专利名称：具有改变的免疫原性的枯草杆菌酶和枯草杆菌酶变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有改变了的免疫原性的枯草杆菌酶(subtilase)和枯草杆菌酶变体及其用途，还涉及产生所说枯草杆菌酶和枯草杆菌酶变体的方法。
背景技术：
包括酶在内的越来越多蛋白质正在通过工业化方式生产并用于各种工业、家务管理和医药中。作为蛋白质，它们很可能刺激人和动物体内的免疫反应，如变态反应。
已进行了各种尝试以改变蛋白质的免疫原性。通常这种改变只局限于蛋白质中负责诱导免疫反应的部分，即，表位。表位由多个氨基酸组成，这些氨基酸在一级序列中可以是连续的，但更常见的是在蛋白质的三维结构中相互间处于邻近的位置。已发现在表位中的小变化就可能影响它与抗体的结合。这可能导致该表位的重要性降低，可能将其从高亲合力表位转变成低亲合力表位，或甚至可能导致表位的丢失，即，该表位不足以结合抗体从而引起免疫反应。
改变蛋白质免疫原性的另一种方法是通过如往蛋白质中添加PEG等化合物“掩盖表位”。
文献WO 00/26230和WO 01/83559公布了选择与亲本蛋白质相比免疫原性降低的蛋白质变体的两种不同方法。
文献WO 99/38978公布了通过修饰IgE结合位点来修饰变应原使其变应原性降低的方法。
文献WO 99/53038公布了在人体内具有较低变应原反应的突变蛋白质和构建、鉴别和生产这些蛋白质的方法。
枯草杆菌酶普遍应用于洗涤剂工业中，是潜在地可能引起变态反应等免疫反应的一组酶。因此持继需要具有改变的免疫原性(尤其是具有降低的变应原性)且同时仍保留了其应用时所必需的酶促活性的枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体。
文献WO 00/22103公布了免疫反应减少的多肽，而文献WO 01/83559公布了免疫原性已被修饰的蛋白质变体。
发明概述本发明的第一方面涉及枯草杆菌酶变体，其中第57位和以下三个位置中的至少一个被修饰170、181和247。
本发明的第二方面涉及SEQ ID NO.1的枯草杆菌酶，，其中第3位的Xaa残基是S或T，第4位是V或I，第27位是K或R，第55位是G、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，第74位是N或D，第85位是S或N，第97位是S或D，第99位是S、G或R，第101位是S或A，第102位是V、N、Y或I，第121位是N或S，第157位是G、D或S，第188位是A或P，第193位是V或M，第199位是V或I，第211位是L或D，第216位是M或S，第226位是A或V，第230位是Q或H，第239位是Q或R，第242位是N或D，第246位是N或K，第268位是T或A，而且其中第164、175和241位的Xaa残基是以下组合之一a)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失；或b)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失；或c)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W或缺失。
本发明的第三方面涉及编码本发明枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体的DNA序列。
本发明的第四方面涉及含有所说DNA序列的载体。
本发明的第五方面涉及含有所说载体的宿主细胞。
本发明的第六方面涉及含有本发明枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体的组合物。
定义术语“枯草杆菌酶”在本发明的上下文中应理解为如下文献所述的丝氨酸蛋白酶亚类Siezen等，Protein Engng.4(1991)719-737和Siezen等，Protein Science 6(1997)501-523。
术语“亲本”在本发明的上下文中理解为修饰后产生蛋白质变体的蛋白质。亲本蛋白质可以是天然存在的(野生型)多肽或可以是通过任何适当方法制备的其变体。例如，亲本蛋白质可以是已通过以下修饰改变的天然存在蛋白质的变体天然存在的多肽中一个或多个氨基酸残基的替代、化学修饰、缺失或截短，或将一个或多个氨基酸残基添加或插入天然多肽的氨基酸序列中。因此术语“亲本枯草杆菌酶”指为了产生枯草杆菌酶变体而可以进行修饰的枯草杆菌酶。
术语“变体”在本发明的上下文中应理解为与亲本蛋白质相比在一个或多个氨基酸残基位置已被修饰的蛋白质。
术语“修饰”或“已修饰”在本发明的上下文中应理解为包括对蛋白质的化学修饰以及对编码蛋白质的DNA的遗传操作。修饰可以是在目的氨基酸内或目的氨基酸位置进行氨基酸侧链的置换、氨基酸的替代、缺失和/或插入。因此术语“(已)修饰的蛋白质”，如“(已)修饰的枯草杆菌酶”应理解为与亲本蛋白质相比含有修饰的蛋白质。
术语“位置”在本发明的上下文中应理解为是蛋白质中从N-末端氨基酸开始的编号。本发明中所用的位置编号指来自淀粉液化芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶Novo(BPN’)的位置。不过，其它枯草杆菌酶也在本发明的范围内。用GAP软件通过与来自淀粉液化芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶Novo(BPN’)进行序列比对，可以确定其它枯草杆菌酶的相应位置。GAP提供于GCG软件包中(用于Wisconsin软件包的软件手册(Program Manual forWisconsin Package)，第8版，1994年8月，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-45)。除非特别说明，本发明中所提及的位置以BPN’编号给出，且可通过序列比对(alignment)转换。
术语“蛋白质”在本发明的上下文中意指包括寡肽、多肽以及蛋白质等等。
术语“缺失”或“已缺失”，涉及某位置或某氨基酸时，在本发明的上下文中指在此特定位置处的氨基酸已被删除或缺失。
术语“插入”或“已插入”，涉及某位置或某氨基酸时，在本发明的上下文中指于此特定位置的氨基酸之后已插入一个或多个氨基酸，如1-5个氨基酸，或存在一个或多个氨基酸，如1-5个氨基酸。
术语“替代”或“已替代”，涉及某位置或氨基酸时，在本发明的上下文中指在此特定位置的氨基酸已被另一氨基酸代替或出现了与指定蛋白质(如蛋白质序列)中某一氨基酸不同的氨基酸。
缩写词SEQ ID NO.1’
术语SEQ ID NO.1’在本发明上下文中用作根据SEQ ID NO.1的序列的缩写，其中的Xaa残基在第3位是S或T，在第4位是V或I，在第27位是K或R，在第55位是G、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，在第74位是N或D，在第85位是S或N，在第97位是S或D，在第99位是S、G或R，在第101位是S或A，在第102位是V、N、Y或I，在第121位是N或S，在第157位是G、D或S，在第188位是A或P，在第193位是V或M，在第199位是V或I，在第211位是L或D，在第216位是M或S，在第226位是A或V，在第230位是Q或H，在第239位是Q或R，在第242位是N或D，在第246位是N或K，在第268位是T或A，且其中第164、175和241位的Xaa残基是以下组合之一a)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失；或b)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失；或c)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W或缺失。
氨基酸使用了众所周知的三字母和单字母氨基酸缩写(参阅，如Creighton TE(1993)，蛋白质；结构和分子特性(Proteins；Structures and MolecularProperties)，第2版，W.H.Freeman and Company，
图1.1，第3页)。缩写“X”或“Xaa”用于指任何氨基酸。本发明上下文中的缩写“aa”用于指“氨基酸”。
变体为了描述氨基酸的缺失、插入和/或替代，本发明中使用了以下命名法原始氨基酸、位点、缺失/插入/替代的氨基酸由此用谷氨酸替代第195位的甘氨酸被标示为Gly195Glu或G195E
在同一位置处甘氨酸的缺失是Gly195*或G195*而另外插入一个氨基酸残基，如赖氨酸，则是Gly195GlyLys或G195GK在指出了与编号所用序列相比而言的缺失时，在这一位置的插入表示为*36Asp或*36D指在第36位插入了天冬氨酸。
多个突变用加号分开，即Arg170Tyr+Gly195Glu或R170Y+G195E表示在第170和195位的突变，即酪氨酸和谷氨酸分别替代了精氨酸和甘氨酸。
发明详述本发明的枯草杆菌酶变体和枯草杆菌酶本发明涉及枯草杆菌酶变体，其中第57位以及第170、181和247这三个位置中的至少一个被修饰，本发明还涉及SEQ ID NO.1’的枯草杆菌酶。本发明的发明人已发现所说的枯草杆菌酶变体和枯草杆菌酶分别具有与亲本枯草杆菌酶和Savinase相比改变了的免疫原性。
本发明枯草杆菌酶变体第57、170、181和/或247位氨基酸的修饰可通过对编码亲本枯草杆菌酶的DNA的遗传处理或通过例如对氨基酸侧链的化学修饰进行。具体而言，所说的位置可以通过对编码亲本枯草杆菌酶的DNA进行遗传处理，如通过缺失、插入或替代进行修饰。插入通常可以包括插入1-5个氨基酸，如1、2、3、4或5个氨基酸。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明枯草杆菌酶变体中的第57、170、181和/或247位可通过替代进行修饰。具体而言，第57、170、181和/或247位氨基酸的替代可以包括替代成不同大小、亲水性和/或极性的氨基酸，如小氨基酸相对于大氨基酸、亲水性氨基酸相对于疏水性氨基酸、极性氨基酸相对于非极性氨基酸以及碱性氨基酸相对于酸性氨基酸，因为这些类型的替代常常改变免疫原性。所述替代还可包括替代成适于化学修饰的氨基酸，如替代成赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或半胱氨酸(C)。更具体而言，第57位氨基酸(aa)残基可被替代成以下残基之一P、K、L、A、W、R、H、C、D、I；第170位氨基酸残基可以被修饰成以下残基之一C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H；第181位氨基酸残基可以被修饰成以下残基之一A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W；以及/或第247位的氨基酸残基可以被修饰成以下残基之一A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y。
例如本发明的枯草杆菌酶变体可以是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H，或可以是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W，或可以是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y，或可以是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y，或可以是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y。
尤其是，本发明的枯草杆菌酶变体可以是以下之一X57P+X170F、X57P+X170L、X57P+X181N、X57P+X247E、X57P+X247H、X57P+X247K、X57P+X247Q、X57P+X170F+X247E、X57P+X170F+X247H、X57P+X170F+X247K、X57P+X170F+X247Q、X57P+X170L+X247E、X57P+X170L+X247H、X57P+X170L+X247K、X57P+X170L+X247Q、X57P+X181N+X247E、X57P+X181N+X247H、X57P+X181N+X247K、X57P+X181N+X247Q，X57P+X170L，更尤其是X57P+X170L+X247Q。
在一个具体实施方案中本发明枯草杆菌酶变体可进一步包含在以下位置之一的替代、插入或缺失1、3、4、27、36、76、87、97、98、99、100、101、103、104、120、123、159、160、166、167、169、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252、274。具体而言，这些修饰可以是以下的一种或多种X1G、X3T、X4I、X27L、X27R、X36*、X76D、X87N、X99D、X101G、X101R、X103A、X104I、X104N、X104Y、X120D、X123S、X159D、X160S、X167A、X170S、X194P、X195E、X199M、X205I、X217D、X217L、X218S、X222S、X222A、X232V、X235L、X236H、X245R、X248D、X252K、X274A。
在另一实施方案中本发明枯草杆菌酶变体可进一步在环区包括插入，即，在第33-43、95-103、125-132、153-173、181-195、202-204或218-219位的一个或多个区域中插入。
本发明还涉及SEQ ID NO.1’的枯草杆菌酶。在本发明的一个实施方案中它可以是SEQ ID NO.1’的枯草杆菌酶，其中第55、164、175和/或241位的Xaa被缺失或含有插入，如1-5个氨基酸的插入，如1、2、3、4或5个氨基酸的插入。在第55、164、175和/或241位的Xaa还可以是适于化学修饰的氨基酸，如赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或半胱氨酸(C)。
在另一实施方案中第55位Xaa可以是残基G、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W之一，以及/或第164位Xaa可以是残基C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H之一，以及/或第175位Xaa可以是残基A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W之一，以及/或第241位Xaa可以是残基A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y之一。第55位Xaa尤其可以是残基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一。
