一种农药降解菌制剂及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了甘蔗渣在制备农药降解菌制剂中的应用，提供了一种农药降解菌制剂及其制备方法和应用。该农药降解菌制剂包含有以下组分：（1）对农药有降解作用的菌株（如短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）HZ-2菌株，2013年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2013380）；（2）微生物制剂载体：甘蔗渣。本发明农药降解菌制剂使用甘蔗渣作为微生物制剂载体，以葡萄糖或糖蜜为辅料，极大地提高了工业废料的利用率，成本低，且为制剂中的微生物提供了稳定碳源，保证制剂的持效性。该农药降解菌制剂使用简单，降解效果好，具有很好的推广应用价值。
【专利说明】一种农药降解菌制剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物菌剂及农药降解【技术领域】。更具体地，涉及一种农药降解菌制剂及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]农药的过量使用对食品安全、农作物药害及有害生物抗性发展等问题已经引起了全球广泛关注，同时农药的大量富集对地表水、地下水以及海洋环境造成了巨大威胁，最终将影响人类的生存环境和身体健康。在现代农业生产中，政府及农业科学家们都极力提倡采用病虫害综合防治(Integrated Pest Management, IPM),综合农业耕作、物理、生防等措施，降低化学防治的比重和频率，改变用破坏生态环境来换取经济发展的陈旧模式，在可持续地防治病虫草害的同时，稳步发展农业生产与经济。可是，推陈出新的农药品种和逐年增长的农药产量却揭示了一个不可回避的事实，化学药剂在作物病虫草治理中仍占据不可动摇的重要地位。
[0003]我国是农业大国，农药的生产与使用量占世界总量的十分之一，施入农田的农药大部分残留于土壤环境介质中。农药本身虽具有不同程度的自然降解特性，但长时间大量使用必然导致环境污染；此外，有些农药由于自身特性的原因，降解周期长，且有一些种类其自身降解产物毒性更甚，因此，农药在自然界中的残留富集存在生态环境安全隐患，危害水体生态及非靶标生物等。如何降低或消除农药在环境中的累积，从而杜绝生态安全问题的发生，已经成为许多国家和地区亟待解决的问题。 [0004]开发土壤农药残留治理新技术是消除农药生态隐患的关键，应着眼于农药污染源的控制及农药残留的修复。利用微生物修复污染土壤是解决农药残留富集的新方法、新途径，自然界微生物资源极为丰富，微生物修复法因其具有二次污染少、操作简单、成本低等优势，拥有修复生态环境中农药污染的强大潜力，值得深入研究开发。
[0005]微生物修复农药污染土壤的技术难点在于微生物制剂的开发与研制。如何将活性微生物集中、固定在制剂中，保证微生物的活性，同时对环境友好，对人畜无害，是开发农药降解菌制剂的突破口和关键之处。由于传统农药剂型中各种助剂对微生物有机体的优劣影响并不明确，因此传统农药剂型的配制并不完全适用于微生物剂型的开发。
[0006]甘蔗渣以及糖蜜等作为低碳环保、资源丰富的制糖工业废料，已在发酵生产乙醇、木糖醇等工业中成熟运用，而其在农药降解菌制剂中的应用未见报道。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是克服现有农药降解菌制剂的技术不足，提供一种甘蔗渣在制备农药降解菌制剂中的应用。
[0008]本发明的另一目的在于提供一种农药降解菌制剂。
