体。
32.根据权利要求1-29中任意一项所述的变体，其中亲本枯草杆菌酶属于亚组I-S2。
33.根据权利要求32的变体，其中亲本枯草杆菌酶选自BSAPRQ，BLS147，BSAPRM，BAH101，BLSAVI(BLS309)，BSKSMK，BAALKP(BAPB92)，BLSUBL，BSEYAB，TVTHER和BSAPRS，或它们的保留了亚组I-S2特性的功能性变体。
34.根据权利要求33的变体，其中亲本枯草杆菌酶为BLSAVI(Savinase)。
35.根据权利要求32-34中任意一项所述的变体，其中变体还包含至少一个在下列位置处的修饰27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、129、131、132、133、143、159、167、170、192、194、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252或274(BASBPN编号)。
36.根据权利要求35的变体，其中变体还包含修饰S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K。
37.根据权利要求32-36中任意一项所述的变体，其中变体还在位置95至103(BASBPN编号)的活性位点环(b)区域中包含至少一个额外的氨基酸残基。
38.分离的多核苷酸，其具有编码如权利要求1-37中任意一项所定义的枯草杆菌酶变体的DNA序列。
39.包含权利要求38的分离的多核苷酸的表达载体。
40.用权利要求39的表达载体转化的微生物宿主细胞。
41.根据权利要求40的微生物宿主细胞，其为细菌，优选地为芽孢杆菌，尤其为迟缓芽孢杆菌。
42.根据权利要求40的微生物宿主细胞，其为真菌或酵母，优选地为丝状真菌，尤其为曲霉(Aspergillus)。
43.用于产生如权利要求1-37中任意一项所定义的枯草杆菌酶变体的方法，其中，在有益于变体表达和分泌的条件下培养如权利要求40-42中任意一项所定义的宿主，以及回收变体。
44.一种清洁或洗涤剂组合物，优选地为洗衣或洗盘组合物，所述组合物包含如权利要求1-37中任意一项所定义的变体。
45.根据权利要求44的组合物，其还包含纤维素酶、脂肪酶、角质酶、氧化还原酶、其它蛋白酶、淀粉酶或它们的混合物。
46.如权利要求1-37中任意一项所定义的变体在洗衣和/或洗盘洗涤剂中的用途。
47.一种除去硬表面或衣物上的卵污渍的方法，所述方法包括使含卵污渍的硬表面或含卵污渍的衣物与清洁或洗涤剂组合物，优选地与洗衣或洗盘组合物接触，其中所述组合物包含如权利要求1-37中任意一项所定义的枯草杆菌酶变体。
48.根据权利要求47的方法，其中组合物另外还包含纤维素酶、脂肪酶、角质酶、氧化还原酶、其它蛋白酶、淀粉酶或它们的混合物。
49.清洁或洗涤剂组合物用于从衣物或硬表面上除去卵污渍的用途，其中，所述组合物优选地为洗衣或洗盘组合物，并且所述组合物包含如权利要求1-37中任意一项所定义的枯草杆菌酶变体。
50.根据权利要求49的用途，其中组合物另外还包含纤维素酶、脂肪酶、角质酶、氧化还原酶、其它蛋白酶、淀粉酶或它们的混合物。
全文摘要
本发明公开了存在于卵中的物质如IV－0类胰蛋白酶抑制剂对其的抑制作用具有降低趋势的新枯草杆菌酶(subtilase)变体。具体地说，公开了在位置42－43，51－56，155－161，187－190，216－217，217－218或218－219(BASBPN编号)之间包含至少一个额外的氨基酸残基的变体。这些枯草杆菌酶变体当用于如清洁或洗涤剂组合物，诸如洗衣组合物和洗盘组合物，包括自动洗盘组合物中时，表现出优良的或改进的卵污渍洗涤性能。本发明也公开了编码变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞以及产生和使用本发明变体的方法。进一步地，还公开了包含变体的清洁和洗涤剂组合物。
文档编号C12N1/21GK1592784SQ01817275
公开日2005年3月9日 申请日期2001年10月12日 优先权日2000年10月13日
发明者M·内勒高-马森, L·B·拉森, P·K·汉森 申请人:诺和酶股份有限公司