例如，第55位Xaa可以是残基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一且第164位Xaa可以是残基C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H之一，或者是第55位Xaa可以是残基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一且第175位Xaa可以是残基A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W之一，或者第55位Xaa可以是残基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一且第241位Xaa可以是残基A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y之一。
更尤其是，第55位Xaa可以是残基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一且第164位Xaa可以是残基C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H之一且第241位Xaa可以是残基A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y之一，或者是第55位Xaa可以是残基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一且第175位Xaa可以是残基A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W之一且第241位Xaa可以是残基A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y之一。
本发明的枯草杆菌酶还可以是SEQ ID NO.1’的枯草杆菌酶，其中第3、4、27、74、85、97、99、101、102、121、157、188、193、199、211、216、226、230、239、242、246和268位的Xaa组合可以是以下组合之一i)在第3位是S，在第4位是V，在第27位是K，在第74位是N，在第85位是S，在第97位是S，在第99位是S，在第101位是S，在第102位是V，在第121位是N，在第157位是G，在第188位是A，在第193位是V，在第199位是V，在第211位是L，在第216位是M，在第226位是A，在第230位是Q，在第239位是Q，在第242位是N，在第246位是N，在第268位是T；或ii)在第3位是S，在第4位是V，在第27位是K，在第74位是N，在第85位是N，在第97位是S，在第99位是G，在第101位是S，在第102位是N，在第121位是N，在第157位是G，在第188位是A，在第193位是V，在第199位是V，在第211位是L，在第216位是M，在第226位是A，在第230位是Q，在第239位是Q，在第242位是N，在第246位是N，在第268位是T；或iii)在第3位是S，在第4位是V，在第27位是K，在第74位是N，在第85位是N，在第97位是S，在第99位是S，在第101位是S，在第102位是V，在第121位是N，在第157位是G，在第188位是A，在第193位是V，在第199位是V，在第211位是L，在第216位是S，在第226位是A，在第230位是Q，在第239位是Q，在第242位是N，在第246位是N，在第268位是T；或iv)在第3位是S，在第4位是V，在第27位是R，在第74位是N，在第85位是S，在第97位是S，在第99位是S，在第101位是S，在第102位是Y，在第121位是S，在第157位是G，在第188位是A，在第193位是V，在第199位是V，在第211位是L，在第216位是M，在第226位是A，在第230位是Q，在第239位是Q，在第242位是N，在第246位是N，在第268位是A；或v)在第3位是S，在第4位是V，在第27位是K，在第74位是D，在第85位是S，在第97位是S，在第99位是S，在第101位是A，在第102位是I，在第121位是N，在第157位是G，在第188位是A，在第193位是V，在第199位是V，在第211位是L，在第216位是M，在第226位是A，在第230位是Q，在第239位是Q，在第242位是N，在第246位是N，在第268位是T；或vi)在第3位是S，在第4位是V，在第27位是K，在第74位是N，在第85位是S，在第97位是S，在第99位是G，在第101位是A，在第102位是I，在第121位是N，在第157位是D，在第188位是A，在第193位是V，在第199位是V，在第211位是L，在第216位是M，在第226位是V，在第230位是H，在第239位是R，在第242位是D，在第246位是K，在第268位是T；或vii)在第3位是S，在第4位是V，在第27位是K，在第74位是N，在第85位是S，在第97位是D，在第99位是R，在第101位是A，在第102位是I，在第121位是N，在第157位是S，在第188位是A，在第193位是V，在第199位是V，在第211位是L，在第216位是S，在第226位是A，在第230位是Q，在第239位是Q，在第242位是N，在第246位是N，在第268位是T；或viii)在第3位是T，在第4位是I，在第27位是K，在第74位是N，在第85位是S，在第97位是S，在第99位是S，在第101位是S，在第102位是V，在第121位是N，在第157位是G，在第188位是P，在第193位是M，在第199位是I，在第211位是D，在第216位是M，在第226位是A，在第230位是Q，在第239位是Q，在第242位是N，在第246位是N，在第268位是T；或
ix)在第3位是T，在第4位是I，在第27位是K，在第74位是N，在第85位是S，在第97位是S，在第99位是S，在第101位是S，在第102位是V，在第121位是N，在第157位是G，在第188位是A，在第193位是M，在第199位是I，在第211位是D，在第216位是M，在第226位是A，在第230位是Q，在第239位是Q，在第242位是N，在第246位是N，在第268位是T；或x)在第3位是T，在第4位是I，在第27位是K，在第74位是N，在第85位是S，在第97位是S，在第99位是S，在第101位是S，在第102位是V，在第121位是N，在第157位是G，在第188位是A，在第193位是V，在第199位是I，在第211位是L，在第216位是M，在第226位是A，在第230位是Q，在第239位是Q，在第242位是N，在第246位是N，在第268位是T。
本发明的枯草杆菌酶还可以在以下一个或多个位置中包含替代、插入或缺失1、35、95、96、98、118、158、161、163、164、189、212和229。这些修饰的例子包括X1G、X27L、I35ID、X74D、X118D、A158AS、X161A、X164S、X189E、X212S和X229L。
在本发明一个实施方案中本发明的枯草杆菌酶还可包括在环区的插入，即，在第33-42、93-101、123-130、151-167、175-189、196-198或212-213位的一个或多个区域中的插入。
枯草杆菌酶如上所述，依照文献Siezen等，Protein Engng.4(1991)719-737和Siezen等，Protein Science 6(1997)501-523，枯草杆菌酶组成了丝氨酸蛋白酶的一个亚类。通过以前被称为枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的170多种丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列的同源性分析定义了枯草杆菌酶。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、Thermitase家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。枯草杆菌蛋白酶家族可进一步划分成3个亚组，即，I-S1(“真正的”枯草杆菌蛋白酶)、I-S2(高碱性蛋白酶)和细胞内枯草杆菌蛋白酶。不过，酶的定义或分类是可以变化或改变的，在本发明的上下文中，以上将枯草杆菌酶分为亚部或亚组的划分应按文献所述进行理解Siezen等，Protein Engng.4(1991)719-737和Siezen等，Protein Science 6(1997)501-523。
本发明的枯草杆菌酶变体是通过修饰亲本枯草杆菌酶而获得的。
亲本枯草杆菌酶和/或本发明的枯草杆菌酶可以是分离自天然来源的枯草杆菌酶，即，野生型枯草杆菌酶，或者可以是分离自天然来源且随后在保留枯草杆菌酶特征的同时已进行了修饰的枯草杆菌酶。可以是亲本枯草杆菌酶的这些枯草杆菌酶变体的例子包括以下文献中所公布的那些EP130.756、EP214.435、WO87/04461、WO87/05050、EP251.446、EP260.105、WO88/08028、WO88/08033、WO89/06279、WO9I/00345、EP525610和WO94/02618。在另一实施方案中，亲本枯草杆菌酶可以是通过DNA改组技术，如文献J.E.Ness等，Nature Biotechnology17，893-896(1999)中所述的技术制备的枯草杆菌酶。此外，还可通过人为产生多样性的标准技术，如对不同枯草杆菌酶基因进行DNA改组(WO 95/22625；Stemmer WPC，Nature 370389-91(1994))，构建亲本枯草杆菌酶。例如，可以通过DNA改组，例如将编码Savinase的基因与从自然界中鉴别到的一个或多个部分枯草杆菌酶序列进行DNA改组来构建亲本枯草杆菌酶。
亲本枯草杆菌酶和/或本发明的枯草杆菌酶尤其可以是枯草杆菌蛋白酶，更尤其是属于I-S1或I-S2组的枯草杆菌蛋白酶。I-S1型枯草杆菌酶的例子包括枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶amylosaccharitus、枯草杆菌蛋白酶168、枯草杆菌蛋白酶肠系膜肽酶(mesentericopeptidase)、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(Alcalase)和枯草杆菌蛋白酶DY。I-S2型枯草杆菌酶的例子包括枯草杆菌蛋白酶309(Savinase)、枯草杆菌蛋白酶147、枯草杆菌蛋白酶PB92、BLAP和K16。
在另一实施方案中，亲本枯草杆菌酶和/或本发明的枯草杆菌酶可以是属于Thermitase家族的枯草杆菌酶，如Thermitase。
亲本枯草杆菌酶和/或本发明的枯草杆菌酶还可以属于蛋白酶K家族，如蛋白酶K等。
可用作亲本枯草杆菌酶的其它枯草杆菌酶例子包括PD498(WO93/24623)、aqualysin、蛋白酶TW7、蛋白酶TW3、高碱性蛋白酶，如文献EP503346、EP610808和WO95/27049所述的那些。
在另一实施方案中，亲本枯草杆菌酶可以是在保留枯草杆菌酶特征的同时随后已经过修饰的枯草杆菌酶。例如，亲本枯草杆菌酶可以包含在环区(loop区)的插入，即在第33-43、95-103、125-132、153-173、181-195、202-204或218-219位的一个或多个区域中的插入。亲本枯草杆菌酶还可以是已进一步修饰的Savinase。这些进一步修饰的例子包括在以下一个或多个位置的替代、插入或缺失1、3、4、27、36、76、87、97、98、99、100、101、103、104、120、123、159、160、166、167、169、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252、274。这些修饰的例子包括X1G、X3T、X4I、X27L、S27R、*36D、X76D、X87N、X99D、X101G、X101R、X103A、X104I、X104N、X104Y、X120D、X123S、X159D、X160S、X167A、X170S、X194P、X195E、X199M、X205I、X217D、X217L、X218S、X222S、X222A、X232V、X235L、X236H、X245R、X248D、X252K、X274A。
亲本枯草杆菌酶和/或本发明的枯草杆菌酶尤其可以是Savinase样枯草杆菌蛋白酶，即，与Savinase至少具有40％的同一性，如至少50％的同一性或至少60％的同一性，更尤其是至少70％的同一性或至少80％的同一性，甚至更尤其是与Savinase至少具有90％的同一性或至少95％的同一性，其中的同一性是亲本枯草杆菌酶/本发明的枯草杆菌酶的核酸序列分别与Savinase的核酸序列相比较的同一性。
各种枯草杆菌蛋白酶与Savinase的序列对比显示，各种枯草杆菌蛋白酶的核酸序列之间的同一性在100％-40％的范围内。
不同蛋白酶对之间的序列同一性如下与Savinase的序列同一性Alcalase60.9％BLAPR 98.1％
蛋白酶C 98.5％蛋白酶D 98.9％蛋白酶E 96.7％蛋白酶A 97.8％ProperaseTM98.9％Relase 98.1％PD49844.3％sendai 81.4％YAB 81.8％PD498的蛋白质结构公布于WO98/35026(Novo Nordisk)中。Savinase的结构可发现于文献BETZEL等，J.MOL.BIOL.，第223卷，第427页，1992年(1svn.pdb)。
可如文献所述测定枯草杆菌酶和枯草杆菌酶变体的活性“酶分析方法”(Methods of Enzymatic Analysis)，第三版，1984，Verlag Chemie，Weinheim，第5卷。
免疫原性本发明的发明人已发现本发明的枯草杆菌酶变体和枯草杆菌酶分别与亲本枯草杆菌酶和Savinase相比具有改变的免疫原性。
“免疫反应”在本发明中应理解为生物体对化合物的反应，该反应根据四种标准反应(Coombs&Gell所述的类型I、II、III和IV)中任一种涉及免疫系统。相应的，术语化合物的“免疫原性”在本发明中指该化合物在包括人在内的动物体内诱导免疫反应的能力。