[0009]本发明的再一目的是提供所述农药降解菌制剂的制备方法。
[0010]本发明还有一个目的是提供所述农药降解菌制剂的应用。[0011 ] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现:
本发明提供甘蔗渣在制备农药降解菌制剂中的应用。本发明将甘蔗渣制成微生物制剂所需载体，不仅实现了能源再利用，也降低了生物制剂影响环境的风险。
[0012]本发明同时提供一种农药降解菌制剂，包含以下组分:(1)对农药有降解作用的菌株；(2)微生物制剂载体甘蔗渣。
[0013]组分(I)所述菌株可采用对农药有降解作用的常规菌。优选地，本发明提供一种最为优选的技术方案，所述菌株为短小芽孢杆菌pumilusm HZ-2菌株，菌种保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址是，湖北省武汉市武汉大学，保藏日期是2013年9月6日，菌种保藏编号为CCTCC NO:M 2013380。
[0014]组分(2)所述的甘蔗渣为制糖工业废料甘蔗渣或经其他途径所得的甘蔗渣。
[0015]本发明所述农药降解菌剂使用普通的甘蔗渣就能达到非常好的效果，优选地，甘蔗渣经物理粉碎至粒径大小为20~200目，或经化学改性后，改性甘蔗渣具有更好的吸水性和缓释性。
[0016]所述化学改性的方法为:
S1.将甘蔗渣浸泡在含20%氢氧化钠溶液的烧杯中，于室温下搅拌I h，留置过夜后过滤，用蒸馏水冲洗蔗渣至PH值为8、之间，记为碱化蔗渣(BSB)。
[0017]S2.将碱化蔗渣(BSB)置于三角瓶中，加入乙醇及环氧氯丙烷，与温度器、冷凝器及磁性搅拌器一同放入60 °C油浴，24 h，所得蔗渣记为醚化蔗渣(ESB)。
[0018]S3.将四乙烯五胺缓慢倒入醚化蔗渣(ESB)，保持60 °C反应，24 h后，于60 °〇真空干燥器中干燥12 h，制得改性甘蔗渣(MSB)。
[0019]化学改性的过程图示如`附图9所示。
[0020]优选地，所述农药降解菌制剂还包含有辅料，所述的辅料为工业废料葡萄糖或糖蜜或其他来源的糖蜜；按照质量百分含量计，所述辅料添加至农药降解菌制剂后的浓度为1%~95%。
[0021]本发明采用废糖蜜或葡萄糖作为本发明农药降解菌剂的辅料，为菌剂中的微生物提供了稳定的针对性的碳源，以保证制剂持效性。同时极大程度地提高了工业废料的利用率。
[0022]本发明同时提供该农药降解菌制剂的制备方法，包括以下步骤:
51.将农药降解菌活化，接种于液体LB培养基中，震荡培养至对数期；
52.将SI所得菌液离心后去掉上清液，加入无菌水，制成菌种液；
53.将S2所得菌种液接入上述甘蔗渣中，密封，震荡挂膜，离心，常温真空干燥至近干，分装密封。
[0023]优选地，在将S2所得菌种液接入甘蔗渣中后加入辅料工业废料葡萄糖或糖蜜。
[0024]SI所述降解菌活化采用常规菌株活化方法，活化后培养。
[0025]作为优选，本发明提供培养方法如下:按降解菌不同种的属性可采用冷冻保存法保存，将农药降解菌的菌种活化，接种针挑取菌株接种，接种于斜面培养基，28 °C生化培养箱中培养，菌种长满斜面后，移至4 1:冰箱保存；菌种可采用液体石蜡保存法，将菌种在培养基中培养得到健壮的菌体或孢子，用灭菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端Icm为准，使菌种与空气隔绝，将试管直立，4°C下保存。选择菌种适宜培养基。按照如下配方配制LB培养基:氯化钠:10 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L ;按照如下配方配制PDA培养基:马铃薯:200 g/L ;葡萄糖:20 g/L。按照如下配方配制查彼氏培养基:硝酸钠:2 g/L，氯化钾:0.5 g/L，硫酸镁:0.5 g/L，磷酸氢二钾:1.0 g/L，硫酸铁:0.01 g/L，蔗糖:30.0 g/L。在pH 7.0的液体培养基中，接入体积比1%的湿菌体，在气浴恒温振荡器中培养1~7 do
