一种库特氏菌及微生物菌剂和它们的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种库特氏菌（Kurthia?sp.），其保藏编号为CCTCC?NO.M2013507。本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CCTCC?NO.M2013507的库特氏菌，且所述菌体还包括枯草芽胞杆菌（Bacillus?subtilis）、地衣芽胞杆菌（Bacillcus?lincheniformis）和解淀粉芽胞杆菌（Bacillus?amyloliquefaciens）。本发明还提供了如上所述的库特氏菌和如上所述的微生物菌剂在降解乙草胺中的应用。
【专利说明】—种库特氏菌及微生物菌剂和它们的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物【技术领域】，具体地，涉及一种库特氏菌、一种微生物菌剂和它们的应用。
【背景技术】
[0002]乙草胺是属于广谱、高效的选择性芽前土壤处理除草剂，具有用量少、杀草活性高、选择性强等特性，被广泛用于玉米、棉花、花生和大豆田防除I年生禾本科杂草和某些I年生阔叶杂草，已经成为我国用量最大的3种除草剂之一，但是过量、频繁施用乙草胺已经引起了一定程度的环境污染，改变了生态环境质量，并潜在着威胁了人类健康，美国环保局已经将乙草胺定为B-2类致癌物。控制环境中的乙草胺污染是目前人们关注的一项重要研究内容。
[0003]乙草胺属苯环类物质，苯环结构上带有甲基和乙基和含氯基团，因此使得乙草胺的好氧生物降解性较差，属于难生物降解有机物。目前上缺乏能够有效降解乙草胺的微生物菌株，已有的微生物菌株降解乙草胺的效果仍然较差。
【发明内容】
[0004]为了克服现有的微生物菌株降解乙草胺的效果较差的缺陷，本发明提供了一种库特氏菌,该库特氏菌(Kurthia sp.)的保藏编号为CCTCC N0.M2013507。
[0005]本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CCTCC N0.M2013507的库特氏菌，且所述菌体还包括枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽胞杆菌(Bacillcus lincheniformis)和解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefa·ciens)。
[0006]本发明还提供了如上所述的库特氏菌和如上所述的微生物菌剂在降解乙草胺中的应用。
[0007]通过上述技术方案，本发明可以更加有效地降解乙草胺。
[0008]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0009]生物材料保藏
[0010]本发明的库特氏菌(Kurthia sp.)是本发明的发明人从河北张家口土壤中分离的纯培养物，其保藏编号为CCTCC N0.M2013507，保藏日期为2013年10月24日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，分类命名为库特氏菌(Kurthiasp.)。
【具体实施方式】
[0011]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0012]本发明提供了一种库特氏菌，该库特氏菌(Kurthia sp.)的保藏编号为CCTCCN0.M2013507。
[0013]本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CCTCC N0.M2013507的库特氏菌，且所述菌体还包括枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽胞杆菌(Bacillcus lincheniformis)和解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
[0014]其中，所述微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，优选情况下，每克所述微生物菌剂所含的总活菌数可以为2-20X 107CFU。
[0015]优选地，以活菌体的数目计，相对于每份所述库特氏菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述解淀粉芽胞杆菌的含量为
0.01-0.05份。在该优选情况下，所述微生物菌剂具有更加优良的降解乙草胺的能力。
[0016]根据本发明，所述培养基的种类可以在很大范围内改变，可以为各种能够用于培养库特氏菌、枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌的培养基，例如，可以为牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基、LB培养基等常用培养基作为种子培养基，用于菌种的保存；而发酵的培养基一般用于生产，这些培养基的种类也为本领域技术人员所公知。上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”(Microbiology Culture Media Manual)的记载制备得到。例如，牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15-20g，蒸馏水1000ml，pH值7.0-7.2，121。。灭菌20min ;发酵培养基:葡萄糖15g，淀粉lg，豆饼粉25g，硫酸锰lg，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.5g，酵母膏0.2g，氯化铁0.1g,碳酸钙0.lg, pH值 7.0-7.2，115°C灭菌 15min。