术语“(已)改变的免疫原性”在涉及本发明的枯草杆菌酶变体或枯草杆菌酶时是指分别与生物体对亲本枯草杆菌酶/Savinase的同类型免疫反应相比较，生物体对于所说枯草杆菌酶变体/枯草杆菌酶的免疫反应是不同的，即降低或增加。
通常只是蛋白质的一部分，也称为表位的部分，参与免疫反应的诱导，如抗体结合或T-细胞激活。通常表位由一套非连续的氨基酸组成，即，在一级序列中氨基酸相互间并不毗连，但在蛋白质的三维结构中则相互接近。鉴别抗体结合中所涉及的表位的一个特别有用的方法是，筛选肽-噬菌体膜蛋白融合物文库，并选择那些与相关抗原特异性抗体结合的融合物，对融合基因的随机化部分进行测序，将结合中所涉及的序列进行比对，基于这些序列比对确定共有序列，并将这些共有序列作图定位于抗原表面或序列和/或结构中，从而确定抗体结合中所涉及的表位。鉴别表位的方法如文献WO 01/83559和WO 99/53038中所述。
变态反应通常理解为由于先前存在的抗体和T细胞的出现而对无害的外源物质产生的不利免疫反应(Janeway和Travers，免疫学，当代生物学(Immunology，Current Biology)，Blackwell，Garland，1994年，第11章)。大部分变态反应涉及IgE介导的应答，且在本发明的上下文中术语“变态反应”应理解为生物体对化合物的反应，该反应涉及IgE介导的应答(Coombs&Gell所述的类型I反应)。应理解由于与某化合物接触而致敏(即，产生化合物特异的IgE抗体)是包括在“变态反应”的定义范围内的。相应的，术语化合物的“变应原性”在本发明中是指该化合物在包括人在内的动物体内诱导变态反应的能力。
变态反应背后的一般机制可以划分为致敏阶段和有症状的阶段。致敏阶段包括个体与变应原的首次接触，取决于施用方法这可以通过吸入、直接与皮肤和眼睛接触或注射而发生。此事件激活了特异的T-和B-淋巴细胞，并导致了变应原特异的IgE抗体，即，免疫球蛋白E的产生。这些IgE抗体最终促进了在有症状阶段开始时变应原的俘获及向T-淋巴细胞的呈递。此症状阶段由与同一抗原或类似抗原的二次接触而起始。特异的IgE抗体与处于例如肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的特异IgE受体结合，并同时俘获变应原。当IgE抗体是多克隆抗体时，结果是IgE受体的桥接和成簇，这样就激活了肥大细胞和嗜碱性粒细胞。此激活作用触发了变态反应有症状阶段的早期及晚期反应中所涉及的各种化学介质的释放。
本发明的枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶尤其可以具有降低了的免疫原性，如降低了的变应原性。
在本发明的上下文中变应原性应依照按如下方法产生于Balb/C小鼠中的IgE反应的程度来衡量持继20周每周用50μl 0.9％(重量/体积)NaCl(对照组)或含10μg蛋白质的50μl 0.9％(重量/体积)NaCl皮下免疫接种小鼠，每隔一周在下次免疫接种前从眼部采集血清，并随后用特异于小鼠IgE的ELISA测定IgE的水平。
因此，术语“降低了的变应原性”在涉及本发明的枯草杆菌酶变体/枯草杆菌酶时应理解为分别与亲本枯草杆菌酶/Savinase相比，在所说的试验中IgE反应减少或消失了。具体而言，在此试验中检测到的由应答所说枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶而获得的IgE水平可以分别是应答亲本枯草杆菌酶/Savinase所获得的IgE水平的35％，如30％或25％或20％或15％或10％。因此，分别与亲本枯草杆菌酶/Savinase相比，应答本发明枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶的IgE反应可以降低至少3倍，如5倍或10倍。
可用于测试对蛋白质的免疫反应/变态反应的其它方法包括体外试验，如检测蛋白质的抗体结合和/或功能性的测定法(这可以用剂量反应曲线和如直接或竞争性ELISA(C-ELISA)进行详细的测定，如文献WO99/47680中所述)，基于细胞因子表达概况的测定法和基于上皮细胞和包括B细胞和T细胞在内的其它细胞的增殖或分化反应的测定法。用于检测变应原性的体内模型的例子包括豚鼠气管内模型(GPIT)(Ritz等，Fund.Appl.Toxicol.，21，第31-37页，1993)、小鼠皮下模型(小鼠-SC)(WO98/30682)、大鼠气管内模型(大鼠-IT)(WO 96/17929)和小鼠鼻内模型(MINT)(Robinson等，Fund.Appl.Toxicol.，34，第15-24页，1996)。
可分别用本发明枯草杆菌酶变体/枯草杆菌酶的纯化制品来检测本发明枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶的改变了的变应原性和/或免疫原性。因此在测试枯草杆菌酶变体或枯草杆菌酶是否具有改变的变应原性和/或免疫原性之前，可以先将它们大量表达并/或用常规方法进行纯化。
其它的修饰本发明的枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶可通过如突变和/或化学缀合等方法进行进一步的修饰。其目的是为了进一步降低酶的变应原性或增强其性能、稳定性，耐热性或酶的任何其它特性。
在本发明的一个实施方案中，枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶可通过蛋白质内的替代而被进一步修饰，如用适于化学修饰的氨基酸替代诸如表位区域内已有的氨基酸。所述替代尤其可以是保守性的以限制其对蛋白质结构的影响，例如所述替代可以是精氨酸对赖氨酸、天冬酰胺对天冬氨酸、谷氨酰胺对谷氨酸、苏氨酸或丝氨酸对半胱氨酸的替代。也可在未首先用其它氨基酸替代一个或多个氨基酸的情况下对本发明枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶中存在的氨基酸进行化学修饰。有关化学修饰的化学法如上所述。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶可进行另外的修饰以进一步降低所说酶的变应原性。特别地，可用文献WO99/00489中所述的方法对本发明的枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶进行另外的修饰，其中将分子量100Da-750Da以下的聚合物分子，特别是分子量100-500Da的聚合物分子，如300Da左右的聚合物分子偶联于蛋白质上。聚合物分子可以是任何合适的聚合物分子，包括天然的和合成的均聚物，如多元醇(即poly-OH)、聚胺(即poly-NH2)和聚羧酸(即poly-COOH)，以及别的杂聚物，即含一个或多个不同偶联基团，如羟基和胺基的聚合物。具体的例子包括聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇。可以用本领域熟练技术人员已知的任何方法将聚合物与枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶偶联。一般而言，可将4-50个聚合物分子，如5-35个聚合物分子与所说的酶偶联。
进一步修饰本发明枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶的其它方法包括在例如枯草杆菌酶变体/枯草杆菌酶的表位区域中引入用于翻译后修饰的识别位点。然后应在能进行相应的翻译后修饰的合适宿主生物体内表达此枯草杆菌酶变体/枯草杆菌酶。这些翻译后修饰可用于掩蔽表位并由此进一步降低枯草杆菌酶变体/枯草杆菌酶分别相对于亲本枯草杆菌酶/Savinase的变应原性和/或免疫原性。翻译后修饰包括糖基化、磷酸化、N-末端加工、酰化、核糖基化和硫酸酯化。N-糖基化作用是一个好例子。N-糖基化作用发生于序列Asn-Xaa-Ser、Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Cys的位点处，其中Xaa残基和位于此三肽共有序列后的氨基酸都不是脯氨酸(T.E.Creighton，蛋白质-结构和分子特性(Proteins-Structures andMolecular Properties)，第二版，W.H.Freeman和Co.，纽约，1993年，第91-93)。糖基化蛋白质变体的糖基链的特性可以是线性的或分支的，这取决于蛋白质和宿主细胞。另一例子是磷酸化作用蛋白质序列可以被修饰以引入具识别序列arg-arg-(xaa)n-ser(其中n＝0、1或2)的丝氨酸磷酸化位点(它可被cAMP-依赖型激酶磷酸化)，或者具有识别序列-lys/arg-(xaa)3-asp/glu-(xaa)3-tyr的酪氨酸磷酸化位点(它通常可被酪氨酸特异的激酶磷酸化)(T.E.Creighton，蛋白质-结构和分子特性(Proteins-Structures and Molecular Properties)，第二版，Freeman，纽约，1993年)。
化学修饰本发明的枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶可以被化学修饰。本领域技术熟练人员已知的任何方法都可用于化学修饰所说的酶。
制备共价生物缀合体的化学反应可在文献中找到“生物缀合技术”(Bioconjugate Techniques)，Hermanson，G.T.(1996)，Academic PressInc。
如果通过将第57、170、181和/或241位的氨基酸替代成适于化学修饰的氨基酸来修饰枯草杆菌酶变体，则这种替代可以特别是保守的以便保证所述替代对多肽结构的影响是有限的。就添加氨基基团来说，可通过将精氨酸替代成赖氨酸来达到此目的，这两个残基都带正电荷，但只有赖氨酸具有适于作为附着基团的自由氨基基团。就添加羧酸基团来说，保守性替代可以是例如将天冬酰胺替代成天冬氨酸或将谷氨酰胺替代成谷氨酸。除了出现于酸性残基上的羧基外，这些残基在大小和性状上彼此相似。就提供SH基团来说，可通过将苏氨酸或丝氨酸改变成半胱氨酸来完成保守性替代。
化学缀合对于化学缀合而言，蛋白质需要与活性或活化的聚合物一起孵育并随后与未反应的聚合物分离。这可以在溶液中进行并随后进行纯化，或者这可以利用固定化蛋白质很方便地进行，后者可以很容易地暴露于不同反应条件中而且易于漂洗。
在聚合物分子将与所关心的多肽缀合且聚合物分子无活性的情况下，它们必须用适当的技术加以激活。依照本发明也可以考虑通过接头将聚合物分子与多肽偶联。适当的接头对于本发明技术熟练人员来说是众所周知的。聚合物分子活化以及缀合多肽所用的方法和化学反应在文献中有透彻的描述。不溶性聚合物活化通常所用的方法包括用溴化氰、高碘酸、戊二醛、双环氧化物(biepoxide)、表氯醇、二乙烯砜(divinylsulfone)、碳二亚胺、磺酰卤、三氯三嗪等活化官能基团(参阅“生物缀合技术”(Bioconjugate Techniques)，Hermanson，G.T.(1996)，Academic PressInc.；“蛋白质固定化。基本原理和应用”(Proteinimmobilization.Fundamental and applications)，R.F.Taylor(1991)，Marcel，Dekker，N.Y.；“蛋白质缀合和交联的化学反应”(Chemistry ofProtein Conjugation and Crosslinking)，S.S.Wong(1992)，CRC出版社，Boca Raton；“固定化亲合配体技术”(Immobilized Affinity LigandTechniques)，G.T.Hermanson等(1993)，学术出版社，纽约)。其中一些方法涉及不溶性聚合物的活化，但也可应用于可溶性聚合物的活化，如高碘酸、三氯三嗪、磺酰卤、二乙烯砜、碳二亚胺等。在选择活化和缀合化学反应时必须考虑聚合物上的氨基、羟基、硫醇、羧基、醛基或巯基官能基团和蛋白质上所选择的附着基团，化学反应通常由i)聚合物的活化，ii)缀合，以及iii)封闭剩余的活性基团所组成。
下文将简述多种适宜的聚合物活化方法。不过，应当理解其它的方法也是可以应用的。
可以利用二酰亚胺及例如氨基-PEG或肼基-PEG(Pollak等，(1976)，J.Am.Chem.Soc.，98，289，291)或重氮乙酸盐/酰胺(Wong等，(1992)“蛋白质缀合和交联化学”(Chemistry of Protein Conjugationand Crosslinking)，CRC出版社)的帮助进行聚合物分子与多肽自由酸性基团的偶联。
将聚合物分子与羟基偶联通常很困难，因为这必须在水中进行。水解作用常常胜过了与羟基的反应。
用马来酰亚胺或邻吡啶基二硫化物等特殊基团可以完成聚合物分子与自由巯基的偶联。乙烯砜(美国专利5414135(1995)，Snow等)也优选用于巯基，但它的选择性不如所提及的其它试剂。
用含两个邻近羰基的基团可以作用于多肽链中易接近的精氨酸残基。
涉及将亲电子活化的PEG与赖氨酸的氨基偶联的技术也是有用的。用于醇的许多通常的离去基团都可造成胺键。例如，可利用烷基磺酸酯，如tresylates(Nilsson等，(1984)，酶学方法(Methods in Enzymology)，第104卷，Jacoby，W.B.，编辑，Academic出版社Orlando，第56-66页；Nilsson等，(1987)，酶学方法(Methods in Enzymology)，第135卷，Mosbach，K.，编辑，Academic出版社Orlando，第65-79页；Scouten等，(1987)，酶学方法(Methods in Enzymology)，第135卷，Mosbach，K.，编辑，Academic出版社Orlando，1987；第79-84页；Crossland等，(1971)，J.Amr.Chem.Soc.1971，93，第4217-4219页)、甲磺酸酯(Harris，(1985)，同上引文；Harris等(1984)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22，第341-352页)、芳基磺酸酯如甲苯磺酸酯和对-硝基苯磺酸酯。
如Tresyl酰氯等有机磺酰氯可以有效地将PEG等许多聚合物中的羟基转换成好的离去基团(磺酸酯)，当这些离去基团与多肽中的氨基等亲核基团反应时可在聚合物和多肽之间形成稳定的键接。除了高缀合物产量之外，此反应条件通常都是温和的(中性或弱碱性pH，以避免变性且使活性几乎不损失或不损失)，而且满足对多肽不具有破坏性的要求。
甲苯磺酸酯比甲磺酸酯更具有反应性，但同时也更不稳定，它可以分解为PEG、二噁烷和磺酸(Zalipsky，(1995)，生物缀合物化学(Bioconjugate Chem.)，6，150-165)。环氧化物也可用于建立胺键，但其反应性比上述基团低得多。