[0026]S2所述无菌水的加入量为l(T20mL。
[0027]S3所述菌种液、甘蔗渣、辅料的用量按照以下比例确定:在每Ig甘蔗渣中，按照I X IO7^l X IO10 cfu/mL的接种量接入S2所得菌种液I mL~5mL ;按照质量百分含量计，加入1%~95%废糖蜜或葡萄糖。
[0028]S3所述的震荡挂膜方法如下:在气浴恒温振荡器中震荡培养24-48小时，使菌体挂膜于甘鹿洛。
[0029]本发明提供了所述农药降解菌制剂在降解农药中的应用。
[0030]优选地，当农药降解菌制剂中菌株为短小芽孢杆菌(ifeci77i/5.pumilus)的HZ-2菌株时，所述的农药为硝磺草酮。
[0031]本发明具有以下有益效果:
本发明为工业废料甘蔗渣提供了一种全新的应用，将其应用于制备农药降解菌制剂。本发明农药降解菌制剂制备过程中使用了甘蔗渣作为微生物制剂载体，不仅实现了能源再利用，低碳环保、成本低廉、资源丰富、操作简便，也降低了生物制剂影响环境的风险，无二次污染，为微生物制剂开发提供了新的载体材料。
[0032]本发明提供的农药降解菌制剂可以使农药田间残留量降低75%以上，具有较高的降解效果，成功地解决了农产品种植过程中除草剂的使用与消除农药环境富集的矛盾，对保证作物、土壤、水体、非靶标生物及生态环境安全具有重大意义。
[0033]本发明进一步提供了工业废料葡萄糖或糖蜜的新应用，本发明所述农药降解菌制剂添加了工业废料葡萄糖或糖蜜作为农药降解菌制剂的辅料，极大程度地提高了工业废料的利用率，且为制剂中的微生物提供了稳定碳源，能够保证制剂的持效性，该菌剂在施用21d后仍能具有很高的降解率，保持田间目标农药残留量处于低水平。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为环境电镜下扫描固菌前的甘蔗渣表面形态。
[0035]图2为环境电镜下扫描固菌前的甘蔗渣维管束形态。
[0036]图3为环境电镜下扫描固菌前的甘蔗渣维管束剖面形态。
[0037]图4为环境电镜下扫描固菌后的甘蔗渣维管束形态。
[0038]图5为环境电镜下扫描固菌后的甘鹿洛表面降解菌株的分布情况。
[0039]图6为环境电镜下扫描固菌后的甘蔗渣维管束内降解菌株的分布情况。
[0040]图7为降解菌制剂在LB培养基中对硝磺草酮的降解作用。
[0041]图8为降解菌制剂和菌液对硝磺草酮田间降解作用的比较。
[0042]图9为改性甘蔗渣MSB的制作过程示意图。
【具体实施方式】[0043]以下结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本【技术领域】常规试剂和设备。
[0044]实施例1制作过程改性甘蔗渣MSB
甘蔗渣经化学改性制备得到改性甘蔗渣MSB，经化学改性后的改性甘蔗渣具有更好的吸水性和缓释性。
[0045]所述化学改性的方法为:
51.将10g甘蔗渣浸泡在含20%氢氧化钠溶液的500 mL烧杯中，于室温下搅拌I h，留置过夜后过滤，用蒸馏水冲洗蔗渣至pH值为8-9之间，备用，记为碱化蔗渣(BasifiedSugarcane Bagasse, BSB)。
[0046]S2.将10.0 g BSB置于500 mL三角瓶中，加入200 mL乙醇及40 mL环氧氯丙烷(Chloroepoxy propane),与温度器,冷凝器及磁性搅拌器一同放入60 °C油浴,24 h,所得鹿禮:记为醚化鹿禮:(Etherified Sugarcane Bagasse, ESB)。
