专利名称：别藻蓝蛋白、晶体生产工艺及制品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白、晶体制造工艺及制品，尤其涉及的是在一般条件下从藻类中提取的能发射强烈荧光的别藻蓝蛋白并将其转化为晶体形态，及其在科研、医疗、检测、信电等领域的应用。
背景技术：
早在上个世纪初，国外就曾报道在蓝藻和红藻中存在具强烈荧光性的红色、紫罗兰色和蓝色蛋白质。1910年，Kylin首次将这些色素蛋白定名为“藻色蛋白”(Phycochromo-proteins)。这种大量出现于红藻、蓝绿藻和隐藻中的捕光色素蛋白，就是目前亟待开发的藻胆蛋白(Phycobiliproteins，PBP)，它主要包括藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)，藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)，藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin，PEC)和别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)四种。藻胆蛋白把捕获的光能高效的传递给叶绿素，从而使海藻的光合作用得以发生。
与化学合成的荧光染料相比，别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)纯天然来源，资源丰富，物理性质稳定，水溶性好，不与蛋白质、核酸、细胞等发生非特异性吸附，安全且无毒性，对生态环境无污染。另外别藻蓝蛋白摩尔吸光系数大，荧光量子产率高，荧光发射波长大于550nm，强烈吸收光谱带很宽，有利于选择激发光源，克服了传统荧光标记物荧光背景大、易淬灭等缺点，大大提高了荧光检测的敏感性。
现代研究表明别藻蓝蛋白的功能单位是“松散的六聚体”，而不是传统上普遍认为的三聚体，但是由于现在的别藻蓝蛋白大多是以冻干粉或沉淀形式的存在，别藻蓝蛋白的功能基团很容易失活，当受到某些物理因素如热、紫外线照射，高压和表面张力等或化学因素等影响时，常常会出现生物活性的丧失，一些侧链基团的暴露，一些物理化学性质的改变和生物化学性质的改变导致蛋白质功能的丧失，不能长期保存。
发明内容
本发明的一个目的在于提供制备别藻蓝蛋白溶液的方法，该方法与现有技术相比；只需通过两种填充介质的柱层析就能制备出不同纯度级别的别藻蓝蛋白溶液。
本发明的另一个目的在于提供别藻蓝蛋白晶体的制备方法，该方法与现有技术相比；在普通的实验条件下就可以完成，简单易行。
本发明还针对现有技术的蛋白质处在冻干粉或沉淀状态，生物活性容易丧失，不能长期利用，侧链基团容易暴露，物理化学性质和生物化学性质容易改变，荧光活性低的缺点；提供一种能长期保存，所需的保藏条件要求小，荧光活性高的别藻蓝蛋白晶体。
本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的一种别藻蓝蛋白溶液的制备方法，其特征在于，将藻细胞破碎后，通过过滤和0-4℃下，6000-10000转/分钟(rpm)高速冷冻离心分离，去除沉淀，收集上清，分级盐析后收集别藻蓝蛋白沉淀，沉淀溶解于磷酸盐缓冲液后依次经过羟基磷灰石、葡聚糖凝胶SephadexG-100、羟基磷灰石柱层析，羟基磷灰石柱层析时使用浓度范围为0.005-0.4摩尔/升的线性梯度磷酸盐缓冲液洗脱，控制流速在0.5-2.5毫升/分钟，最后收集A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5、A650/A280＞5.0一种或多种不同纯度要求的别藻蓝蛋白溶液，制成不同纯度级别的别藻蓝蛋白溶液。