用光气将PEG转变成氯甲酸酯可以导致与赖氨酸的氨基甲酸酯键接。在用N-羟基琥珀酰亚胺(美国专利5122614，(1992)；Zalipsky等，(1992)，Biotechnol.Appl.Biochem.，15，第100-114页；Mon-fardini等，(1995)，Bioconjugate Chem.，6，62-69)、咪唑(Allen等，(1991)，Carbohydr.Res.，213，第309-319页)、对-硝基酚、DMAP(EP 632 082A1，(1993)，Looze，Y.)等取代氯的许多变通方案中都可以进行基本上相同的反应。通常通过将氯甲酸酯与所期望的离去基团反应来制备这些衍生物。所有这些基团都导致了与肽的氨基甲酸酯键接。
此外，也可应用异氰酸酯和异硫氰酸酯，分别产生脲和硫脲。
酰胺可以用上述相同的离去基团和环亚胺thrones从PEG酸获得(美国专利5,349,001，(1994)，Greenwald等)。这些化合物的反应性很高，但可能使水解加快。
还可应用从与琥珀酸酐反应中得到的PEG琥珀酸酯。由此组成的酯基使缀合物更易受到水解作用的影响(美国专利5,122,614，(1992)，Zalipskyl)。此基团可以用N-羟基琥珀酰亚胺激活。
此外，可以引入特殊的接头。研究最多的是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1997)，J.Biol.Chem.，252，3578-3581；美国专利4,179,337，(1979)，Davis等；Shafer等，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。
将PEG与芳香胺偶联，然后进行重氮化，产生了很活跃的重氮盐，它可以在原位与肽反应。也可以通过与PEG的二氢唑酮衍生物(美国专利5,321,095，(1994)，Greenwald，R.B.)再反应另外引入一个酰胺键，从而得到酰胺键的联接。
当某些肽没有包含多个赖氨酸时，将一个以上的PEG附着于同一个赖氨酸上可能是有利的。可通过例如使用1，3-二氨基-2-丙醇来达到此目的。
PEG还可以通过氨基甲酸酯键与酶的氨基连接(WO 95/11924，Greenwald等)。还可将赖氨酸残基用作骨架。
实施例中所用的偶联技术是WO 90/13590(Enzon)中所述的N-琥珀酰亚胺碳酸酯缀合技术。
在一个具体的实施方案中，活化的聚合物是甲基-PEG，它已用WO90/13590(Enzon)中所述的N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化。在碱性条件下该偶联具有高产率。
对于聚合物与蛋白质的偶联，尤其可以使用与文献WO96/17929和WO99/00489(Novo Nordisk A/S)所述相似的条件，如，分子量100-5000Da的单或双活化的PEG。例如，可用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化甲基-PEG350并与蛋白质变体以大于5的摩尔比一起保温，所说的摩尔比是用目的蛋白质中赖氨酸的摩尔数除活化PEG的当量计算得到的。对于与固定化蛋白质变体的偶联来说，PEG蛋白质的比率应进行最优化，以便使PEG浓度对于缓冲液的缓冲能力来说足够低以保持整个反应阶段的碱性pH；但PEG浓度仍然要足够高以保证对蛋白质有足够程度的修饰。此外，将PEG保持在防止水解的条件下(即，溶于酸或溶剂中)且将其直接稀释于碱性的反应缓冲液中是重要的。基本上，一级胺仅存在于蛋白质的赖氨酸残基中。这可以通过用硼酸盐缓冲液彻底洗涤得以保证。通过将含未反应PEG的液相与含蛋白质和衍生蛋白质的固相分离而终止反应。任选的，随后可以用Tris缓冲液洗固相，以封闭可能仍存在的PEG链上的任何未反应位点。
生产枯草杆菌酶变体和枯草杆菌酶的方法本发明的枯草杆菌酶变体和枯草杆菌酶可以用本领域内的任何已知方法生产，且本发明还涉及编码本发明枯草杆菌酶变体或枯草杆菌的核酸、含所说核酸的DNA构建体和含所说核酸序列的宿主细胞。
一般而言，天然存在的蛋白质可以通过培养表达该蛋白质的生物体且随后纯化该蛋白质而产生，或者可以通过将编码该蛋白质的核酸如基因组DNA或cDNA克隆入表达载体中，然后将所说的表达载体引入宿主细胞中，培养此宿主细胞并纯化所表达的蛋白质而产生。
通常，可以通过亲本蛋白质的定点诱变以及引入表达载体、宿主细胞中等步骤产生蛋白质变体。亲本蛋白质可以克隆自产生所说多肽的株系或表达文库，即，它可以分离自基因组DNA或从cDNA制备而来，或者使用两种方法相结合而获得。
一般而言，为了获得亲本枯草杆菌酶或本发明的枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体，可以利用基因克隆和/或在所说基因中引入突变(随机的和/或定点的)的标准方法。有关合适的技术的进一步描述，参阅以下文献分子克隆实验室手册(Molecular cloningA laboratory manual)(Sambrook等，(1989)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel，F.M.等(编辑))；分子生物学通用方法(Current protocols in Molecular Biology)(JohnWiley和Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(编辑))；有关芽孢杆菌的分子生物学方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)(John Wiley and Sons，1990)；DNA克隆实用方法(DNA ClongingA Practical Approach)，卷I和II(D.N.Glover编辑，1985)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait编辑，1984)；核酸杂交(NucleicAcid Hybridization)(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985))；转录和翻译(Transcription And Translation)(B.D.Hames&S.J.Higgins，编辑(1984))；动物细胞培养(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney，编辑(1986))；固定化细胞和酶(Immobilized Cell And Enzymes)(IRL出版社，(1986))；分子克隆实用指南(A Practical Guide To MolecularCloning)(B.Perbal，(1984))和WO 96/34946。
表达载体含有编码本发明枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体的核酸序列的重组表达载体可以是便于进行重组DNA操作且可以引起所说核酸序列表达的任何载体。
载体的选择通常取决于它要导入的宿主细胞。适宜载体的例子包括线性或闭环质粒或病毒。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制是不依赖于染色体的复制的，如，质粒，染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含用于保证自我复制的任何元件。细菌的复制起点的例子有质粒pBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。用于酵母宿主细胞中的复制起点的例子有2μ复制起点、CEN6和ARS4的联合以及CEN3和ARS1的联合。复制起点可以是具有使其在宿主细胞中具有温度敏感功能的突变体(参阅，如，Ehrlich，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 751433)。
或者，载体可以在被引入宿主细胞后整合入基因组中并与所整合的染色体一起复制。待整合入宿主细胞基因组中的载体可以包含能使向基因组中的整合成为可行的任何核酸序列，尤其是它可以包含利于通过同源或非同源重组方式整合入基因组的核酸序列。载体系统可以是单个的载体，如质粒或病毒，或者是两个或多个载体，如多个质粒或多个病毒(它们一起含有待引入宿主细胞基因组的全部DNA)或者是转座子。
载体尤其可以是表达载体，其中编码本发明枯草杆菌酶的DNA序列与DNA转录所需的其它区段或调控序列可操作地连接。术语“可操作连接”指对区段进行排列，从而使它们为其预期目的协同地发挥作用，如，转录起始于启动子内并沿着编码枯草杆菌酶变体的DNA序列进行。其它区段或调控序列包括启动子、前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号序列和转录终止子。调控序列至少包括启动子和转录及翻译终止信号。
启动子可以是在所选择宿主细胞内显示转录活性的任何DNA序列，并可以来自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。
适用于细菌宿主细胞中的启动子的例子包括枯草杆菌(B.subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、枯草杆菌碱性蛋白酶基因、或短小芽胞杆菌(B.pumilus)木糖苷酶基因、淀粉液化芽孢杆菌BAN淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 753727-3731)的启动子。其它例子包括入噬菌体PR或PL启动子或大肠杆菌lac、trp或tac启动子或天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)琼脂酶基因(dagA)。其它的启动子如文献所述“来自重组细菌的有用蛋白质”(Useful proteins from recombinant bacteria)，《ScientificAmerican》，1980，24274-94；和Sambrook等，1989，见上引文。
在丝状真菌宿主细胞中使用的适宜启动子的例子有来自编码米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶、尖镰孢(Fusarium Oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(如美国专利4288627所述，该文件在此收编作为参考)的基因的启动子及其杂合物。尤其优选用于丝状真菌宿主细胞中的启动子是TAKA淀粉酶、NA2-tpi(来自编码黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的启动子的杂合物)和glaA启动子。另外的适用于丝状真菌宿主细胞的启动子是ADH3启动子(McKnight等，The EMBO J.4(1985)，2093-2099)或tpiA启动子。
适用于酵母宿主细胞的启动子的例子包括来自酵母糖酵解基因(Hitzeman等，J.Biol.Chem.255(1980)，12073-12080；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1(1982)，419-434)或醇脱氢酶基因(Young等，化学制品中所用的微生物遗传工程(Genetic Engineering of Microorganisamsfor Chemicals)(Hollaender等编辑)，Plenum出版社，纽约，1982)的启动子，或TPI1(US4599311)或ADH2-4c(Russell等，Nature 304(1983)，652-654)启动子。
其它的有用启动子可以获自酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸盐激酶基因。对于酵母宿主细胞来说有用的其它启动子如文献所述Romanos等，1992，Yeast8423-488。在哺乳动物宿主细胞中，有用的启动子包括病毒启动子，如那些来自猿猴病毒40(SV40)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、腺病毒和牛乳头瘤病毒(BPV)的启动子。
适用于哺乳动物细胞的启动子的例子有SV40启动子(Subramani等，Mol.Cell Biol.1(1981)，854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等，Sciences 222(1983)，809-814)或腺病毒2主要晚期启动子。适用于昆虫细胞的启动子的例子是多角体蛋白启动子(US4745051；Vasuvedan等，FEBS Lett.311，(1992)7-11)、P10启动子(J.M.Vlak等，J.Gen.Virology 69，1988，第765-776页)、苜蓿银纹夜蛾多角体病毒碱性蛋白启动子(EP 397485)、杆状病毒立即早期基因1启动子(US5155037；US5162222)或杆状病毒39K延迟早期基因启动子(US5155037；US5162222)。
如果有必要，编码本发明枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体的DNA序列还可以与适当的终止子可操作地连接。
本发明的重组载体可以进一步含有使载体能在所关心的宿主细胞内复制的DNA序列。
所说的载体还可以包含选择性标记，如，其产物补充了宿主细胞中的不足的基因，或者抗性基因，如抗氨卡青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素、新霉素、潮霉素、氨甲蝶呤等抗生素的抗性基因，或者抗重金属、病毒或除草剂的抗性基因，或其产物造成原养型或营养缺陷型的基因。细菌选择标记的例子是来自枯草杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，具抗性。常常使用的哺乳动物标记是二氢叶酸还原酶基因(DHFR)。适用于酵母宿主细胞的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记可选自以下，但不局限于此amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(氨基苯甲酸合酶)和glufosinate抗性标记，以及来自其它物种的等价物。具体而言，用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar标记。此外，可以通过共转化完成选择，如WO91/17243所述，其中的选择性标记在分开的载体上。
