F9基因拷贝数变异检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种F9基因拷贝数变异检测试剂盒，包括2×PCR缓冲液；竞争性DNA；PCR引物混合液；Taq?DNA聚合酶。AccuCopy技术的精确度高，变异系数小于5%，并且结果的准确性也高。因此，本项发明采用了AccuCopy技术开发F9基因拷贝数变异检测试剂盒，并检测发现了约15例有大缺失突变的血友病B患者，临床应用效果良好。
【专利说明】F9基因拷贝数变异检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，应用于生物科学研究和临床分子诊断，具体涉及一种 F9基因拷贝数变异检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 血友病B(HB)是临床常见的一种遗传性出血疾病，主要由F9基因突变导致凝血因 子IX (FIX)质或量的缺陷而引起体内凝血功能的异常，在男性中的发病率约为1/30, 000。 根据血浆中FIX活性，HB可分为轻型（>5%)、中型（1-5%)和重型（〈1%)三种类型。重型患者 表现为自发性关节出血，肌肉出血和内脏器官出血等，轻型患者表现为外伤后出血难止。因 此，该病具有高致残率和致死率。替代治疗是目前唯一有效的治疗方法，制剂主要包括凝血 酶原复合物（PCC)和重组凝血因子IX (rFIX)。由于缺乏根治措施，通过携带者诊断和产前 诊断避免血友病胎儿的出生，对提高人口素质，减轻社会负担具有重要的意义。然而，前提 是需要先对家系中血友病B患者进行准确有效的基因诊断。
[0003] F9基因位于X染色体长臂27. 1-27. 2,全长32. 7kb，包括8个外显子和7个内含子 及其侧翼调控区域。遗传方式为X连锁隐性遗传病，先证者同胞患病风险决定于母亲是否 为致病基因携带者，携带者女性的男性后代患病风险为50%，女性后代携带致病基因的风险 也为50%。男性患者的女性后代100%为携带者，而男性后代100%为正常。目前已报道的 F9基因突变类型广泛，包括有点突变、缺失、插入、重复等。随着基因体外扩增技术的出现和 发展，通过患者外周血有核细胞DNA进行F9基因分析已经成为当前进行F9基因诊断的主 要手段。简单来说，针对F9的8个外显子及其侧翼序列区域分别设计PCR引物进行体外扩 增，然后将PCR扩增产物进行直接测序，通过将测序结果与参考序列比对，查找可能的致病 突变。这种直接测序的方法可以检测错义突变、剪接位点突变、无义突变及小缺失和小插入 等突变。当家系中先证者的突变位点明确后，对于女性家系成员进行的携带者检测只需扩 增相应突变位点所在的外显子，测序比对是否存在相同的突变。如果该女性为携带者，那么 相应位点为杂合突变。女性携带者怀孕后，为了避免患儿的出生，怀孕16-22周时需要抽取 胎儿羊水进行DNA抽提，直接扩增胎儿羊水DNA的相应突变位点所在外显子，测序比对后查 找胎儿是否存在相同的突变。除了直接测序法查找致病突变外，我们还会对家系成员进行 基因连锁分析，以对携带者检测和产前诊断结果进行核实。基因连锁分析并不是直接检测 致病基因的异常，而是利用与致病基因紧密连锁和共同传递的一系列基因组遗传多态性标 记，通过检测家系先证者，明确与致病基因相关的这些遗传标记的特点，进而对家系中其他 成员的遗传标记进行检测协助诊断。经过前期工作的筛选后，我们选择了 F9基因外的6个 STR 位点（DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXS8013、DXS1227、DXS102)用于 F9 基因的遗传连锁 分析。然而由于遗传连锁分析属于间诊断方法，且容易受到染色体同源重组等因素的影响， 不能得到完全可靠的结果，所以需要与常规测序方法的结果相互验证以取得更加可信的诊 断结论。
[0004] 利用常规直接测序方法可使绝大部分的血友病B家系能得到明确诊断。但据血友 病B突变数据库统计，大缺失或重复突变占总F9基因突变类型的5%左右，直接测序的方法 不能给与明确诊断，甚至漏诊。首先，当先证者存在大片段缺失时，由于缺失而使得PCR扩 增失败。而对于女性家系成员来说，由于存在另外一条正常的染色体模板，PCR扩增是能够 成功的，测序结果也是正常的，但不能排除携带者的可能性。其次，当先证者为大片段重复 时，PCR能够成功扩增所有外显子区域，但是测序比对不能发现重复突变。此时，对相应外 显子的拷贝数进行定量能够明确。基因大片段缺失和重复又称为基因拷贝数变异（CNVs)。 随着微阵列CNV芯片技术以及二代测序技术的发展及应用，发现拷贝数变异（CNVs)广泛地 存在于人类染色体基因组中。CNVs主要由基因组发生重组而导致，一般指长度为几 kb-几 Mb基因组大片段的拷贝数增加或者减少，主要表现为亚显微水平的重复，缺失和插入等。通 过拷贝数检测方法对先证者F9各外显子的拷贝数进行检测，如果相应外显子缺失，则拷贝 数结果为0 ;如果相应外显子重复，则拷贝数结果大于1。而对于携带者来说，如果缺失拷贝 数结果为1，而重复的话拷贝数结果将大于2。但是目前针对CNVs的检测方法非常多，选择 合适的技术用于F9基因检测极为重要。