[0047]S3.将40 mL四乙烯五胺(ΤΕΡΑ)缓慢倒入ESB，保持其于60 °C反应。24 h后，于60 °C真空干燥器中干燥12 h,制得改性甘鹿洛(Modified Sugarcane Bagasse, MSB)。
[0048]改性甘蔗渣MSB的制作过程图示如附图9所示。
[0049]实施例2农药降解菌制剂的制备
1、材料
(I)所用甘蔗渣为制糖工业废料蔗渣，经机械粉碎至粒径大小为60目。
[0050](2)所用菌株为短小芽孢杆菌(MaciIIus pumilus、饱HZ-2菌株,菌种保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址是，湖北省武汉市武汉大学，保藏日期是2013年9月6日，保藏编号为CCTCC NO:M 2013380。
[0051]2、制备步骤如下:
将菌株HZ-2的菌种在培养皿上活化，接种于试管斜面；活化方法为常规菌株活化方法。
[0052]S1.将上述斜面上的单菌落接种于LB液体培养基摇瓶中，震荡培养至对数期得菌液；LB液体培养基为常规的培养基；
52.将SI所得菌液以4800r/min离心lOmin，去上清液，加入l(T20mL无菌水，初步制成液体剂型菌种液；
53.在每Ig甘蔗渣中，按照IX 109cfu/mL的接种量接入S2所得菌种液2mL，按照质量百分含量计，加入5%废糖蜜，密封，在气浴恒温振荡器中震荡挂膜24h后，离心，常温真空干燥至近干，分装密封。
[0053]实施例3农药降解菌制剂的制备
1、材料
(I)所用甘蔗渣为实施例1制备的改性甘蔗渣MSB。
[0054](2)所用菌株为蜡状芽孢杆菌cerem)，华南农业大学昆虫毒理研究室保存。
[0055]2、制备步骤如下:
将菌株蜡状芽孢杆菌cerem)的菌种在培养皿上活化，接种于试管斜面；活化方法为常规菌株活化方法。[0056]S1.将上述斜面上的单菌落接种于LB液体培养基摇瓶中，常温下震荡培养至对数期得菌液；LB液体培养基为常规的培养基；
S2.将SI所得菌液以4800r/min离心lOmin，去上清液，加入l(T20mL无菌水，初步制成液体剂型菌种液；
S3.在每Ig甘蔗渣中，按照IX IO7 cfu/mL的接种量接入S2所得菌种液2 mL,按照质量百分含量计，加入85%废葡萄糖，密封，在气浴恒温振荡器中震荡挂膜26h后，离心，常温真空干燥至近干，分装密封。
[0057]实施例4甘蔗渣对降解菌HZ-2的固定能力
将本发明实施例2~3随机选取一种所得降解菌制剂置于扫描电镜,进行环境电镜扫描观察，得到其固菌形态，结果见附图1~附图6。
[0058]附图1、附图2和附图3为固菌前的甘蔗渣形态；附图4、附图5和附图6为固菌后的蔗渣和菌体形态。
[0059]结果显示，固菌前甘蔗渣呈圆柱状、表面不光滑(如附图1所示)，导管清晰，伴有破损及碎片(如附图2、附图3所示)，应为物理粉碎时对蔗渣组织造成机械损伤。
[0060]固菌后甘蔗渣表面形态及导管无明显变化(如附图4所示)，菌体大量附着在蔗渣表面(如附图5所示)及导管内(如附图6所示)，分布广泛，清晰可见，说明降解菌能够在载体甘蔗渣中迅速富集固定。
[0061]实施例5本发明降解菌制剂对硝磺草酮的降解效果 本实施例中硝磺草酮为市购。
[0062]将实施例2制备的降解菌制剂按体积分数1%分别接种至初始浓度25、50、100、200mg/L的硝磺草酮LB液体培养基中，分别在培养2d、3d和4d后，高效液相色谱法检测农药残留情况，结果如附图7所示。
