一种利用枯草杆菌生产重组《-环糊精葡萄糖基转移酶的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用枯草杆菌生产重组a-环糊精葡萄糖基转移酶（简称a-CGT酶）的方法，属于基因工程和发酵工程领域。其具体步骤包括：（1)构建软化芽孢杆菌a-CGT酶重组枯草杆菌基因工程菌；(2)优化发酵条件得到培养基关键组分麦芽糖，玉米淀粉和酵母粉最佳浓度分别为：15.5g/L，13g/L和20g/L，将重组枯草杆菌接种于该培养基，摇瓶培养36h后a-CGT酶活性为17.6U/mL，对早日实现枯草杆菌生产CGT酶以满足其在食品中的应用具有积极意义。
【专利说明】一种利用枯草杆菌生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶的 方法
【技术领域】
[0001] 一种利用枯草杆菌生产重组α -环糊精葡萄糖基转移酶的方法，属于基因工程和 发酵工程领域。
【背景技术】
[0002] 环糊精葡萄糖基转移酶（简称CGT酶，EC2. 4. 1. 19)是一种能够催化淀粉、糖原、麦 芽寡聚糖等葡萄糖聚合物而获得环糊精的胞外酶，可分为α-，β-和Υ-三种类型。环糊 精分子具有独特的疏水空腔结构，能包合疏水性客体分子，因此在食品、医药、农业等领域 具有广泛的应用。环糊精的工业化生产均采用酶法合成，在环糊精研究的早期，由于没有筛 选出高效生产CGT酶的菌株而导致环糊精的生产率很低，环糊精的应用受到很大限制。目 前，国外对CGT酶的研究较多，而我国对此酶的研究尚处于起步阶段，基因工程菌的研究不 多。
[0003] 为了克服天然菌株的低CGT酶生产能力，利用DNA重组技术将CGT酶编码基因导 入大肠杆菌和枯草杆菌中过量表达被认为是最有效途径之一。虽然关于外源蛋白表达的研 究枯草杆菌还远远落后于大肠杆菌，但是枯草杆菌属于食品工业安全宿主菌，能将蛋白直 接分泌到胞外，在食品基因工程的研究中具有重要的意义。随着基因工程的飞速发展，相信 枯草杆菌表达系统将更加完善，成为原核蛋白表达的最佳宿主之一。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种利用枯草杆菌生产重组α -环糊精葡萄糖基转移酶的 方法。
[0005] 本发明的技术方案：
[0006] 一种利用枯草杆菌生产重组a -CGT酶的方法，其特征在于包括如下步骤：
[0007] (1)构建软化芽孢杆菌a -CGT酶重组枯草杆菌基因工程菌；
[0008] (2)优化发酵条件得到培养基关键组分麦芽糖，玉米淀粉和酵母粉最佳浓度分别 为：15. 5g/L，13g/L和20g/L，将重组枯草杆菌接种于该培养基，摇瓶培养36h后离心收集上 清液。
[0009] 其中步骤⑴的方法为：
[0010] I.克隆Cgt基因及其自身信号肽的片段：
[0011] 以P. macerans JFB05-01 (菌种保藏在国家典型微生物保藏中心，保藏号：CCTCC M203062)基因组DNA为模板，以P1，P2为引物扩增得到cgt基因及其自身信号肽的片段；
[0012] 正向引物 P1 :5，-ACGAGGAATTCATGAAATCGCGGTAC-3'(含 EcoR I 酶切位点）
[0013] 反向引物 P2 :5' -CGCGGATCCTTAATTTTGCCAGTCCAC-3'(含 BamH I 酶切位点）
[0014] PCR 反应体系：dNTPs 5μ L，IOXEx Taq buffer(Mg2+Plus)5y L，正向引物 Pl(10μM)lμL，反向引物P2(10μM)lμL，模板lμL，ExTaqHS(5U/μL)0·25μL，加入 ddH20 补足 50μ L。
[0015] PCR 反应条件：94°C预变性 4min，94°C变性 45s，60°C退火 45s，72°C延伸 2· 2min， 30个循环后，再于72°C延伸lOmin，扩增得到目的基因PCR片段，割胶回收，回收片段与 PMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109,转化产物涂布含100mg/L氨苄青 霉素的LB平板，经37°C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8-10h后提取质粒，将此 质粒进行序列测定。
[0016] II.构建重组质粒pGJ-cgt :
[0017] 用于构建表达载体的质粒是PGJ103,含麦芽糖诱导型启动子，将该质粒和扩增的 目的基因进行EcoR I和BamH I双酶切，酶切产物割胶回收后再用T4连接酶于16°C连接过 夜，连接产物转化E. coli感受态细胞，经37°C培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素 LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的重组质粒pGJ-cgt。