为了指引本发明的枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体进入宿主细胞的分泌途径，可在重组载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列或前序列)。分泌信号序列在正确的阅读框中与编码所述酶的DNA序列连接。分泌信号序列通常置于编码该酶的DNA序列的5’端。分泌信号序列可以是正常与所说酶相关的序列，或者可以来自编码另一分泌蛋白质的基因。
用于分别连接编码本发明酶的DNA序列、启动子以及任选地终止子和/或分泌信号序列，或者通过适当的PCR扩增方案装配这些序列并将它们插入含复制或整合所必需信息的合适载体的技术都是本领域技术熟练人员众所周知的(参阅，例如，Sambrook等的著作)。
可以将一个以上拷贝的编码本发明酶的核酸序列插入宿主细胞中以扩增核酸序列的表达。用本领域众所周知的方法将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞中并对转化体进行选择可以实现核酸序列的稳定扩增。
本发明的核酸构建体还可包含编码一种或多种有利于多肽表达的因子的一个或多个核酸序列，所述因子如，激活物(如，反式作用因子)、陪伴分子和加工蛋白酶。在所选宿主细胞内起作用的任何因子都可用于本发明中。编码一个或多个这样因子的核酸不一定与编码本发明多肽的核酸串联。
宿主细胞编码本发明枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体的DNA序列对于其所进入的宿主细胞来说可以是同源或异源的。如果它与宿主细胞同源，即，由宿主细胞天然产生，它通常可操作地连接非其天然环境中的另一启动子序列，或者，如果适当的话，另一分泌信号序列和/或终止序列。术语“同源的”意图包括所编码酶对于所述宿主生物体是天然酶的DNA序列。术语“异源的”意图包括不是由宿主细胞天然表达的DNA序列。从而，该DNA序列可以来自另一生物体，或者可以是合成的序列。
本发明的DNA构建体或重组载体所导入的宿主细胞可以是能生产本发明枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体的任何细胞，诸如原核生物如细菌等或真核生物，如酵母或丝状真菌等真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
培养时能产生本发明枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体的细菌宿主细胞的例子是革兰氏阳性菌，如芽孢杆菌，如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽胞杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、淀粉液化芽孢杆菌、凝结芽胞杆菌(B.coagulans)、环状芽胞杆菌(B.cirulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)或苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)等，或变铅青链霉菌(S.lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)等链霉菌(streptomyces)菌株，或者是大肠杆菌(E.cdi)或假单胞菌(Pseudomonassp.)等革兰氏阴性细菌。
可通过原生质体转化、电穿孔、接合或通过用感受态细胞以本质已知的方式完成细菌的转化(参阅，Sambrook等人，见上引文)。
当枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体在大肠杆菌等细菌内表达时，所说的酶可以保留在细胞质内，通常作为不溶性颗粒(称作包涵体)，或者可以在细菌分泌序列的引导下进入周质间隙。在前一种情况下，裂解细胞，回收颗粒并进行变性，然后通过稀释变性剂使酶重折叠。在后一种情况下，可以通过用超声波或渗压休克法等方法破坏细胞，释放周质间隙内容物并回收所说的酶，从而从周质间隙中回收到所说的酶。
当在芽孢杆菌或链霉菌菌株等革兰氏阳性菌中表达枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体时，所说的酶可以保留在细胞质中，或者可以在细菌分泌序列的指引下到达细胞外培养基。在后一种情况下，如下所述从培养基中回收所说的酶。
宿主酵母细胞的例子包括假丝酵母属(candida)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)、酵母属(saccharomyces)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)、假丝酵母(candida)、毕赤氏酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)或Yarrowia属种的细胞。在一个具体的实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔酵母(S.carlsbergensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、糖化酵母(S.diastaticus)、saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母(S.kluyveri)、诺地酵母(saccharomyces norbensis)或卵形酵母(S.oviformis)细胞。其它有用的酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、Yarrowia lipolytica、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilgo maylis)、Candida maltose、季尔蒙氏毕赤酵母(Pichia guillermondii)和Pichiamethanolio细胞(参阅，Gleeson等，J.Gen.Microbiol.132，1986，第3459-3465页；US4882279和US4879231)。因为酵母的分类在未来有可能会改变，就本发明的目的而言，应按如下文献所述定义酵母酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.，编辑，Soc.App.Bacteriol.学术会议系列号9，1980)。酵母的生物学和酵母遗传操作是本领域众所周知的(参阅，如，酵母的生化和遗传学(Biochemistry and Genetics of Yeast)，Bacil，M.，Horecker，B.J.，和Stopani，A.O.M.，编辑，第二版，1987；酵母(The Yeasts)，Rose，A.H.，和Harrison，J.S.，编辑，第二版，1987；和酵母属的分子生物学(The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces)，Strathem等，编辑，1981)。可以用以下文献所述的方法转化酵母Becker和Guarente，In Abelson，J.N.和Simon，M.I.编辑，酵母遗传学和分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods inEnzymology)，第194卷，第182-187页，Academic Press Inc.，纽约；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153163；和Hinnen等，1978，Proceedingof the National Academy of Sciences USA 751920。
丝状真菌细胞的例子包括丝状形式的真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门(Oomycota)(按文献所定义的Hawksworth等，1995，同上引文)，尤其是它可以是以下菌属的细胞枝顶孢属(Acremonium)，如A.chrysogenum等；曲霉属(Aspergillus)，如泡盛曲霉(A.awamori)、臭曲霉(A.foetidus)、日本曲霉(A.japonicus)、黑曲霉(A.niger)、构巢曲霉(A.nidulans)或米曲霉(A.oryzae)；镰孢霉(Fusarium)，如杆孢状镰孢(F.bactridioides)、F.cerealis、F.crookwellense、大刀镰孢(F.culmorum)、禾本科镰孢(F.graminerarum)、禾赤镰孢(F.graminum)、异孢镰孢(F.heterosporum)、合欢木镰孢(F.negundi)、多枝镰孢(F.reticulatum)、粉红镰孢(F.roseum)、接骨木镰孢(F.sambucinum)、肤色镰孢(F.sarcochroum)、硫色镰孢(F.sulphureum)、F.trichothecioides或尖镰孢(F.oxysporum)；腐质霉属(Humicola)，如H.insolens或H.lanuginose；毛霉属(Mucor)，如米黑毛霉(M.miehei)；毁丝霉属(Myceliophthora)，如M.thermophilum；脉孢霉属(Neurospora)，如粗糙脉孢霉(N.crassa)；青霉属(Penicillium)，如产紫青霉(P.purpurogenum)；梭孢壳属(Thielavia)，如T.terrestris；Tolypocladium；或木霉属(Trichoderma)，如T.harzianum、康宁木霉(T.koningii)、T.longibrachiatum、T.reesei或绿色木霉(T.viride)，或者其有性型或同物异名。利用曲霉属菌种表达蛋白质可参见如文献EP272277、EP230023所述。
昆虫细胞的例子包括鳞翅目细胞系，如秋粘虫细胞(spodopterafrugiperda)或粉纹夜蛾(Trichoplusiani)细胞(参阅US5077214)。培养条件可适宜地如WO89/01029或WO89/01028所述。可按文献所述进行昆虫细胞的转化和异源多肽的生产US 4745051；US 4775624；US4879236；US5155037；US 5162222；EP397485。
哺乳动物细胞的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞或可来自如美国典型培养物保藏中心等机构的其它永生化细胞系。转染哺乳动物细胞并表达引入该细胞的DNA序列的方法参阅以下文献Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.159(1982)，601-621；Southern和Berg，J.Mol.Appl.Genet.1(1982)，327-341；Loyter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982)，422-426；Wigler等，Cell14(1978)，725；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7(1981)，603；Ausubel等，分子生物学通用方法(Current Protocols in Molecular Biology)，JohnWiley and Sons，Inc.，纽约，1987，Hawley-Nelson等，Focus 15(1993)，73；Ciccarone等，Focus 15(1993)，80；Graham和van der Eb，Virology52(1973)，456；和Neumann等，EMBO J.1(1982)，841-845。可以用Graham和Van der Eb的磷酸钙沉淀法(1978，Virology 52546)通过直接摄取转染哺乳动物细胞。
表达和分离蛋白质的方法为了表达本发明的酶，通常将用含有编码本发明酶的核酸序列的载体所转化或转染的上述宿主细胞在允许期望分子产生的条件下培养于适当的营养培养基中，然后从细胞或培养液中回收这些分子。
用于培养宿主细胞的培养基可以是适于宿主细胞生长的任何常规培养基，如含适当补充物的基本或复杂培养基。适当的培养基可获自供应商或可以按已公布的配方制备(如，参阅美国典型培养物保藏中心的目录)。培养基也可以用本领域已知的方法制备(参阅，如，有关细菌和酵母的文献；Bennett，J.W.和LaSure，L.编辑，真菌中更多的基因操作(More GeneManipulations in Fungi)，Academic Press，CA，1991)。
如果本发明的酶分泌至营养培养基中，它们可以直接从培养基中回收。如果它们不分泌，则可以从细胞裂解物中回收。本发明的酶可以用常规方法回收自培养基，包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，用硫酸铵等盐沉淀上清液或滤液中的蛋白质性组分，用各种层析方法进行纯化，如，离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析等等，具体方法取决于目的酶。
本发明的酶可以用本领域已知对这些蛋白质特异的方法进行检测。这些检测方法包括特异抗体的使用、产物的形成或底物的消失。例如，酶检测法可以用于测定所说分子的活性。用于测定各种活性的方法是本领域所已知的。
本发明的酶可以用本领域已知的各种方法进行纯化，包括但不局限于，层析法(如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(如，制备型等电聚焦(IEF))、差异溶解(如，硫酸铵沉淀)或提取(参阅，如，蛋白质纯化(Protein Purification)，J-C Janson和Lars Ryden，编辑，VCH Publishers，纽约，1989)。
当含有编码本发明酶的DNA序列的表达载体被转化/转染入异源宿主细胞后，可以实现该酶的异源重组生产。使用异源宿主细胞的优势是，可以产生高度纯化的酶组合物，其特征是不含有同源杂质(当蛋白质或肽表达于同源宿主细胞中时常常存在这些同源杂质)。在此上下文中，同源杂质指来源于本发明酶最初来自的细胞的同源细胞的任何杂质(如，除了本发明酶之外的其它多肽)。