[0063]结果显示，培养3d后，各浓度硝磺草酮降解率均为80%~95%。
[0064]培养4d后，残留量分别为1.17mg/L、l.01mg/L、2.29mg/L和2.84mg/L,降解率分别为 95.31%、97.99%、97.71% 和 98.58%。
[0065]实验结果说明，本发明降解菌制剂对起始浓度为25~200 mg/L的硝磺草酮均有突出的降解能力，能在短时间内迅速降低硝磺草酮残留量。
[0066]实施例6本发明降解菌制剂田间降解硝磺草酮试验 本实施例中硝磺草酮为市购。
[0067]选取未施用除草剂的玉米田，划分小区，每小区面积不小于20 m2，3个重复。将40%的硝磺草酮悬浮剂，配制为100 mg/L水溶液，按照50 L/667 m2的用量，均匀喷施于田间。
[0068]2 h后，分别施用实施例2制备的降解菌制剂和单纯菌液，并设立空白对照CK，按照五点取样法选取五个时间点进行取样分析，计算降解率，评价降解菌制剂对硝磺草酮的田间降解效果。结果如附图8所示。
[0069]结果显示，处理21d后，降解菌制剂的降解率达到75.13%，并且降解率显著高于单纯菌液处理的降解率，表明本发明方法制得的降解菌制剂，加入甘蔗渣作为有效的生物载体，能够显著的提高降解菌的降解作用，具有很高的降解效果。
【权利要求】
1.甘蔗渣在制备农药降解菌制剂中的应用。
2.一种农药降解菌制剂，其特征在于，包含以下组分:(1)可用于降解农药的菌株；(2)微生物制剂载体； 所述微生物制剂载体为权利要求1所述甘蔗渣。
3.根据权利要求2所述农药降解菌制剂，其特征在于，所述的菌株为短小芽孢杆菌{Bacillus pumilus)的HZ-2菌株,菌种保藏单位为中国典型培养物保藏中心,保藏单位地址是，湖北省武汉市武汉大学，保藏日期是2013年9月6日，菌种保藏编号为CCTCC NO:M2013380。
4.根据权利要求1或2所述农药降解菌制剂，其特征在于，所述的甘蔗渣为制糖工业废料甘蔗渣。
5.根据权利要求4所述农药降解菌制剂，其特征在于，所述的甘蔗渣经物理粉碎至粒径大小为20~200目，或经化学改性； 所述化学改性的方法为: 51.将甘蔗渣浸泡在含20%氢氧化钠溶液的烧杯中，于室温下搅拌Ih，留置过夜后过滤，用蒸馏水冲洗蔗渣至PH值为8、之间，记为碱化蔗渣； 52.将碱化蔗渣置于三角瓶中，加入乙醇及环氧氯丙烷，与温度器、冷凝器及磁性搅拌器一同放入60 °C油浴，24 h，所得蔗渣记为醚化蔗渣； 53.将四乙烯五胺缓慢倒入醚化蔗渣，保持60°C反应，24 h后，于60 °C真空干燥器中干燥12 h，制得改性甘蔗渣。
6.根据权利要求2所述农药降解菌制剂，其特征在于，还包含有辅料，所述的辅料为工业废料葡萄糖或糖蜜；` 按照质量百分含量计，所述的辅料浓度为19^95%。
7.—种权利要求2所述农药降解菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 51.将农药降解菌活化、接种于液体LB培养基中，震荡培养至对数期； 52.将SI所得菌液离心后去掉上清液，加入无菌水，制成菌种液； 53.将S2所得菌种液接入甘蔗渣中，密封，震荡挂膜，离心，常温真空干燥至近干，分装密封。
8.根据权利要求7所述农药降解菌制剂的制备方法，其特征在于，将步骤S2所得菌种液接入甘蔗渣中后加入辅料工业废料葡萄糖或糖蜜。
9.权利要求2所述农药降解菌制剂在降解农药中的应用。
【文档编号】A62D3/02GK103667240SQ201310620600
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】钟国华, 刘婕, 蒋刚彪, 翁群芳, 肖盈 申请人:华南农业大学