[0017]其中，所述微生物 菌剂的制备方法可以包括:将库特氏菌、枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌分别接种于培养基中进行培养。其中，可以在各自独立的培养体系中分别培养库特氏菌、枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌，并将分别培养得到的微生物按照比例混合。优选情况下，通过在各自独立的培养体系中的培养及培养后的混合，使得到的每克微生物菌剂的总活菌数为2-10X 107CFU。
[0018]根据本发明，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的培养方法没有特别的限制为本领域技术人员所公知，例如，可以先将枯草芽孢杆菌在种子培养基(LB培养基)中培养至菌密度0D_值为0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份的生产培养基(葡萄糖5g，豆柏30g，蛋白胨2g，蒸馏水1000ml, ρΗ7.0-7.2)中接种2-5重量份的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌液，37°C培养,直至枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活菌数为2-20 X IO7个/克的培养基。
[0019]所述地衣芽孢杆菌(Bacillcus lincheniformis)的培养方法没有特别的限制为本领域技术人员所公知，例如，可以先将地衣芽孢杆菌在种子培养基(LB培养基)中培养至菌密度OD6tltl值为0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份的培养基(玉米浆0.45g，蛋白胨1.50g，豆饼粉浸汁为1:15，葡萄糖1.50g，pH值7.5)中接种2_5重量份的地衣芽抱杆菌(Bacillcus lincheniformis)的菌液，37 V培养，直至地衣芽抱杆菌(Bacillcuslincheniformis)的活菌数为2-20X IO7个/克的培养基。
[0020]所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的培养方法没有特别的限制，例如，可以先将解淀粉芽孢杆菌在种子培养基(LB培养基)中培养至菌密度OD6tltl值为
0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份培养基(豆饼粉50g，蔗糖20g，硫酸铵5g，柠檬酸三钠2.5g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.05g，pH7.0-7.2)中接种2_5重量份的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌液,37°C培养,直至解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的活菌数为 2-20X IO7 个 / 克的培养基。
[0021]所述库特氏菌的培养方法没有特别的限制，例如，可以先将库特氏菌在种子培养基(LB培养基)中培养至菌密度OD6tltl值为0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份培养基(葡萄糖15g，淀粉lg，豆饼粉25g，硫酸锰lg，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.5g，酵母膏0.2g，氯化铁0.lg，碳酸钙0.lg，pH7.0-7.2)中接种2_5重量份的库特氏菌的菌液，37°C培养，直至库特氏菌的活菌数为2-20 X IO7个/克的培养基。
[0022]通过在各自独立的培养体系中的培养及培养后按照比例的混合，所述混合的条件没有特别的限制，优选能够使得到的微生物菌剂满足以下条件:以活菌体的数目计，相对于每份所述库特氏菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为
0.05-0.2份，所述解淀粉芽胞杆菌的含量为0.01-0.05份。
[0023]根据本发明，所述枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽胞杆菌(Bacillcuslincheniformis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌种可以通过商购得到。例如，所述枯草芽胞杆菌购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC03221，所述地衣芽胞杆菌购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC02698，所述解淀粉芽胞杆菌购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC10166。
[0024]本发明还提供了如上所述的库特氏菌和如上所述的微生物菌剂在降解乙草胺中的应用。
[0025]以下通过实施例进一步详细`说明本发明:
[0026]实施例1
[0027]本实施例用于说明本发明的库特氏菌及其性能。