商品化的酶应用本发明还涉及含本发明枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体的组合物。例如，可以将枯草杆菌酶/枯草杆菌酶变体应用于个人护理用的组合物，如洗发香波、皂条、润肤液、润肤霜、染发剂、牙膏、隐形眼镜、化妆品(cosmetics)、化妆用品(toiletries)，或者是处理纺织品的组合物、制备食品的组合物(如烘焙的食物或饲料)，或者是清洁组合物，如洗涤剂、洗盘组合物或清洁硬表面的组合物。
洗涤剂本发明的枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体可用于如洗涤剂组合物中。它可以以无粉尘颗粒、稳定液体或受保护的酶的形式包含于洗涤剂组合物中。无粉尘颗粒可以按，如US4106991和4661452所述产生，且可任选的用本领域已知方法进行包衣。蜡样包衣材料的例子有平均分子量1000-20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；含16-50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；其中的醇具有12-20个碳原子且其中有15-80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯和甘油三酯。适于通过流化床技术应用的形成薄膜的包衣材料的例子可见于专利GB 1483591。例如，按照已建立的方法通过添加多羟基化合物如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸可以稳定液体枯草杆菌酶/枯草杆菌酶制品。其它的酶稳定剂是本领域众所周知的。受保护的枯草杆菌酶/枯草杆菌酶变体可以按EP 238216中所公布的方法制备。
洗涤剂组合物可以制备成任何方便的形式，如粉、颗粒、糊或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含多达70％的水和0-30％的有机溶剂，或者是非水性的。
洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，其中每一种都可以是阴离子的、非离子的、阳离子的或两性离子的。洗涤剂通常含0-50％阴离子表面活性剂，如线性烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)、醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)、仲型链烷磺酸盐(SAS)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸或皂。它还可以包含0-40％的非离子表面活性剂，如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧基化醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇胺、脂肪酸单乙醇胺或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如，WO 92/06154中所述)。
洗涤剂组合物可另外含有一种或多种其它酶，如，蛋白酶、淀粉酶、脂肪分解酶、角质酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶和其它抗微生物多肽。
洗涤剂可以含有1-65％的助洗剂或络合剂，如，沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基-琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(如，来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可以是未复配的，即，基本上不含助洗剂。
洗涤剂还可以包含一种或多种聚合物。例如，羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸盐、聚丙烯酸盐、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可以含有漂白体系，其中可以包括过硼酸盐或过碳酸盐等过氧化氢来源，它们可以与四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS)等形成过酸的漂白活化剂组合。或者，漂白体系中可以含有酰胺、酰亚胺或砜类等过氧酸。
洗涤剂组合物可以用常规的稳定剂稳定，如，丙二醇或丙三醇等多元醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或芳香族硼酸酯等硼酸衍生物，且可以按例如WO 92/19709和或WO 92/19708所述配制所说的组合物。
洗涤剂中还可以包含其它常规的洗涤剂成分，如织物调理剂，包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、防蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、荧光增白剂或香料。
pH(在使用浓度的水溶液中检测到的)值通常是中性或碱性的，如，在7-11的范围内。
洗盘组合物此外，本发明的枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体还可用于洗盘洗涤剂中。
洗盘洗涤剂组合物通常含有表面活性剂，该表面活性剂可以是阴离子的、非离子的、阳离子的、兼性的或这些类型的混合物。该洗涤剂可以含有0-90％的非离子表面活性剂，如低泡至无泡型乙氧基化丙氧基化直链醇。
所说的洗涤剂组合物可以含有无机和/或有机类型的助洗剂盐。此助洗剂可以细分为含磷和不含磷的类型。所说的洗涤剂组合物通常含1-90％的助洗剂。
当存在含磷无机碱性助洗剂时，其例子包括水溶性盐，尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐和多磷酸盐。当存在含磷有机碱性助洗剂时，其例子包括膦酸的水溶性盐。当存在不含磷的无机助洗剂时，其例子包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐以及各种类型的水不溶性结晶的或无定形的硅铝酸盐，其中沸石是最熟知的代表。
适宜的有机助洗剂的例子包括(碱金属、铵和取代的铵的)柠檬酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、脂肪酸磺酸盐、羧甲氧基琥珀酸盐、聚乙酸铵盐、羧酸盐、多羧酸盐、氨基多羧酸盐、聚乙酰基羧酸盐和多羟基磺酸盐。
其它合适的有机助洗剂包括已知具有助洗剂特性的较高分子量的聚合物和共聚物，例如，适当的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物及它们的盐。
洗盘洗涤剂组合物可以包含氯型/溴型或氧型的漂白剂。无机氯/溴型漂白剂的例子是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐以及氯化磷酸三钠。有机氯/溴型漂白剂的例子是杂环N-溴和N-氯酰亚胺如三氯异氰尿酸、三溴异氰尿酸、二溴异氰尿酸和二氯异氰尿酸，以及它们与钾和纳等水溶性阳离子的盐。乙内酰脲化合物也是适合的。
氧漂白剂可以是无机过酸盐的形式，尤其是与漂白前体一起或作为过氧酸化合物。合适的过氧漂白剂化合物的例子包括碱金属过硼酸盐，如四水化物和一水化物，以及碱金属过碳酸盐、过硅酸盐和过磷酸盐。活化剂物质尤其可以是TAED和甘油三乙酸酯。
洗盘洗涤剂组合物可用常规的酶稳定剂进行稳定，如多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或芳香族硼酸酯等硼酸衍生物。
洗盘洗涤剂组合物还可包含其它的常规洗涤剂成分，如，抗絮凝剂物质、填充物质、抑泡剂、防蚀剂、污垢悬浮剂、螯合剂、抗污垢再沉积剂、脱水剂、染料、杀细菌剂、荧光增白剂、增稠剂和香料。
最后，本发明的枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体可用于常规的洗盘洗涤剂中，如用于以下专利文献所述的任何洗涤剂中EP518719、EP518720、EP518721、EP516553、EP516554、EP516555、GB2200132、DE3741617、DE3727911、DE4212166、DE4137470、DE3833047、WO93/17089、DE4205071、WO52/09680、WO93/18129、WO93/04153、WO92/06157、WO92/08777、EP429124、WO93/21299、US5141664、EP561452、EP561446、GB2234980、WO93/03129、EP481547、EP530870、EP533239、EP554943、EP346137、US5112518、EP318204、EP318279、EP271155、EP271156、EP346136、GB2228945、CA2006687、WO93/25651、EP530635、EP414197、US5240632。
个人护理应用本发明枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体的另一应用领域是个人护理领域，其中目的用户与蛋白质有紧密的接触，且在实验设置中已遇到了某些变应原性问题(Kelling等，J.All.Clin.Imm.，1998，第101卷，第179-187页，和Johnston等，Hum.Exp.Toxicol.，1999，第18卷，第527页)。
首先，本发明的缀合物或组合物可以有利地用于个人护理产品，如头发护理和头发处理产品。这包括香波、香膏、头发调理剂、卷发剂、染发组合物、生发油、美发液、发乳、洗发水、护发素、喷发胶等产品。
此外所考虑的是口腔护理产品，如洁齿剂、漱口水、口香糖。
还考虑的是皮肤护理产品和化妆品，如护肤霜、护肤乳、清洁霜、清洁露、清洁蜜、冷霜、皂膏、滋养精华、皮肤洗液、乳状洗液、炉甘石洗液、护手霜、皂粉、透明皂、晒黑油(sun oil)、防晒剂、剃须泡沫、剃须膏、婴儿润肤油、唇膏、唇霜、膏状粉底、搽脸粉、眼影粉、脂粉、粉底、化妆底霜、香精粉(essence powder)、增白粉。
本发明的枯草杆菌酶和/或枯草杆菌酶变体还可有利地用于隐形眼镜卫生产品中。这些产品包括清洁和消毒隐形眼镜的产品。
食品和饲料本发明的枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶还可用于食品或饲料产品中。例如，所说的枯草杆菌酶变体/枯草杆菌酶可用于改变生面团的面筋状态，如，用蛋白酶使硬的小麦面粉变软。另一例子是在酿酒工业中，其中所说的枯草杆菌酶变体/枯草杆菌酶可用于未制成麦芽的谷物一起酿造并/或用于控制氮含量。
在动物饲料工业中，所说的枯草杆菌酶变体和/或枯草杆菌酶可用于好比扩大动物的消化系统。
材料和方法材料ELISA试剂标记了辣根过氧化物酶的猪抗兔Ig(Dako，DK，P217，稀释度1∶1000)小鼠抗大鼠IgE(Serotec MCA193；稀释度1∶200)生物素标记的小鼠抗大鼠IgG1单克隆抗体(Zymed 03-9140；稀释度1∶1000)生物素标记的大鼠抗小鼠IgG1单克隆抗体(Serotec MCA336B；稀释度1∶2000)链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Kirkegard&Perry14-30-00；稀释度1∶1000)OPD邻苯二胺(Kementec目录号4260)常规方法制备的兔抗Savinase多克隆IgG常规方法制备的大鼠抗Savinase多克隆IgE缓冲液和溶液-PBS(pH7.2(1升))NaCl 8.00gKCl0.20gK2HPO41.04gKH2PO40.32g-琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-对硝基-酰苯胺(Suc-AAPF-pNP)Sigma编号S-7388，Mw624.6g/mol。
方法用ELISA测量s.c.小鼠中特异性IgE的浓度按照以下步骤用三层夹心ELISA法测定小鼠中应答皮下(S.C.)注射的蛋白质产生的特异IgE血清抗体的相对浓度
1)用10μg大鼠抗小鼠IgE(Serotech MCA419；稀释度1∶100)缓冲液1包被ELISA-平板(50μL/孔)。在4℃保温过夜。
2)倾去平板中的溶液并用含2％(重量/体积)脱脂奶的PBS在室温封闭至少半小时(200μL/孔)。轻轻摇晃。用含0.05％(体积/体积)Tween20的PBS洗平板3次。
3)平板与小鼠血清一起保温(50μL/孔)，所述血清从未稀释的浓度开始并持继作2倍稀释。保留某些孔不加血清而仅加入缓冲液4(空白)。室温保温30分钟。轻轻摇晃。用含0.05％(体积/体积)Tween20的PBS漂洗平板3次。
4)用含0.05％(体积/体积)Tween20、0.5％(重量/体积)脱脂奶的PBS将枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体稀释至适当的蛋白浓度。以50μL/孔的量室温保温30分钟。轻轻摇晃。用含0.05％(体积/体积)Tween20的PBS漂洗平板3次。
5)将用于检测所结合抗体的特异多克隆抗枯草杆菌酶或抗枯草杆菌酶变体抗血清的血清(pIg)稀释于含0.05％(体积/体积)Tween20、0.5％(重量/体积比)脱脂奶的PBS中。以50μL/孔的量室温保温30分钟。轻轻摇晃。用含0.05％(体积/体积)Tween20的PBS漂洗平板3次。
6)将缀合了辣根过氧化物酶的抗pIg抗体稀释于含0.05％(体积/体积)Tween20、0.5％(重量/体积比)脱脂奶的PBS中。以50μL/孔的量室温保温30分钟。轻轻摇晃。用含0.05％(体积/体积)Tween20的PBS漂洗平板3次。
7)将0.6mg ODP/ml+0.4μL H2O2/ml于pH5.2的柠檬酸盐缓冲液中混合。
8)溶液在临用前制备并保温10分钟。
9)50μL/孔。
10)加入50μL 2N H2SO4/孔终止反应。
11)平板在492nm波长处读数，以620nm的读数为参照。
用抗小鼠-IgG和标准大鼠IgG试剂可以进行IgG的类似测定。
用ELISA测定在MINT试验中特异IgE的浓度按照以下步骤用三层夹心ELISA法测定小鼠体内应答鼻内施用的蛋白质产生的特异IgE血清抗体的相对浓度1)用100μL/孔大鼠抗小鼠IgE重链(1∶100稀释于0.05M碳酸盐缓冲液pH9.6中的HD-212-85-IgE3)包被ELISA-平板(NuncMaxisorp)。在4℃保温过夜。
