一种海藻糖的生产方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用基因工程菌将麦芽糖转化成海藻糖的方法。其技术方案是将天蓝色链霉菌（Streptomycescoelicolor,AS4.1061）海藻糖合成酶基因展示在毕赤酵母表面构建具有酶活力的基因工程菌，通过该基因工程菌的扩增培养使海藻糖合成酶产量大幅增加，将该展示了海藻糖合成酶的基因工程菌加入麦芽糖或淀粉转化的麦芽糖浆中于25~45℃下反应1~8h后，可将麦芽糖转化为海藻糖，转化麦芽糖的产物中海藻糖含量可达80%，且该基因工程菌经分离、洗涤、脱水处理后可重复用作催化剂。从而克服了海藻糖合成酶难以大量生产、不易提取和难以固定化重复利用的技术困难。
【专利说明】一种海藻糖的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品加工和生物【技术领域】，具体涉及一种利用基因工程菌将麦芽糖转 化成海藻糖的方法。
【背景技术】
[0002] 海藻糖（Trehalose)和还原性二糖麦芽糖是同分异构体，它是由两分子葡萄糖以 α，α-1，1-糖苷键相连而成的非还原性二糖，由于其具有对生物体优良的抗逆保护作用等 优良性能而被誉为"生命之糖"和"二十一世纪的新型糖类"，其大规模制造方法受到广泛关 注；专利公布号为CN 102154326 Α的中国专利报道了一种将天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor, AS 4. 1061)海藻糖合成酶（Trehalose synthase, TS)基因克隆到大肠杆菌 中扩增培养进而破壁取酶将麦芽糖转化为海藻糖的生产方法，该方法虽然比之前有很大进 步，但明显存在需要破壁取酶、酶量不多以及所取酶难以重复利用的不足。
[0003] 另一方面，展示酶的酵母菌细胞具有固定化酶可重复使用的优点，又具有制备简 单，可高密度培养获得大量菌体，成本较低的特点，因而自上世纪末问世以来，发展迅猛，已 有许多种蛋白或酶被成功表达的报道，该技术关键在于能否构建展示在酵母表面具所需活 性蛋白或多肽且能扩增生产的基因工程菌，目前尚未见酵母菌展示海藻糖合成酶的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是构建在酵母菌表面展示有活性的海藻糖合成酶基 因工程菌，从而克服海藻糖合成酶难以大量生产、不易提取和难以固定化重复利用的技术 难题。
[0005] 本发明采取的技术方案是：在查阅大量资料的基础上选择一些活性高的海藻糖 合成酶序列委托生物公司进行序列合成和多个相关基因工程菌构建，然后通过多次验证实 验，构建了序列为SEQ N01天蓝色链霉菌海藻糖合成酶基因展示在毕赤酵母表面的基因工 程菌，通过该基因工程菌的发酵培养获得大量酵母菌展示海藻糖合成酶，将该展示了海藻 糖合成酶的酵母菌加入麦芽糖中反应，即可将麦芽糖转化为海藻糖。
[0006] 其中的基因工程菌具体而言可以这样构建：将序列为SEQ N01的天蓝色链霉菌海 藻糖合成酶基因克隆在PUC57载体上，进一步亚克隆到pPIC9K载体中，再转化到毕赤酵母 GS115,得到展示了天蓝色链霉菌海藻糖合成酶的毕赤酵母，然后依次在YH)和BMGY培养基 中分别扩增培养16~32 h及96~120 h，离心脱水或冷冻干燥即得到展示天蓝色链霉菌海藻 糖合成酶毕赤酵母基因工程菌。
[0007] 以重量计将该展示了海藻糖合成酶的酵母菌1飞份(湿重)加入100份麦芽糖中于 25~45°C下反应Γ6 h后，可将麦芽糖或淀粉制备的麦芽糖浆转化为海藻糖。反应后将海藻 糖浆和酵母菌分离即可得海藻糖产品和酵母菌，该酵母菌通过冲洗过滤后可重复用来催化 麦芽糖转化为海藻糖。
[0008] 本发明与现有技术相比，转化麦芽糖的产物中海藻糖含量可达80%，反应后分离所 得基因工程菌通过冲洗过滤后可重复用来催化麦芽糖转化为海藻糖，重复使用6次后，其 酶活力仍保持在81. 8%，因而大大降低了生产成本。
[0009]
【具体实施方式】
[0010] 以下通过具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限 于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
[0011] 实施例1毕赤酵母展示天蓝色链霉菌海藻糖合成酶 1、天蓝色链霉菌海藻糖合成酶基因 （Trehalose synthase, TS)合成委托生物公司（本 例由南京金斯瑞生物科技有限公司）完成，基因克隆在PUC57载体上（pUC57-TS)，DNA序列 如SEQN01所示。
[0012] 2、TS亚克隆到pPIC9K载体中 分别将PUC57-TS和pPIC9K载体进行Eco RI和Not I双酶切，酶切反应体系分别如下： PUC57-TS 质粒 34 ul 10* buffer 4 ul Eco RI 1 ul Not I 1 ul 总共40ul体系， pPIC9K 质粒 6 ul 10^ buffer 2 ul Eco RI 1 ul Not I 1 ul ddH20 10 ul 总共20 ul体系， 分别混勾后放在37 C水浴锅中反应4 h。
[0013] 3、采用胶回收试剂盒回收目的基因片断TS和PPIC9K载体片断，分别用20 ul水洗 脱， 之后用T4 DNA Ligase进行连接反应，反应体系如下： TS片段 3ul PPIC9K 片段 1 ul 10* T4 Ligase buffer 2 ul T4 Ligase 1 ul ddH20 13 ul 总共20 ul体系；22°C过夜连接，之后转化到DH5a感受态细胞中，涂布在含有amp和 kana 抗性的 LB (Miller broth (l%NaCl) :1% peptone, 0.5% yeast extract, and l%NaCl) 固体培养基上进行37°C过夜培养；挑取克隆进行摇菌，质粒抽提，并进行Eco RI和Not I双 酶切鉴定； 酶切反应体系如下： pPIC9K- TS 8 ul 10^ buffer 2 ul Eco RI 1 ul Not I 1 ul ddH20 8 ul 总共20 ul体系， 混匀后放在37°C水浴锅反应4 h，成功构建pPIC9K-TS载体。