[0005] 目前CNVs的检测方法主要有：多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-depengent probe amplification，MLPA)、微阵列比较基因杂交（array-based comparative genomic hybridization, array-CGH)、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP)分型芯片、affymetrix CNV芯片技术及二代测序技术等。此外，实时突 光定量 PCR 技术（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)和突光 原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, FISH)等则主要用于CNVs的验证。 其中array-CGH、SNP分型芯片、Affymetrix微阵列技术、二代测序技术等主要用于全基因 组范围内未知CNVs的检测，这些全基因组CNVs检测技术先进，准确而高效，但相对比较昂 贵，尤其是在检测某些特定基因或者特定区域时并不是最佳选择。RT-qPCR方法虽然经典， 但是效率太低，一个反应体系中不能同时对多个片段进行检测。MLPA主要是针对特定基因 或特定区域进行拷贝数检测的技术，2002年由Schouten等首次报道，是目前应用最为广泛 的单一基因拷贝数检测技术，可在同一反应管中对50个不同片段的拷贝数进行检测，所需 设施简单，PCR仪和毛细管电泳仪。荷兰MRC-Holland公司研发了数百种MLPA检测试剂 盒，用于人类疾病，细胞遗传学及肿瘤研究，其中包括各种遗传性出血与血栓性疾病的相关 基因的CNVs的检测。尽管MLPA在诊断特定基因外显子CNVs方面技术已经非常成熟，但是 MLPA也存在一些比较突出的问题。首先，它对所检测标本的DNA质量要求相对较高，普通的 DNA抽提方法无法满足实验要求，需要购买质量较好的商品化试剂盒进行抽提，增加了实验 成本，而且检测标本和参比标本必须使用同种DNA抽提方法。其次，MLPA方法不易建立，我 们也曾试图进行该方法的建立，但是通过多次尝试后，并未得到理想而又准确的结果。我们 也曾经购买商品化的试剂盒，每次检测结果不稳定，不能保证结果的可靠性。因此，我们针 对自己的需求开发了以多重突光竞争PCR技术为基础的AccuCopy拷贝数检测技术。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种F9基因拷贝数变异 检测试剂盒，基于多重基因拷贝数检测方法技术，检测F9基因拷贝数变异的试剂盒及检测 体系，主要用于检测F9基因缺失或重复突变而导致的凝血因子IX (FIX)质或量的缺陷，以 获取F9基因各目标位点的正确拷贝数的检测试剂盒。
[0007] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现： 一种F9基因拷贝数变异检测试剂盒，包括： 1) 2XPCR缓冲液； 2) 竞争性DNA ; 3) PCR引物混合液； 4) TaqDNA聚合酶； 其中，所述PCR引物混合液包括： a) F9_l，F9_2+3, F9_4, F9_5, F9_6, F9_7, F9_8 共七对目标位点的多重 PCR 引物：SEQ ID NO:1-14 ； b) 参照位点A、参照位点B、参照位点C共三对参照基因的多重PCR引物：SEQ ID NO:15-20 ； c) 一对性别位点的多重PCR引物：SEQ ID NO: 21-22 ; 所述竞争性DNA包括： i) F9_1，F9_2+3，F9_4，F9_5，F9_6，F9_7，F9_8 共七个人标准序列的内对照 DNA :SEQ ID NO:23-29; ii) 参照基因 A、参照基因 B、参照基因 C共三个参照基因的内对照DNA :SEQ ID NO:30-32。
[0008] 进一步的，所述的每对引物中有一个5'端荧光素标记。
[0009] 优选的，所述荧光素可选用 FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、R0X、荧光素、FITC、 IRD-700/800、CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、TET、TAMRA、J0E、B0DIPY TMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗 丹明红、德克萨斯红或雅基马黄。但不仅限于此23种荧光素，如果上述所标记引物的扩增 产物利用片断大小可以区分鉴别，可利用同种荧光标记；如果无法以扩增产物片段大小区 别则可利用不同种荧光标记区分。