[0018] III.构建含重组质粒pGJ-cgt的枯草杆菌基因工程菌：
[0019] 将重组质粒pGJ-cgt转化枯草杆菌WB600得到含有软化芽孢杆菌a -CGT酶基因 的重组枯草杆菌基因工程菌。
[0020] 步骤（2)中诱导剂麦芽糖的最佳浓度为15. 5g/L。
[0021] 步骤（2)中碳源为玉米淀粉，最佳浓度为13g/L。
[0022] 步骤（2)中氮源为酵母粉，最佳浓度为20g/L。
[0023] 本发明从食品工业安全宿主菌为出发点，构建了软化芽孢杆菌a-CGT酶重组枯 草杆菌基因工程菌，采用单因素实验确定显著影响因子，并采用响应面中心组成实验法研 究显著影响因子的交互作用并确定各因子的最佳组合，寻找到基因工程菌发酵产酶的最佳 条件，在该最佳条件下，重组酶活性为17. 6U/mL，对早日实现枯草杆菌生产CGT酶以满足其 在食品中的应用具有积极意义。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1构建重组质粒pGJ-cgt
[0025] 以软化芽抱杆菌（Peanibacillus macerans) JFB05-01为模板，以PI, P2为引物扩 增得到cgt基因及其自身信号肽的片段；
[0026] 正向引物 P1 :5，-ACGAGGAATTCATGAAATCGCGGTAC-3'(含 EcoR I 酶切位点）
[0027] 反向引物 P2 :5，-CGCGGATCCTTAATTTTGCCAGTCCAC-3'(含 BamH I 酶切位点）
[0028] PCR 反应体系：dNTPs 5μ L，IOXEx Taq buffer(Mg2+Plus)5y L，正向引物 Pl(10μM)lμL，反向引物P2(10μM)lμL，模板lμL，ExTaqHS(5U/μL)0·25μL，加入 ddH20 补足 50μ L。
[0029] PCR 反应条件：94°C预变性 4min，94°C变性 45s，60°C退火 45s，72°C延伸 2. 2min， 30个循环后，再于72°C延伸lOmin。扩增得到目的基因PCR片段，割胶回收，回收片段与 PMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109,转化产物涂布含100mg/L氨苄青 霉素的LB平板，经37°C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8-10h后提取质粒，将此 质粒进行序列测定。
[0030] 将含麦芽糖诱导型启动子的质粒PGJ103和扩增的目的基因进行EcoR I和BamH I双酶切，酶切产物割胶回收后再用T4连接酶于16°C连接过夜，连接产物转化E. coli感受 态细胞，经37°C培养过夜，挑选转化子于lOOmg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质 粒，得到富集的重组质粒pGJ-cgt。
[0031] 实施例2构建重组枯草杆菌基因工程菌及分泌表达a -CGT酶
[0032] 将重组质粒pGJ-cgt通过化学转化法转化枯草杆菌WB600,在含氯霉素（10 μ g/ mL) LB平板上经37°C培养过夜，挑选转化子在LB培养基中37°C液体培养过夜，然后4% 接种量接入TB发酵培养基，经1. 5 %麦芽糖诱导48h后产酶达到6. lU/mL，发酵上清液经 SDS-PAGE鉴定，在大约72kDa处出现一条蛋白条带。
[0033] 实施例3单因素实验优化CGT酶发酵条件
[0034] 一般情况下，影响重组菌发酵产酶的可能因素很多，包括碳源、氮源、无机盐、培养 基起始PH值、发酵温度、种龄、接种量、装液量等。通过在前期工作中对重组枯草杆菌产酶 发酵条件进行初步优化的基础上，可以确定本研究中影响该重组菌发酵产酶的主要因素为 诱导剂，碳源和氮源，因而通过单因素实验考察了诱导剂浓度（5、10、15、20、25 8/1)，碳源 (葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精和玉米淀粉，浓度按含碳质量分数相等原则），氮源（蛋白 胨、酵母粉、牛肉膏、玉米浆，浓度按含氮质量分数相等原则）对a-CGT酶发酵生产的影响。
[0035] 结果表明，随着麦芽糖浓度的增加，菌体干重逐渐增加，当麦芽糖浓度为15g/L 时，酶活达到最大值6. lU/mL，再增加麦芽糖浓度，酶活并未增加。不同碳源对产酶存在很大 差异，葡萄糖对菌体生长和产酶均不利，玉米淀粉有利于菌体生长和产酶，并且产酶高峰期 提前至36h，当添加浓度为10g/L时，菌体干重和a -CGT酶酶活分别为10g/L和8. 3U/mL。 氮源酵母粉能获得较高的酶活且有利于菌体生长，蛋白胨虽然不能促进产酶，但是比酶活 与酵母粉相当，因而在添加酵母粉的基础上添加4g/L蛋白胨使重组B. subtilis产酶增加 至 12. 5U/mL。