作为优选，所述制备别藻蓝蛋白溶液的方法，其特征在于，所述别藻蓝白溶液在羟基磷灰石柱层析过程中使用0.005-0.05摩尔/升的线性梯度磷酸盐缓冲液洗脱。
作为优选，所述制备别藻蓝蛋白溶液的方法，其特征在于，所述别藻蓝蛋白溶液在羟基磷灰石柱层析过程中使用线性梯度磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱流速控制在0.8-1.6毫升/分钟。
现有技术制备别藻蓝蛋白溶液的方法为将藻胆蛋白粗品上样于磷酸缓冲液(10mmol/L，pH值7.0，0.1mol/L NaCL)平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱(2.6cm×20cm)，用含0.1～1mol/L NaCL的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱。收集的样品透析后上样于上述同样缓冲平衡的羟基磷灰石柱(1.6cm×10cm)，10～300mmol/L磷酸盐缓冲(pH值7.0，0.1mol/L NaCL)梯度洗脱。收集的样品用固体硫酸铵沉淀透析后，上样SephacrylS-200柱(1.6cm×80cm)，洗脱液为10mmol/L，pH值7.0的磷酸盐缓冲液(含0.2mol/LNaCL)；对比技术中分离得到的别藻蓝蛋白纯度为5.0；与之相比，本发明别藻蓝蛋白的纯化是将细胞破碎抽提液经过一次HA柱再过Sephadex G-100，然后在过一次HA柱，同时可以得到A565/A280＞4.0、A565/A280＞4.5、A565/A280＞5.0一种或多种不同纯度要求的别藻蓝蛋白溶液，制成不同纯度级别的别藻蓝蛋白溶液制品。目前影响分离纯化成本的主要因素就是使用的层析介质昂贵，而本发明分离纯化过程中所用的填充介质仅需HA和Sephadex G-100两种，有效的降低了生产成本。
一种别藻蓝蛋白制备成晶体的方法，其特征在于，将一定纯度的别藻蓝蛋白放在闭光封闭的环境中，加入0.05-0.2％氯化镁和2-4％氯化钠，调节pH值使其在晶体的成长过程中始终稳定在pH5.8～7.4的范围内，并线性梯度地加入硫酸铵并轻微搅动，使其转变成粗晶体，通过重结晶，再结晶，即得最后的晶体产品；晶体产品极大提高了别藻蓝蛋白的稳定性，更大限度地提高产品纯度和保持产品的高生物活性。
作为优选，所述的别藻蓝蛋白制备成晶体的方法，其特征在于，所述的在晶体的成长过程中始终稳定在pH6.8～7.2的范围内。
一种别藻蓝蛋白晶体，分子结构由脱辅基蛋白通过一个硫醚键共价连接藻蓝素(PCB)，连接位点包括半胱氨酸残基α-84(α亚基第84位氨基酸)和β-84(β亚基第84位氨基酸)，α和β亚基构成(αβ)异二聚体由异二聚体在聚合成(αβ)3三聚体的结构，特征吸收峰为630～660nm，荧光发射峰为656～660nm，等电点为4.5～4.7。其特征在于所述的别藻蓝蛋白为晶体结构，所述的晶体结构属于P6322空间群。
作为优选，所述的P6322空间群中三聚体沿着C轴的方向相互连接面对面的形成六聚体。
作为优选，所述的别藻蓝蛋白晶体的晶胞参数为a＝b＝101.9，c＝130.6A，α＝β＝90°，γ＝120°所述的晶胞内包含不对称单位。
作为优选，所述的晶胞内的不对称单位中含有一个单体，所述的单体为αβ单体；所述的α和β亚基只含有一个藻蓝素(PCB)，所述的藻蓝素(PCB)基团有半环状和伸展状两种构象组成，所述的藻蓝素(PCB)通过硫醚键连在多肽上。
作为优选，所述的别藻蓝蛋白晶体的特征光谱吸收峰为650nm，荧光发射峰为658nm，等电点为4.6。