[0010] F9基因拷贝数变异检测方法，主要包括以下步骤： (1) 针对待测F9基因，设计七对目标位点的多重PCR引物，每对引物中的一条具有荧光 标记；设计了三对参照基因的多重PCR引物；每对引物中的一条具有荧光标记；设计了一对 性别位点的多重PCR引物；该对引物中的一条具有荧光标记；上述同种荧光标记的多重PCR 引物对应扩增产物的长度有差异； (2) 设计针对不同待测的F9基因目标位点和参照基因的内对照DNA片段，所述内对照 DNA片段与（1)中对应的多重PCR引物的扩增产物高度一致，为对应扩增产物的序列缺失或 插入少数1-50个碱基的序列； (3) 对所有内对照DNA片段严格定量； (4) 将每种内对照DNA片段等量混合，与所述多重PCR引物对待测样品进行多重荧光 PCR扩增； (5) 扩增产物通过变性毛细管电泳将不同长度的片段分开，得到每个条带的位置信息 以及荧光强度。
[0011] 优选的，步骤（5)之后还包括以下步骤：计算每个F9基因目标位点的样本条带/ 内对照DNA条带的荧光峰高或面积比，然后将目标位点的该比值除以参照基因的该比值再 乘以参照基因的拷贝数即得目标位点的相对拷贝数。
[0012] 如果存在目标位点拷贝数已知的参照样本，可以将待测样本目标位点的相对拷贝 数除以参照样本对应目标位点的相对拷贝数再乘以参照样本该目标位点拷贝数即得待测 样本该目标位点的精确拷贝数。
[0013] 本发明的有益效果是： 1、AccuCopy技术与MLPA -样，可在同一反应管中针对多个外显子进行拷贝数检 测。而且在诊断特定基因或者特定区域CNVs方面AccuCopy具有更大的优势和应用前景。 AccuCopy技术操作相对简单，只需要常规的PCR仪及ABI3130XL测序仪，而且对模板DNA 的质量要求没有MLPA高，各种方法抽提的DNA均能满足试验要求，且仅需10-20 ng的模板 DNA。同时，应用AccuCopy技术，完成整个试验过程只需要4个小时，而MLPA需要24个小 时，效率明显提高。更为重要的是AccuCopy技术的精确度高，变异系数小于5%，并且结果的 准确性也高。因此，本项发明采用了 AccuCopy技术开发F9基因拷贝数变异检测试剂盒，并 检测发现了约15例有大缺失突变的血友病B患者，临床应用效果良好。
[0014] 2、快速检测：在获得内对照DNA后，只要将样本DNA与内对照DNA混匀后进行多重 PCR，然后将PCR产物直接上毛细管荧光电泳仪(如ABI测序仪）即可，整个实验过程仅需要 一步PCR循环和一步毛细管电泳，耗时不到4个小时。
[0015] 3、高精确性：由于目标基因片段与其内对照DNA之间仅有少数几个碱基差别，这 两个模板的扩增效率将体现高度一致性，因此最后的扩增产物真实的反应了扩增前两个模 板浓度比例，根据我们预测试结果，一个竞争性PCR反应重复3次的标准方差在5%之内，而 且如果将目标基因片段与内对照DNA按不同稀释梯度混合进行竞争性PCR，我们发现样本 峰与内对照峰面积之比与两个模板的原始浓度比的相关性达到99. 9%以上。
[0016] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。 本发明的【具体实施方式】由以下实施例及其附图详细给出。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： 图1为本发明所述检测方法的原理示意图； 图2为本发明实施例中样品1检测结果示意图； 图3为本发明实施例中样品2检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0018] 下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
[0019] F9基因目标位点序列，参照基因及内对照DNA序列信息： 1、F9基因位点1 (目标位点） 人标准序列，164bp tccaaagacccattgagggagatggacattatttcccagaagtaaatacagctcagcttgtactttggtacaa ctaatcgaccttaccactttcacaatctgc TAGC aaaggttatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcacc aggcctcatcaccat F9_l内对照DNA序列，162bp tccaaagacccattgagggagatggacattatttcccagaagtaaatacagctcagcttgtactttggtacaa ctaatcgaccttaccactttcacaatctgc TC aaaggttatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccag gcctcatcaccat 2、 F9基因位点2+3 (目标位点） 人标准序列，188bp tggctccatgccctaaagagaaattggctttcagattatttggattaaaaacaaagactttcttaagagatg taaaattttcatgatgttttcttttttgctaaaactaaagaattattcttttacatttcagtttttcttgatcatga aaacgccaac AAAA ttctgaatcggccaaagaggtataa F9_2+3内对照DNA序列，186bp