[0028]将保藏编号为CCTCC N0.M2013507的库特氏菌(Kurthia sp.)接种到LB培养基(含胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaC110g/L)中，培养至菌密度0D_值为0.6-0.8，得到菌液。
[0029]在LB培养基中加入乙草胺乳油(购自济南绿邦化工有限公司)，加入量使得乙草胺的浓度为100mg/L，得到乙草胺清除测试培养基。
[0030]将3mL上述菌液加入150mL的乙草胺清除测试培养基中，于30°C，180转每分下振荡培养，每隔4h取样按照《DB21/T1546-2007 土壤中乙草胺、丁草胺残留量的测定(气相色谱法)》的规定测定发酵液中乙草胺的浓度。结果显示，发酵液第0、4、8、12、16、20、24小时的乙草胺的浓度分别为95mg/L、89mg/L、82mg/L、78mg/L、70mg/L、65mg/L。由此说明，保藏编号为CCTCCN0.M2013507的库特氏菌能够有效地降解乙草胺。
[0031]对比例I
[0032]将购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC00701 (另一编号为LAM0713)的库特氏菌(Kurthia sp.)接种到LB培养基(含胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaC110g/L)中，培养至菌密度0D_值为0.6-0.8，得到菌液。
[0033]在LB培养基中加入乙草胺乳油(购自济南绿邦化工有限公司)，加入量使得乙草胺的浓度为100mg/L，得到乙草胺清除测试培养基。
[0034]将3mL上述菌液加入150mL的乙草胺清除测试培养基中，于30°C，180转每分下振荡培养，每隔4h取样按照《DB21/T1546-2007 土壤中乙草胺、丁草胺残留量的测定(气相色谱法)》的规定测定发酵液中乙草胺的浓度。结果显示，发酵液第0、4、8、12、16、20、24小时的乙草胺的浓度分别为100mg/L、100mg/L、99mg/L、99mg/L、99mg/L、99mg/L。由此说明购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC00701 (另一编号为LAM0713)的库特氏菌(Kurthia sp.)无法有效地降解乙草胺。
[0035]实施例2
[0036]本实施例用于说明本发明的微生物菌剂及其性能。
[0037](I)在100重量份的培养基(葡萄糖5g，豆柏30g，蛋白胨2g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2)中接种5重量份的枯草芽胞杆菌菌液(购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为03221，在如上相同LB培养基中培养至菌密度0D_值为0.6-0.8，得到菌液)，37°C培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至枯草芽胞杆菌的活菌数为2 X IO7CFU/克的培养基。
[0038](2)在100重量份的培养基(玉米浆0.45g，蛋白胨1.50g，豆饼粉浸汁为1:15，葡萄糖1.50g, pH值7.5)中接种5重量份的地衣芽胞杆菌菌液(购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为02698，在如上相同LB培养基中培养至菌密度0D_值为0.6-0.8，得到菌液)，37°C培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至地衣芽胞杆菌的活菌数为2 X IO7CFU/克的培养基。
[0039](3)在100重量份的培养基(豆饼粉50g，蔗糖20g，硫酸铵5g，柠檬酸三钠2.5g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.05g,pH7.0-7.2)接种4重量份的解淀粉芽胞杆菌菌液(购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为10166，在如上相同LB培养基中培养至菌密度0D_值为0.6-0.8，得到菌液)，37°C培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至解淀粉芽胞杆菌的活菌数为2 X IO7CFU/克的培养基。
·[0040](4)在100重量份的培养基(葡萄糖15g，淀粉lg，豆饼粉25g，硫酸锰lg，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.5g，酵母膏0.2g，氯化铁0.lg，碳酸钙0.lg，pH7.0-7.2)中接种5重量份的库特氏菌菌液(保藏编号为CCTCC N0.M2013507，在如上相同LB培养基中培养至菌密度OD600值为0.6-0.8，得到菌液)，37°C培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至库特氏菌的活菌数为2 X IO7CFU/克的培养基。
[0041](5)将步骤(1)至(4)中分别得到的枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、库特氏菌按照比例进行混合，混合比例使得到的微生物菌剂中，以活菌体的数目计，相对于每份所述库特氏菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.1份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.1份，所述解淀粉芽胞杆菌的含量为0.03份，得到本实施例的微生物菌剂。