本发明别藻蓝蛋白晶体具有能够长期保存，所需的保藏条件要求小，荧光活性高的的特点，其制作方法在普通的实验条件下就可以完成，简单易行。并在科研、医疗、检测、信电等领域得到广泛的应用。
图1为构成别藻蓝蛋白晶体的一种藻蓝素(Cys-PCB)的结构式具体实施方式
以下通过试验例和实施例来进一步阐述本发明所述别藻蓝蛋白晶体的有益效果。
试验例1别藻蓝蛋白晶体在荧光检测方面的应用1.别藻蓝蛋白晶体与亲和素的交联制成荧光探针试验材料选本发明的别藻蓝蛋白晶体，分子量约104000道尔顿；pH值7.4的0.1摩尔/升磷酸盐缓冲液(PBS)，其中含0.1摩尔/升氯化钠(NaCl)；3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)，分子量312道尔顿；二硫代苏糖醇(DTT)，分子量154道尔顿。
试验方法1)别藻蓝蛋白的衍生化取2.08毫克别藻蓝蛋白晶体溶于1.0毫升磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入15微升3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)无水甲醇液(4毫克/毫升)，使得3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)与别藻蓝蛋白摩尔比约为10，常温反应120分钟，经葡聚糖(Sephadex G-50)凝胶层析柱(Φ1×17厘米)脱盐，磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液)平衡和洗脱，收集别藻蓝蛋白溶液峰。
2)亲和素的巯基化1毫升亲和素(约2毫克/毫升，溶解于含有0.1摩尔/升氯化钠、pH7.4的0.1摩尔/升磷酸盐缓冲液中)，加入25微升上述3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)无水甲醇液，使得3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)与亲和素摩尔比约为10，常温反应60分钟，加入二硫苏糖醇(DTT)使得其终浓度为25微摩尔/升，常温反应90分钟，同上过葡聚糖凝胶层析(SephadexG-50)，收集蛋白峰。
3)别藻蓝蛋白与亲和素的交联取衍生化的别藻蓝蛋白与巯基化的亲和素混合，摇床低速(＜20转/分钟)振荡，4℃反应过夜。
4)停止反应第3)步反应溶液中加入100微升的50毫摩尔/升碘乙酸钠封闭残余巯基，常温反应30分钟。
5)产物的纯化第4)步产物经丙烯葡聚糖(Sephacryl S-300HR)凝胶柱层析，收集第一个蛋白峰即为荧光别藻蓝蛋白标记制品。
6)保存别藻蓝蛋白标记制品，最后溶于磷酸盐缓冲液(含有0.1摩尔/升乙二胺四乙酸(DETA)、1摩尔/升碘乙酰胺、1％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％叠氮化钠(NaN3))，0～5℃保存。
2.别藻蓝蛋白标记蛋白A试验材料别藻蓝蛋白晶体，分子量约104000道尔顿；pH值7.4的0.1摩尔/升磷酸盐缓冲液(PBS)，其中含0.1摩尔/升氯化钠(NaCl)；3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)无水甲醇液；二硫苏糖醇(DTT)pH7.4缓冲液；蛋白A；乙二胺四乙酸(DETA)；碘乙酰胺。