tggctccatgccctaaagagaaattggctttcagattatttggattaaaaacaaagactttcttaagagatg taaaattttcatgatgttttcttttttgctaaaactaaagaattattcttttacatttcagtttttcttgatcatga aaacgccaac AA ttctgaatcggccaaagaggtataa 3、 F9基因位点4 (目标位点） 人标准序列，154bp ggaccgggcattctaagcagtttacgtgccaattcaatttcttaacctatctcaaagatggagatcagtgtga gtcca ATCC atgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggattt gaagg F9_4内对照DNA序列，152bp ggaccgggcattctaagcagtttacgtgccaattcaatttcttaacctatctcaaagatggagatcagtgtga gtcca AC atgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttga agg 4、 F9基因位点5 (目标位点） 人标准序列，96bp aatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctc CTGT actgagggatat cgacttgcagaaaaccagaagtcc F9_5内对照DNA序列，94bp aatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctc CT actgagggatateg acttgcagaaaaccagaagtcc 5、 F9基因位点6 (目标位点） 人标准序列，212bp aagtgacaaggatgggcctcaatctcaatttttgtaatacatgttccatttgccaatgagaaatatcaggtta ctaatttttcttctatttttctagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcaca AACT tctaagctcacccg tgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttgga F9_6内对照DNA序列，210bp aagtgacaaggatgggcctcaatctcaatttttgtaatacatgttccatttgccaatgagaaatatcaggtta ctaatttttcttctatttttctagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcaca AT tctaagctcacccgtg ctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttgga 6、 F9基因位点7 (目标位点） 人标准序列，174bp Tgttttcacaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggat tgtaactgctgcccactgtgttga AACT ggtgttaaaattacagttgtcgcaggtaaatacacagaaagaataata atctgcagcaccactagctctttaa F9_7内对照DNA序列，172bp tgttttcacaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatggat tgtaactgctgcccactgtgttga AT ggtgttaaaattacagttgtcgcaggtaaatacacagaaagaataataat ctgcagcaccactagctctttaa 7、 F9基因位点8 (目标位点） 人标准序列，109bp tggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactga AGTG gaagg gaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaa F9_8内对照DNA序列，107bp tggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactga AG gaaggga ccagtttcttaactggaattattagctggggtgaa 8、 参照基因 A 人标准序列，75bp TGAGCCAAAAATTCAGAATACAAGGAGCTTTCAAGGAAAAAGG CTGT ATGCTGCGTTTGCCTGCCTTCCAAGCAA 参照基因 A内对照DNA序列，73bp TGAGCCAAAAATTCAGAATACAAGGAGCTTTCAAGGAAAAAGG C T ATGCTGCGTTTGCCTGCCTTCCAAGCAA 9、 参照基因 B 