2)倾去平板中的溶液并用200μL/孔含2％脱脂奶的0.15M PBS缓冲液(pH7.5)在4℃封闭1小时。用含0.05％Tween20的0.15M PBS缓冲液漂洗平板3次。
3)平板与小鼠血清稀释物一起保温(100μL/孔)，所述稀释物从8倍稀释开始并由此2倍稀释于含0.5％脱脂奶和0.05％Tween20的0.15MPBS缓冲液中。包括适当稀释度的阳性和阴性对照血清样品加上缓冲液对照。室温保温1小时。轻轻摇晃。用含0.05％Tween20的0.15M PBS缓冲液漂洗平板3次。
4)将在含0.5％脱脂奶和0.05％Tween20的0.15M PBS缓冲液中稀释至1μg蛋白/ml的枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体以100μL/孔的量加入平板中。将平板在4℃保温1小时。用含0.05％Tween20的0.15M PBS缓冲液漂洗平板3次。
5)将用于检测所结合抗原的特异多克隆抗枯草杆菌酶或抗枯草杆菌酶变体抗血清的血清(pIg)稀释于含0.5％脱脂奶和0.05％Tween20的0.15M PBS缓冲液中。以100μL/孔的量在4℃保温1小时。用含0.05％Tween20的0.15M PBS缓冲液漂洗平板3次。
6)将1∶1000稀释于含0.5％脱脂奶和0.05％Tween20的0.15M PBS缓冲液中且与辣根过氧化物酶缀合的猪抗兔Ig以100μL/孔的量加入平板中。4℃保温1小时。用含0.05％Tween20的0.15M PBS缓冲液漂洗平板3次。
7)在平板中加入250μL/孔0.1M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，pH5.0。保温约1分钟。然后倾空平板。
8)在平板中加入100μL/孔的邻苯二胺(OPD)溶液(10mg OPD稀释于12.5ml柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液pH5.0中，临用前加入12.5μL 30％过氧化氢)。室温保温4分钟。
9)加入150μL/孔的1M H2SO4终止反应。
10)平板在490nm波长处读数，以620nm的读数为参照。
蛋白质工程通过对相应核酸序列进行定点诱变获得Savinase/枯草杆菌酶变体，方法参阅例如文献Sambrook等，(1989)，分子克隆，实验室手册，(Molecular Cloning.A Laboratory Manual)，冷泉港，纽约。
抗体结合能力的检测CovaLink平板的活化将丙酮中的10mg/ml氰尿酰氯新鲜贮液搅拌下在PBS中稀释至终浓度1mg/ml并立即等分至CovaLink NH2平板(Nunc)中(100μL/孔)且室温保温5分钟。用PBS漂洗3次后，将平板在50℃干燥30分钟，用密封胶密封，然后在塑料袋中室温保存不超过3周。
抗体/竞争性抗原的固定已活化的CovaLink NH2平板用PBS中的期望蛋白质(5μg/ml)100μL在4℃包被过夜，随后用含2％(重量/体积)脱脂奶的PBS室温保温30分钟并用含0.05％(体积/体积)Tween20的PBS漂洗4次。
蛋白酶活性用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa分析蛋白酶切割肽和对硝基苯胺之间的键产生在405nm处有吸收的可见黄色。简而言之，将100mg suc-AAPF-pNa溶于1ml二甲亚砜(DMSO)中。100μL此溶液用Britton和Robinson缓冲液，pH8.3稀释至10ml并用作蛋白酶的底物。在分光光度计上对反应进行动力学检测。
结合抗Savinase抗体的能力的测定通过如下方法比较枯草杆菌酶/枯草杆菌酶变体与Savinase之间结合抗Savinase抗体的能力用小鼠抗大鼠IgE单克隆抗体包被CovaLink NH2平板并随后用抗Savinase特异性大鼠多克隆IgE饱和这些抗体。将平板与抗原一起保温，所述抗原即Savinase(对照)、待测试结合能力的枯草杆菌酶(如，表达枯草杆菌酶变体的枯草杆菌酶文库)。通过与抗野生型Savinase多克隆兔抗血清一起保温测定已结合的抗原的量。
活性位点的功能性的测定将“主链蛋白酶”抑制剂固定于孔中并与过量的蛋白质变体和已标记的抗体一起保温。测定所结合的抗体的水平。
将25μL样品和25μL抗Savinase抗体(均稀释于含0.05％(V/V)Tween20、0.5％(重量/体积比)脱脂奶的PBS中)加入已包被的孔中并室温保温(30分钟)。去除上清液并用含0.05％(V/V)Tween20的PBS洗孔3次。
加入50μL标记了HRP的物种特异性抗Ig抗体并保温30分钟，然后用含0.05％(V/V)Tween20的PBS洗孔3次。最后，加入50μL ODP-H2O2混合物并对A492进行动力学测量以确定已结合的抗体的水平。调整稀释度使“主链蛋白质”不产生或产生极低水平的结合抗体。
分析独立样品的功能性并将两个值进行比较。
期望的蛋白质变体显示出与“主链抗体”相比结合抗体的水平至少高2倍或低2倍(δ抗体结合值至少为2)且同时功能性水平与“主链蛋白质”的相似。
实施例实施例1Savinase中表位序列和表位模式的鉴别按先前WO 01/83559实施例1中所述检测表位序列和模式。
从作为膜蛋白的一部分表达随机六肽、九肽或十二肽的高度多样性噬菌体文库(1012)中筛选它们结合纯化的特异兔IgG、及纯化的大鼠和小鼠IgG1和IgE抗体的能力。噬菌体文库按现有技术得到(参阅在此收编作为参考的WO 9215679)。
通过皮下注射、皮内注射或气管内注射包括溶于磷酸缓冲盐水(PBS)的Savinase和其它枯草杆菌酶在内的所选择靶蛋白(N＝75)，在相应的动物体内产生抗体。通过用承载有猪抗兔IgG、小鼠抗大鼠IgG1或IgE或大鼠抗小鼠IgG1或IgE抗体的顺磁性免疫珠(Dynal AS)进行亲和层析从被免疫动物的血清中纯化相应的抗体。
将相应的噬菌体文库与IgG、IgG1和IgE抗体包裹的珠子一起保温。通过将这些顺磁性珠子暴露于磁场中收集所表达的寡肽与兔IgG或大鼠或小鼠IgG1或IgE抗体具有亲和力的噬菌体。用温和的酸处理将收集到的噬菌体从固定化的抗体上洗脱下来，或者用完整的酶进行洗脱。按本领域技术所知道的方法扩增分离的噬菌体。或者，用固定的噬菌体直接与大肠杆菌一起保温进行感染。简而言之，在辅助噬菌体(如，M13K07)存在的条件下用M13来源的载体感染F-因子阳性的大肠杆菌(如，XL-1 Blue、JM101、TG1)并进行保温，通常在含葡萄糖或IPTG的2xYT培养基中，且其中含适当的抗生素以便用于选择。最后，离心除去细胞。在相应的细胞上清液上重复此事件周期2-5次。在2、3、4和5轮选择循环后，将部分被感染的大肠杆菌在选择性2xYT琼脂平板上孵育，并对出现的噬菌体的特异性进行免疫学评估。由此，噬菌体被转移到硝酸纤维素(NC)膜上。对于每个平板，做两张NC复制膜。将一张复制膜与筛选抗体一起保温，另一张复制膜与筛选抗体和用作竞争者的用于得到抗体的免疫原一起保温。在免疫原存在下缺失的那些噬菌斑被认为是特异的，并按上述方法对其进行扩增。
在聚乙二醇存在下通过离心从细胞上清液中分离特异的噬菌体克隆。分离DNA，PCR扩增编码所说寡肽的DNA序列，测定此DNA序列，以上所有步骤均按标准方法进行。从DNA序列中推断相应寡肽的氨基酸序列。
由此得到了对上述的蛋白质特异抗体具有特异性的许多肽序列。这些序列收集于数据库中，并通过序列比对进行分析以鉴定表位模式。对于此序列比对而言，保守性替代(如，天冬氨酸替代谷氨酸、赖氨酸替代精氨酸、丝氨酸替代苏氨酸)被认为是一种。结果显示大部分序列特异于抗体所抗的蛋白质。不过，从只进行了2轮筛选的噬菌体中得到了几个交叉反应的序列。在此第一轮中鉴定了22个表位模式。
在更多轮的噬菌体展示中，得到了更多的抗体结合序列，从而获得了更多的表位模式。此外，查找了文献中已发现的结合环境变应原特异性抗体的肽序列(J All Clin Immunol 93(1994)第34-43页；Int Arch ApplImmunol 103(1994)第357-364页；Clin Exp Allergy 24(1994)第250-256页；Mol Immunol 29(1992)第1383-1389页；J Immunol 121(1989)第275-280页；J Immunol 147(1991)第205-211页；Mol Immunol 29(1992)第739-749页；Mol Immunol 30(1993)第1511-1518页；MolImmunol 28(1991)第1225-1232页；J.Immunol 151(1993)第7206-7213页)。这些抗体结合肽序列均被包括在数据库中。
将这些序列收集在数据库中，并通过序列比对进行分析以鉴定表位模式。对于此序列比对而言，保守性替代(如，天冬氨酸替代谷氨酸、赖氨酸替代精氨酸、丝氨酸替代苏氨酸)被认为是一个。结果显示大部分序列特异于抗体所抗的蛋白质。不过，表位模式显示出可交叉适用于蛋白质、抗体类型和动物物种。到目前为止鉴定了75个表位模式。
在Savinase的3D-结构上对这些表位模式进行自动评估(如WO01/83559中所述)并计算各氨基酸是其中一部分的潜在表位的数目(在表1中称为频率)(表1)。
表1
实施例2潜在IgE表位中所涉及的氨基酸位置在Savinase三维结构上的定位用适当的软件(如SwissPort Pdb Viewer，WebLite Viewer)将发现的最有可能包含于潜在IgE表位中的氨基酸位置(通常这些氨基酸是被发现有可能至少涉及3个IgE表位的氨基酸)手工定位于Savinase的三维结构上(蛋白质数据库登录号1SVN；Betzel，C.，Klupsch，S.，Papendorf，G.，Hastrup，S.，Branner，S.，Wilson，K.S.来自迟缓芽孢杆菌的碱性蛋白酶Savinase在1.4埃分辨率的晶体结构(Crystal structure of the alkaline proteinaseSavinase from Bacillus lentus at 1.4 A resolution)，J Mol Biol 223第427页(1992))。
通过将氨基酸定位于三维结构上，发现可能涉及IgE表位的氨基酸簇集于3个主要区域●区域1P14、A15、R19、G20、T22、A272、R275●区域2A48、F50、P52、E54、P55、S57、D60、G61、K94、V104、Q109●区域3P129、S130、E136、N140、S161、Y167、R170、A172、D181、R186、A194、G195、L196、R247、T260、L262●位置P39和N218是孤立存在的实施例3
将蛋白质工程所选择的氨基酸位置在Savinase三维结构上定位基于结构和酶活性相关的考虑因素选择用于表位蛋白质工程的氨基酸，这意味着优先选择通过3D分析或来自其它蛋白质工程设计的经验提示将对酶的活性和/或稳定性有有益作用的位置。
所选择的氨基酸在以下区域中●区域1A15、R19、R275●区域2S57●区域3E136、N140、Y167、R170、A172、D181、R186、A194、G195、R247、T260、L262●位置N218将这些位置分别或相互联合进行人工改造。基于各个突变的性能和/或拓扑图式样(以尽可能少的突变覆盖尽可能大的区域)选择位置联合。
以这些考虑为基础，发现表2中所示的位置和位置的联合将与为获得免疫原性改变/变应原性降低的枯草杆菌酶而进行的改造相关。
表2
实施例4检测抗体结合能力降低了的Savinase变体通过评估表达于芽孢杆菌属种中的实施例3的酶活性变体的抗体结合能力改变对有希望的变体进行鉴定。
至少2倍的抗体结合能力改变(Δ结合)被认为是显著的改变(P＜0.05)。用标准方法通过DNA序列分析鉴定引入这些变体中的突变，如，参阅，分子克隆实验室手册(Molecular cloningA laboratory manual)(Sambrook等(1989)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel，F.M.等(编辑))。
Δ结合值至少为2.0的枯草杆菌酶变体及其抗体结合能力如表3中所示。
表3
实施例5检测Savinase变体在皮下注射小鼠模型中降低了的变应原性用50μL 0.9％(重量/体积)NaCl(对照组)或含10μg蛋白质的50μL 0.9％(重量/体积)NaCl每周皮下注射免疫小鼠，共20周。每一组中含10只购自Bomholdtgaard，Ry，丹麦的雌性Balb/C小鼠(约20克)。每隔一周在下一次免疫前从眼部收集血液样品(100μL)。通过血液凝结和离心得到血清。
对于各个变体和Savinase，计算20周后在同一组每只小鼠中所检测到的IgE水平的总和(综合IgE水平)。将Savinase的综合IgE水平设为100％，参照Savinase计算变体的综合IgE水平。表4显示了这些变体的综合IgE水平比Savinase至少低33％，这被发现在统计学上不同于Savinase。
表4
实施例6检测Savinase变体在体内降低了的变应原性(MINT试验)小鼠鼻内(MINT)模型(Robinson等，Fund.Appl.Toxicol.34，第15-24页，1996年)。
在实验的第一天和第三天用蛋白质对小鼠进行鼻内施药，随后每周给药，持续6周。收集研究开始后第15、31和45天的血液样品。随后分析血清的IgG1或IgE水平。
将变体S57P+R170L+R247Q、S57P+R247Q和S221C(无活性)与Alcalase和Savinase(在0.9％NaCl中)进行比较。
平均效价如表5中所示IgG1和IgE效价表示为给出阳性ELISA读数的最高稀释度的倒数(转换成log2)。如果读数高于阴性对照的平均OD值+2x标准差，此读数被认为是阳性的。每个剂量水平用了6只小鼠且结果表示为组平均效价。
表5IgG1 第15天
IgE 第31天
IgE 第45天
n.d.＝未测定从表5中可以推断，与基准蛋白质Alcalase和Savinase相比，变体S57P+R170L+R247Q、S221C和S57P+R247Q引起抗原特异性IgG1和IgE抗体产生的潜能要低得多。
实施例7检测Savinase变体的洗涤性能以下实施例提供了在所示条件下进行的多个洗涤试验的结果。
洗涤剂是失活的商品化洗涤剂，即，制备洗涤剂溶液并在微波炉中85℃加热5分钟使其失活。
pH值为目前洗涤剂溶液中的pH，未调节。
通过在milli-Q水中添加CaCl2*2H2O、MgCl2*6H2O、NaHCO3(Ca2+∶Mg2+∶HCO3-＝2∶1∶6)调节水的硬度。
洗涤条件是1)失活的商品化Tide粉1g/l，30℃，12分钟洗涤，6dH。
2)失活的商品化Tide液1.5g/l，30℃，12分钟洗涤，6dH。