试验方法1)、别藻蓝蛋白的衍生化取2.08毫克别藻蓝蛋白晶体溶于1.0毫升磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入15微升3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)无水甲醇液(4毫克/毫升)，使得3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)与别藻蓝蛋白摩尔比约为10，常温反应60分钟，经葡聚糖(Sephadex G-50)凝胶层析脱盐(Φ1×17厘米)，磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液)平衡和洗脱，收集别藻蓝蛋白溶液峰。
2)、蛋白A的巯基化0.5毫升蛋白A(约2毫克/毫升)100mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，含有100mmol/L氯化钠)pH7.4，加入上述3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)无水甲醇液，使得3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)与蛋白摩尔比约为10，常温反应40分钟，加入二硫苏糖醇(DTT)使得其终浓度为25微摩尔/升，常温反应25分钟，同上过葡聚糖凝胶层析(Sephadex G-50)，收集蛋白峰。
3)、别藻蓝蛋白与蛋白A的交联取0.6毫克/毫升衍生化的荧光别藻蓝蛋白与0.2毫克/毫升巯基化的蛋白A等量混合，摇床低速(＜20转/分钟)振荡，4℃反应过夜。
别藻蓝蛋白标记制品，最后溶于磷酸盐缓冲液(含有0.1摩尔/升乙二胺四乙酸(DETA)、1摩尔/升碘乙酰胺、1％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％叠氮化钠(NaN3))，0～5℃保存。
使用别藻蓝蛋白晶体标记亲和素和蛋白A的标记率均在60％以上，而使用别藻蓝蛋白冻干粉或沉淀标记亲和素的标记率一般为40％-50％，结果表明，使用别藻蓝蛋白晶体进行分子标记的效果明显优于别藻蓝蛋白冻干粉或沉淀的标记。
试验例2别藻蓝蛋白晶体在免疫分析方面的应用。
别藻蓝蛋白与抗体的交联试验材料选本发明的别藻蓝蛋白晶体分子量约104000道尔顿；PD-10柱(葡聚糖凝胶层析柱Sephadex G-25M)，安玛西亚Amersham公司产品，产品目录号No.17-0851-01；NAP5柱(葡聚糖凝胶层析柱Sephadex G-25DNA grade)，安玛西亚Amersham公司产品，产品目录号No 17-0853-02；琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯)(SMCC)，Pierce公司，产品目录号No.22360；N-乙基马来酰胺(NEM)，Sigma公司，产品目录号E-1271；二甲基亚砜(DMSO)，Aldrich公司，产品目录号No.27,685-5；pH值7.4的0.1摩尔/升磷酸盐缓冲液(PBS)，其中含0.1摩尔/升氯化钠(NaCl)。
试验方法1)、别藻蓝蛋白晶体的预处理将别藻蓝蛋白晶体溶于1.0毫升磷酸盐缓冲液(PBS)中，于透析缓冲液中透析除盐。透析后的别藻蓝蛋白浓度调整到5-10毫克/毫升为宜。
2)、别藻蓝蛋白的衍生化将琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯)(SMCC)溶解于无水二甲基亚砜(DMSO)配制成10毫克/毫升的母液，每毫克的别藻蓝蛋白晶体添加11微升的琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯)(SMCC)，铝箔封好后于室温旋转反应60分钟，使别藻蓝蛋白分子上的氨基与琥珀酰胺反应生成衍生化的别藻蓝蛋白。
交换缓冲液预先平衡凝胶柱，将衍生化的别藻蓝蛋白过柱。