[0036] 实施例4响应面中心组成实验进一步优化CGT酶发酵条件
[0037] 根据以上对营养因素进行单因素实验的结果，选择诱导剂-麦芽糖，碳源-玉米淀 粉，氮源-酵母粉作为响应面设计的因素，每个因素选择三个浓度水平，表1为响应面实验 因素水平安排表。表2列出了 Box-Behnken实验设计下a -CGT酶活性的实验值和模型的 预测值。
[0038] 对实验数据进行方程拟合并进行方差分析，结果较显著，得二阶回归方程Y = 16. 26667+3. 2375XXJ1. 53375ΧΧ2-0. 25375ΧΧ3-3. 7ΧΧ/-2. 75ΧΧ/-2. 04ΧΧ/-0. 0825Χ X1X2-O. WSXX1X3-O. 425XX2X3,其中 Y 为 a -CGT 酶酶活。
[0039] 表1响应面中心组合实验因素水平表 「00401
【权利要求】
1. 一种利用枯草杆菌生产重组α-环糊精葡萄糖基转移酶（简称a-CGT酶）的方法， 其特征在于包括如下步骤： (1) 构建软化芽孢杆菌a -CGT酶重组枯草杆菌基因工程菌； (2) 优化发酵条件得到培养基关键组分麦芽糖，玉米淀粉和酵母粉最佳浓度分别为： 15. 5g/L，13g/L和20g/L，将重组枯草杆菌接种于该培养基，摇瓶培养36h后离心收集上清 液。
2. 根据权利要求1所述的利用枯草杆菌生产重组a-CGT酶的方法，其特征在于步骤 (1) 构建含有软化芽孢杆菌a -CGT酶基因cgt的重组枯草杆菌基因工程菌的方法为： I. 克隆cgt基因及其自身信号肽的片段： 以软化芽孢杆菌（Peanibacillus macerans)JFB05-01为模板，以P1，P2为引物扩增得 到cgt基因及其自身信号肽的片段； 正向引物 P1 :5' -ACGAGGAATTCATGAAATCGCGGTAC-3'(含 EcoR I 酶切位点） 反向引物 P2 :5' -CGCGGATCCTTAATTTTGCCAGTCCAC-3'(含 BamH I 酶切位点） PCR 反应体系：dNTPs 5μ L，IOXEx Taq buffer(Mg2+Plus)5y L，正向引物 Pl(10μM)lμL，反向引物P2(10μM)lμL，模板lμL，ExTaqHS(5U/μL)0·25μL，加入 ddH20 补足 50μ L。 PCR反应条件：94°C预变性4min，94°C变性45s，60°C退火45s，72°C延伸2. 2min，30个 循环后，再于72°C延伸lOmin。扩增得到目的基因PCR片段，割胶回收，回收片段与pMDIS-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109,转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB 平板，经37°C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，S-IOh后提取质粒，将此质粒进行序 列测定。 II. 构建重组质粒pGJ-cgt : 用于构建表达载体的质粒是PGJ103,含麦芽糖诱导型启动子，将该质粒和扩增的目的 基因进行EcoR I和BamH I双酶切，酶切产物割胶回收后再用T4连接酶于16°C连接过夜， 连接产物转化E. coli感受态细胞，经37°C培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB 进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的重组质粒pGJ-cgt ; III. 构建含重组质粒pGJ-cgt的枯草杆菌基因工程菌： 将重组质粒pGJ-cgt转化枯草杆菌WB600得到含有软化芽孢杆菌a -CGT酶基因的重 组枯草杆菌基因工程菌。
3. 根据权利要求1所述的利用枯草杆菌生产重组a-CGT酶的方法，其特征在于步骤 (2) 中诱导剂麦芽糖的最佳浓度为15. 5g/L。
4. 根据权利要求1所述的利用枯草杆菌生产重组a-CGT酶的方法，其特征在于步骤 (2)中碳源为玉米淀粉，最佳浓度为13g/L。
5. 根据权利要求1所述的利用枯草杆菌生产重组a-CGT酶的方法，其特征在于步骤 (2)中氮源为酵母粉，最佳浓度为20g/L。
【文档编号】C12R1/125GK104212776SQ201410440327
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】张佳瑜, 吴敬, 吴丹, 陈晟, 陈坚 申请人:江南大学