试验材料是污染了血/奶/炭黑的聚酯/棉布样。
洗后，用J&M Tidas MMS分光光度计在460nm处测定试验材料的反射率(reflectance，R)。按制造商说明书进行测定。
R变体用变体洗涤的试验材料的反射率R空白不用酶洗涤的试验材料的反射率Δ反射率R变体-R空白Δ反射率越高，洗涤性能越好。以5nM酶的剂量计算Δ反射率。
表6显示了在小鼠体内展现变应原性最低(根据IgE产量)的4种枯草杆菌酶变体在Tide粉末洗涤剂中的洗涤性能结果。
表6
表7显示了在小鼠体内展现变应原性最低(根据IgE产量)的4种枯草杆菌酶变体在Tide液体洗涤剂中的洗涤性能结果。
表6
性能-1比Savinase差0与Savinase相似1比Savinase好2比Savinase好得多序列表<110>Novozyme s A/S<120>具有改变的免疫原性的枯草杆菌酶和枯草杆菌酶变体<130>10194.000-DK<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>269<212>PRT<213>迟缓芽孢杆菌<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(4)<223>X<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(27)..(27)<223>X<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(55)..(55)<223>X<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(74)..(74)<223>X<220>
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<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(268)..(268)<223>X<400>1Ala Gln Xaa Xaa Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala1 5 10 15His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Xaa Val Ala Val Leu Asp20 25 30Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser35 40 45Phe Val Pro Gly Glu Pro Xaa Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr50 55 60His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Xaa Asn Ser Ile Gly Val Leu65 70 75 80Gly Val Ala Pro Xaa Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala85 90 95Xaa Gly Xaa Gly Xaa Xaa Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala100 105 110Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Xaa Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser115 120 125Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly130 135 140Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Xaa Ser Ile Ser145 150 155 160Tyr Pro Ala Xaa Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Xaa Gln165 170 175Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly xaa Gly Leu Asp Ile180 185 190Xaa Ala Pro Gly Val Asn Xaa Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr195 200 205Ala Ser Xaa Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala210 215 220
Ala Xaa Leu Val Lys Xaa Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Xaa Ile225 230 235 240Xaa Xaa His Leu Lys Xaa Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu245 250 255Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Xaa Arg260 26权利要求
1.枯草杆菌酶变体，其中第57位被修饰，且在第170、181和247位中至少一个位置处也有修饰。
2.权利要求1的变体，其中第57位的修饰是缺失或是替代成以下残基之一P、K、L、A、W、R、H、C、D、I。
3.前述权利要求中任一的变体，其中第170位的修饰是缺失或是替代成以下残基之一C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H。
4.前述权利要求中任一的变体，其中第181位的修饰是缺失或是替代成以下残基之一A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W。
5.前述权利要求中任一的变体，其中第247位的修饰是缺失或是替代成以下残基之一A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y。
6.权利要求2或3的变体，所说的变体是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H。
7.权利要求2或4的变体，所说的变体是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W。
8.权利要求2或5的变体，所说的变体是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y。
9.权利要求2、3或5的变体，所说的变体是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X170C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y。
10.权利要求2、4或5的变体，所说的变体是X57P、K、L、A、W、R、H、C、D、I+X181A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W+X247A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y。
11.权利要求1-5任一项的变体，其中变体是如下之一X57P+X170F、X57P+X170L、X57P+X181N、X57P+X247E、X57P+X247H、X57P+X247K、X57P+X247Q、X57P+X170F+X247E、X57P+X170F+X247H、X57P+X170F+X247K、X57P+X170F+X247Q、X57P+X170L+X247E、X57P+X170L+X247H、X57P+X170L+X247K、X57P+X170L+X247Q、X57P+X181N+X247E、X57P+X181N+X247H、X57P+X181N+X247K、X57P+X181N+X247Q。
12.前述权利要求中任一的变体，其中在枯草杆菌蛋白酶中进行所述修饰。
13.前述权利要求中任一的变体，其中在I-S1型枯草杆菌酶中进行所述修饰。
14.权利要求13的变体，其中枯草杆菌酶选自枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶amylosaccharitus、枯草杆菌蛋白酶168、枯草杆菌蛋白酶肠系膜肽酶、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg和枯草杆菌蛋白酶DY。
15.权利要求1-12任一项的变体，其中在I-S2型枯草杆菌酶中进行所述的修饰。
16.权利要求15的变体，其中枯草杆菌酶选自枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147、枯草杆菌蛋白酶PB92、BLAP和K16。
17.编码前述权利要求中任一的枯草杆菌酶变体的DNA序列。
18.包含权利要求17的DNA序列的载体。
19.包含权利要求18的载体的宿主细胞。
20.包含依照权利要求1-16任一项的枯草杆菌酶变体的组合物。
21.依照权利要求20的组合物，其是清洁组合物。
22.依照权利要求20的组合物，其是个人护理组合物。
23.SEQ ID NO.1的枯草杆菌酶，其中Xaa残基在第3位是S或T，在第4位是V或I，在第27位是K或R，在第55位是G、A、V、L、I、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，在第74位是N或D，在第85位是S或N，在第97位是S或D，在第99位是S、G或R，在第101位是S或A，在第102位是V、N、Y或I，在第121位是N或S，在第157位是G、D或S，在第188位是A或P，在第193位是V或M，在第199位是V或I，在第211位是L或D，在第216位是M或S，在第226位是A或V，在第230位是Q或H，在第239位是Q或R，在第242位是N或D，在第246位是N或K，在第268位是T或A，而且其中第164、175和241位的Xaa残基是以下组合之一a)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失；或b)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失；或c)第164位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，第175位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失，且第241位的Xaa是G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W或缺失。
24.权利要求23的枯草杆菌酶，其中第55位的Xaa残基是以下残基之一P、K、L、A、W、R、H、C、D、I。
25.权利要求23和24任一项的枯草杆菌酶，其中第164位的Xaa残基是以下残基之一G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、D、N、E、Q、K、H、F、Y、W或缺失。
26.权利要求23-25任一项的枯草杆菌酶，其中第175位的Xaa残基是以下残基之一G、A、V、L、I、S、T、C、M、P、N、E、Q、K、R、H、F、Y、W或缺失。
27.权利要求23-26任一项的枯草杆菌酶，其中第241位的Xaa残基是以下残基之一A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y。
28.权利要求23-27任一项的枯草杆菌酶，其中第55位的Xaa残基是残基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一，第164位的Xaa残基是残基C、F、G、I、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y、A、L、E、D、K、H之一，且第241位的Xaa残基是残基A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y之一。
29.权利要求23-28任一项的枯草杆菌酶，其中第55位的Xaa残基是残基P、K、L、A、W、R、H、C、D、I之一，第175位的Xaa残基是残基A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、Y、E、W之一，且第241位的Xaa残基是残基A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、F、Y之一。
30.权利要求23-29任一项的枯草杆菌酶，其中第55位的Xaa残基是P且第164位的Xaa残基是L。
31.权利要求23-29任一项的枯草杆菌酶，其中第55位的Xaa残基是P，第164位的Xaa残基是L，且第241位的Xaa残基是Q。
32.权利要求23-31任一项的枯草杆菌酶，其中枯草杆菌酶是枯草杆菌蛋白酶。
33.权利要求32的枯草杆菌酶，其中枯草杆菌蛋白酶是I-S1型的。
34.权利要求32的枯草杆菌酶，其中枯草杆菌蛋白酶是I-S2型的。
35.编码权利要求23-34任一的枯草杆菌酶的DNA序列。
36.包含权利要求35的DNA序列的载体。
37.包含权利要求36的载体的宿主细胞。
38.包含依照权利要求23-34任一项的枯草杆菌酶的组合物。
39.依照权利要求38的组合物，其是清洁组合物。
40.依照权利要求38的组合物，其是个人护理组合物。
全文摘要
本发明涉及具有改变了的免疫原性的枯草杆菌酶变体和枯草杆菌酶，尤其是具有降低了的变应原性的枯草杆菌酶变体和枯草杆菌酶。枯草杆菌酶变体在第57位已修饰，而且在第170、181和247位中的至少一个位点也已修饰。所用的位置编号指来自淀粉液化芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶Novo(BPNAE)的位置。此外，本发明涉及所说枯草杆菌酶变体和枯草杆菌酶的表达及其在诸如洗涤剂和口腔护理产品中的应用。
文档编号C11D3/38GK1662649SQ03814931
公开日2005年8月31日 申请日期2003年6月25日 优先权日2002年6月26日
发明者E·L·罗根, N·T·尼尔松, S·恩斯特, C·安德森, N·W·贝格 申请人:诺和酶股份有限公司