3)、抗体的处理二硫苏糖醇(DTT)溶解于蒸馏水中，配制成1摩尔/升的二硫苏糖醇(DTT)母液，调整抗体的浓度，使其浓度至少为4毫克/毫升。
每毫升抗体溶液中加入20微升的二硫苏糖醇(DTT)母液，室温静置反应30分钟，将抗体的二硫键打开形成巯基。
交换缓冲液预先平衡凝胶柱，将反应液过柱，收集抗体部分。
4)、别藻蓝蛋白和抗体的共价交联每毫克抗体加入4毫克的琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯(SMCC)衍生化的别藻蓝蛋白，铝箔封好后于室温旋转反应60分钟，使别藻蓝蛋白分子上的马来酰亚胺基和抗体上的巯基实现共价交联。
10毫克的N-乙基马来酰胺(NEM)溶解于1.0毫升的无水二甲基亚砜(DMSO)中制成N-乙基马来酰胺(NEM)母液(现配现用)。
每毫克抗体中加入3.4微升N-乙基马来酰胺(NEM)母液，铝箔封好后于室温旋转反应60分钟，反应后，使抗体上的巯基封闭。
5)、交联物的存储将交联物于存储缓冲液中透析后保存于冰箱。
结果表明，当使用别藻蓝蛋白的沉淀产品来实现该用途时，由于沉淀产品只是蛋白的硫酸铵沉淀物，在使用中存在一定的局限性和缺点，不能保证在实施荧光检测及免疫分析标记前别藻蓝蛋白的同一性，故对分析结果的精准性产生一定影响。用别藻蓝蛋白的晶体来实现该用途，更好地解决了别藻蓝蛋白在此领域的缺陷，使标记和分析更加精准。将别藻蓝蛋白的晶体用于荧光检测及免疫分析，或与其他物质如抗体、生物素、亲合素、免疫蛋白等结合，制成荧光探针或荧光标记用于荧光检测及分析。通过检测其发出的荧光，可以用于荧光显微检测、荧光免疫测定、双色或多色荧光分析、癌细胞表面抗原检测、疾病检测诊断、蛋白质和核酸等生物大分子的分析。
试验例3别藻蓝蛋白晶体用于疾病的治疗与预防。
试验材料选本发明的别藻蓝蛋白晶体分子量约104000道尔顿。
抑制肿瘤细胞生长运用半固体琼脂培养法和溴化3-(4，5)-二甲基-2-噻唑基-2，5二苯基四氮唑(MTT)检测法测定了别藻蓝蛋白晶体对人血癌细胞株HL-60，K-562和U-937生长的影响。体外培养条件下用不同浓度的别藻蓝蛋白晶体处理这3种肿瘤细胞，结果显示别藻蓝蛋白晶体对这三种肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用，并存在浓度剂量效应，高浓度抑制作用强。
(1)在较高浓度(100微克/毫升)时对HL-60细胞的生长有显著的抑制作用；(2)在浓度(100微克/毫升和30微克/毫升)时对K-562细胞的生长有显著的抑制作用；(3)在浓度(100微克/毫升)时对U-937细胞的生长有显著的抑制作用。
抗辐射作用从别藻蓝蛋白晶体抗辐射作用的机理来看，造血干细胞的损伤和恢复在造血型放射病中起着重要的作用，降低造血干细胞的放射敏感性或防止照射动物体内存活干细胞的继续减少，促使其提前进入增殖期，对照射动物造血功能的恢复将起到有益的作用。预防性的给小鼠腹腔注射别藻蓝蛋白，能显著减轻辐射对小鼠外周血细胞和骨髓细胞的损伤，可促进小鼠外周白细胞的恢复，亦能促进骨髓有核细胞、粒单系祖细胞和多能造血干细胞的恢复和增殖。
免疫功能给注射有肝肿瘤细胞的实验小白鼠口服别藻蓝蛋白晶体后，实验组的小白鼠比对照组的小白鼠的成活率明显提高；进一步的研究发现，实验组的小白鼠的淋巴细胞活性明显高于对照组以及正常小白鼠。因此，别藻蓝蛋白晶体能提高免疫系统功能，以抵抗各种疾病。
表1不同剂量组的别藻蓝蛋白晶体的治疗效果