[0042]实施例3
[0043]本实施例用于说明本发明的微生物菌剂及其性能。
[0044]按照实施例2的方法，将步骤(1)至(4)中分别得到的枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、库特氏菌按照比例进行混合，所不同的是，混合比例使得到的微生物菌剂中，以活菌体的数目计，相对于每份所述库特氏菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.5份,所述解淀粉芽胞杆菌的含量为0.05份,得到本实施例的微生物菌剂。
[0045]实施例4[0046]本实施例用于说明本发明的微生物菌剂及其性能。
[0047]按照实施例2的方法，将步骤(1)至(4)中分别得到的枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、库特氏菌按照比例进行混合，所不同的是，混合比例使得到的微生物菌剂中，以活菌体的数目计，相对于每份所述库特氏菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.05份，所述解淀粉芽胞杆菌的含量为0.01份，得到本实施例的微生物菌剂。
[0048]实施例5
[0049]本实施例用于说明本发明的微生物菌剂及其性能。
[0050]按照实施例2的方法，将步骤(1)至(4)中分别得到的枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、库特氏菌按照比例进行混合，所不同的是，混合比例使得到的微生物菌剂中，以活菌体的数目计，相对于每份所述库特氏菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为5份，所述解淀粉芽胞杆菌的含量为1份，得到本实施例的微生物菌剂。
[0051]实施例6
[0052]本实施例用于说明本发明的微生物菌剂及其性能。
[0053]按照实施例2的方法制备微生物菌剂，不同的是，将步骤(2)至(4)中分别得到的地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、库特氏菌按照比例进行混合，但不加入枯草芽胞杆菌，得到本实施例的微生物菌剂。
[0054]对比例2
[0055]按照实施例2的方法制备微生物菌剂，不同的是，所用的库特氏菌为购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC00701 (另一编号为LAM0713)的库特氏菌(Kurthiasp.)。
[0056]测试实施例1
[0057]本测试实施例通过土壤培养实验测定实施例2-6和对比例2的微生物菌剂在降解乙草胺中的效果。
[0058]土壤培养使用的基质土壤购自北京花卉市场的花卉土，土壤有机质含量10.24g/kg、全氮 0.561g/kg、全磷 1.14g/kg、全钾 14.98g/kg、速效氮 39.19mg/kg、速效磷 16.26mg/kg、速效钾160.07mg/kg、pH6.5。并且,在基质土壤中添加乙草胺乳油(购自济南绿邦化工有限公司)，加入量使得乙草胺的含量为100mg/kg，得到实验土壤。土壤培养盆的试验盆高21cm、上直径20cm、下直径13cm，每盆加土 3.8kg，分别加入实施例2_6和对比例2的微生物菌剂 0.05kg。
[0059]将土壤培养盆在20°C下培养，每隔7天取样按照《DB21/T1546-2007 土壤中乙草胺、丁草胺残留量的测定(气相色谱法)》的规定测定土壤中乙草胺的浓度结果如表1所
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[0060]表1
[0061]
【权利要求】
1.一种库特氏菌，其特征在于:该库特氏菌(Kurthia sp.)的保藏编号为CCTCCN0.M2013507。
2.一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，其特征在于:所述菌体包括保藏编号为CCTCC N0.M2013507的库特氏菌，且所述菌体还包括枯草芽胞杆菌(Bacillussubtil is)、地衣芽胞杆菌(Bacillcus lincheniformis)和解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于:每克所述微生物菌剂所含的总活菌数为 2-20X 107CFU。
4.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于:以活菌体的数目计，相对于每份所述库特氏菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述解淀粉芽胞杆菌的含量为0.01-0.05份。
5.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于:所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基和LB培养基中的至少一种。
6.权利要求1所述的库特氏菌和权利要求2-6中任意一项所述的微生物菌剂在降解乙草胺中的应用。
【文档编号】A62D3/02GK103789226SQ201310626560
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】阮志勇, 赵斌, 王彦伟, 宋金龙, 赵秉强, 李燕婷, 孔德龙, 刘艳伟, 王慧敏, 陈小蓉, 刘小飞 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所