人标准序列，145bp CACTGAGCCCCAGAGACCTGACAAGCCTGTTTGAGCCGTGCCTGAAAAATGTGGCTCATCCTCAG GCTG CAG CGGGGAAAATGGAAGAGTTTAATTGGTTCTGACTTCAGGATTCAGATCATAGTTTTCCCTGGAGGTGTGCATT 参照基因 B内对照DNA序列，143bp CACTGAGCCCCAGAGACCTGACAAGCCTGTTTGAGCCGTGCCTGAAAAATGTGGCTCATCCTCAG GG CAGCG GGGAAAATGGAAGAGTTTAATTGGTTCTGACTTCAGGATTCAGATCATAGTTTTCCCTGGAGGTGTGCATT 10、 参照基因 C 人标准序列，222bp AGGGTGCTGGGATCAGAGAGAGGCTTTTTCAGGGAGACCATCAGTGGGTGGGAGAAGATGTCTCATCTCCGC CCGAGTCTCCATTGTGAGCTTTCTGAGCATTTCACCATGGAGACTCGGCACAGACGTGTTCCTTGGCTTTCCTGTAG GAATCCAGGGCCCACCAGAGCTTCCCTTAGCACCAGCAG TGGCAGCTGGTTCATTTTGCCACCCTCCAGTAGC 参照基因 C内对照DNA序列220bp AGGGTGCTGGGATCAGAGAGAGGCTTTTTCAGGGAGACCATCAGTGGGTGGGAGAAGATGTCTCATCTCCGC CCGAGTCTCCATTGTGAGCTTTCTGAGCATTTCACCATGGAGACTCGGCACAGACGTGTTCCTTGGCTTTCCTGTAG GAATCCAGGG CCCACCAGAGCTTCCCTTAGCACCA GG TGGCAGCTGGTTCATTTTGCCACCCTCCAGTAGC 11、性别位点 人标准序列，X染色体，116bp CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTGTGTTGATTCTTTATCCCAGATGTTTCTCAAGTGGTCCTGATTTTACAGT TCCTACCACCAGCTTCCCAGTTTAAGCTCTGATGGTTGGCCTC 人标准序列，Y染色体，122bp CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTGGGTGGATTCTTCATCCCAAATAAAGTGGTTTCTCAAGTGGTCCCAATTT TACAGTTCCTACCATCAGCTTCCCAGTTTAAGCTCTGATGGTTGGCCTC 下表为用于复合扩增体系的引物序列以及所述引物序列的混合物。
【权利要求】
1. 一种F9基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，包括： 1) 2XPCR缓冲液； 2) 竞争性DNA ; 3. PCR引物混合液； 4. TaqDNA聚合酶； 其中，所述PCR引物混合液包括： a) F9_l，F9_2+3, F9_4, F9_5, F9_6, F9_7, F9_8 共七对目标位点的多重 PCR 引物：SEQ ID NO:1-14 ； b) 参照位点A、参照位点B、参照位点C共三对参照基因的多重PCR引物：SEQ ID NO:15-20 ； c) 一对性别位点的多重PCR引物：SEQ ID NO: 21-22 ; 所述竞争性DNA包括： i) F9_1，F9_2+3，F9_4，F9_5，F9_6，F9_7，F9_8 共七个人标准序列的内对照 DNA :SEQ ID NO:23-29; ii) 参照基因 A、参照基因 B、参照基因 C共三个参照基因的内对照DNA :SEQ ID NO:30-32。
2. 根据权利要求1所述的F9基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于：所述的每对引 物中有一个5'端突光素标记。
3. 根据权利要求2所述的F9基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于：所述荧光素 可选用 FAM、HEX、VIC、NED、PET、TAMRA、R0X、荧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3. 5、 CY5. 5、TET、TAMRA、JOE、BODIPY TMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红或雅基马 黄。
【文档编号】C12Q1/68GK104046699SQ201410322475
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】王学锋, 姜正文, 丁秋兰, 张希, 戴菁, 姚忻岑, 陆晔玲, 林琳 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院, 天昊生物医药科技（苏州）有限公司