[0014] 4、pPIC9K_TS转化到毕氏酵母GS115中 1)、试剂 (1) lMLiCl :用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌； (2) 50% PEG3350 :Sigma P3640用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的 瓶子分装； (3) 2 mg/ml salmon sperm DNA / TE (10mMTris-Cl，ρΗ8· 0，1. OmMEDTA)-2CTC保存； 注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；2)、 毕氏酵母的转化 (1) 煮沸1 ml鲑鱼精DNA 5 min，迅速冰浴以制备单链担体DNA ; (2) 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液； (3) 对于每一个转化，按以下顺序加入： 50% PEG3350 240 ul 1 M LiCl 36 ul 2 mg/ml 单链 Salmon sperm DNA 25 ul 5 ?10 ug/50ul H20 质粒 DNA 50 ul (4) 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1 min); (5) 3〇1：水浴孵育3〇1^11; (6) 42°C水浴热休克20?25 min ; (7) 6000?8000 rpm离心收集酵母菌体； (8) 重悬酵母于lml YH)培养基（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖)，30°C摇床孵育； (9) 1?4 h后，取25?100 ul菌液铺YD选择性培养基平板（1. 67%YNB+2%葡萄糖+1% 琼脂粉），于30°C培养2?3天鉴定(将表达菌株和对照菌株在固体培养基平板，30°C培养 至转化子出现）； 3)备注： (1) YPD、YD、BMGY培养基均可从化学试剂商店订购； (2) GS115是组氨酸缺陷性菌，因此在YD培养基上不能生长，只有成功转化了 pPIC9K 的GS115菌才能在YD培养基上生长。
[0015] 实施例2基因工程菌扩增培养 1、 从平板中挑取单菌落，接种于Yro培养基中，30°C，250 rpm培养过夜； 2、 按1%的接种量转移到新鲜的BMGY培养基中，30°C，250 rpm培养5 d，每隔24 h加甲 醇诱导，收集发酵菌体，用PH8. 0缓冲液洗涤3次，用少量缓冲液重悬，即得重组海藻糖合成 酶基因工程菌菌液，将其离心脱水或冷冻干燥备用。
[0016] 实施例3利用麦芽糖浆生产海藻糖 将纯麦芽糖，用pH7. 0的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成的缓冲液制成含30%麦芽糖的 反应底物，ΡΗ7. 0,取1升配制好的反应底物放入不锈钢反应罐中，控制温度为30°C左右，按 6%糖液重量(体积约0.03升)计加入实施例2中的展示了海藻糖合成酶的基因工程菌菌剂， 反应4 h后，然后用HPLC对反应产物进行各种糖含量的分析，结果为海藻糖23. 2%、麦芽糖 4. 9%、葡萄糖1. 4%，按1升30%的麦芽糖+0. 03升酶液估算底物浓度为29. 1%，总转化率为 23. 2/29. 1=79. 7%，即转化麦芽糖的产物中海藻糖含量可达80% ;反应后将海藻糖和酵母菌 分离即可得海藻糖产品和酵母菌，该酵母菌通过冲洗过滤后可重复用来催化麦芽糖转化为 海藻糖，重复使用6次后，其酶活力如表1所示，仍保持在81. 8% : 表1重复使用后酵母展示海藻糖合成酶的相对酶活力
【权利要求】
1. 一种海藻糖的生产方法，包括：利用海藻糖合成酶将麦芽糖转化为海藻糖，其特征 是：将序列为SEQ N01的天蓝色链霉菌海藻糖合成酶基因展示在毕赤酵母表面构建酵母展 示海藻糖合成酶基因工程菌，接着将其扩增培养，然后将该扩增培养的基因工程菌加入麦 芽糖浆或淀粉制备的麦芽糖浆中，即可将麦芽糖转化为海藻糖。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征是：展示了天蓝色链霉菌海藻糖合成酶的毕赤 酵母基因工程菌是这样制作的：将序列为SEQ N01的天蓝色链霉菌海藻糖合成酶基因克隆 在PUC57载体上，进一步亚克隆到pPIC9K载体中，再转化到毕赤酵母GS115,得到展示了 天蓝色链霉菌海藻糖合成酶的毕赤酵母，然后依次在YH)和BMGY培养基中分别扩增培养 16~32 h及96~120 h，离心脱水或冷冻干燥即得到展示天蓝色链霉菌海藻糖合成酶毕赤酵母 基因工程菌菌体。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：以重量计将该展示了海藻糖合成酶的 毕赤酵母工程菌1飞份(湿重)加入100份反应底物麦芽糖浆中于25~45°C下反应1~8 h后， 可将麦芽糖转化为海藻糖；反应后将海藻糖浆和酵母菌分离即可得海藻糖产品和展示海藻 糖合成酶毕赤酵母基因工程菌，该基因工程菌通过冲洗过滤后可重复用来催化麦芽糖转化 为海藻糖。
【文档编号】C12N15/81GK104046665SQ201410322484
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】谢定, 盛敏, 谢易真, 俞健, 盛灿梅 申请人:长沙理工大学