人类T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞(SRBC)的受体，因此，绵羊红细胞能粘于T细胞的周围，形成玫瑰花样的细胞团，故名E玫瑰花形试验，形成此种玫瑰花结的T细胞称为红细胞玫瑰花形成细胞。人体T淋巴细胞E花环实验是鉴定与计数人外周血T淋巴细胞的功能和数量的常用方法，特别是活性细胞玫瑰花形成细胞(EaRFC)是一组对SRBC具有高度亲和力的T细胞特殊亚组，是T细胞中具有免疫活性功能的效应细胞。别藻蓝蛋白晶体能够促进植物血球凝集素(PHA)刺激淋巴细胞转化的作用，能恢复T细胞受环磷酰胺损伤后E玫瑰花环形成能力，特别是对活性E花环(Ea)的形成能力有较好的恢复作用。因此别藻蓝蛋白晶体能提高免疫系统功能，以抵抗各种疾病。
消炎作用别藻蓝蛋白晶体具有强抗氧化性，是一种活性氧自由基消除剂，在一定程度上具有消炎作用。
别藻蓝蛋白晶体能消除葡萄糖氧化酶引起的炎症。
别藻蓝蛋白晶体具有护肝功效能抑制Fe3+-抗坏血酸诱导的肝脏微粒体脂过氧化作用。口服50-300毫克/千克剂量的别藻蓝蛋白晶体提取物即能产生明显的消炎作用。其消炎活性不依赖于皮质类固醇的释放。且对急、慢性炎症组织都有作用。
别藻蓝蛋白晶体能抑制红细胞的裂解，其作用方式与trolox(维生素E类似物)和抗坏血酸(维生素C)的作用方式相同，但抗氧化性较trolox强16倍，较维生素C强20倍。别藻蓝蛋白能通过消除水相中的过氧化物自由基来防止其诱导的红细胞裂解。
总之，炎症代谢产物，如白细胞三烯、氧自由基等能诱导白细胞迁移进入组织或黏附于血管内皮，而中性白细胞的黏附和浸润是炎症反应的核心。在体内及体外实验中，别藻蓝蛋白晶体通过清除活性氧物质(ROS)，例如羟自由基(OH·)、烷氧自由基(RO·)和超氧化物自由基等，在一定程度上起到缓解炎症的作用。
别藻蓝蛋白晶体抗癌的机理抗癌机制别藻蓝蛋白能被肿瘤细胞选择性吸收到细胞膜中。根据对K-562细胞的作用研究发现，别藻蓝蛋白能引起原癌基因(c-myc)的含量的增高，而对BCL-2的表达量没有影响。因此可见是原癌基因(c-myc)表达量的增高引起了细胞的凋亡，或存在另一种途径抑制了K-562细胞的生长，从而达到抗癌的效果。别藻蓝蛋白可作为一种DNA稳定因子起作用，通过影响合成DNA和RNA的机制，来抑制肿瘤细胞生长，或以诱导细胞内信息分子的改变来达到抗癌效果。
以上机理表明可以将别藻蓝蛋白晶体作为一种功效成分制成药物或食物，用于癌症、肿瘤疾病的治疗与预防。
结果表明别藻蓝蛋白晶体不仅可以制备抗癌抗肿瘤药物，还可将别藻蓝蛋白晶体作为一种功效成分或中间体，制备成药物或食物用于癌症、肿瘤的预防与治疗；又可将别藻蓝蛋白晶体作为一种功效成分或中间体，制备成药物或食物用于抗辐射、增强免疫力或消炎。
试验例5三种不同的别藻蓝蛋白状态下的稳定性之间的比较试验材料别藻蓝蛋白沉淀、别藻蓝蛋白冻干粉、别藻蓝蛋白晶体。
试验方法目前，别藻蓝蛋白沉淀的适宜保存方法为4℃条件下，悬浮于150mM磷酸钠，60％硫酸铵，pH7.0，1mM EDTA，1mMNaN3溶液中；别藻蓝蛋白冻干粉的适宜保存方法为4℃条件下保存。
本发明别藻蓝蛋白晶体的适宜保存方法为4℃条件下，悬浮于150mM磷酸钠，60％硫酸铵，pH7.0，1mM EDTA，1mM NaN3溶液中。
将别藻蓝蛋白沉淀、冻干粉和晶体三种形态的产品于各自的适宜保存条件下保存，不同的保存时间取出，用0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(PBS)配成浓度为100ug/L的别藻蓝蛋白溶液，测定650纳米波长下的吸光光度值，计算出相对吸光值。
表5三种不同的别藻蓝蛋白状态下的稳定性之间的比较 别藻蓝蛋白晶体在其适宜的条件下保存两年后，相对吸光光度值的保持不变，而别藻蓝蛋白以沉淀和冻干粉的形态保存两年后，相对吸光光度值的降低量分别为59％和26％，这表明别藻蓝蛋白以晶体的形态保存明显优于沉淀和冻干粉形态。分析其原因，别藻蓝蛋白以晶体形态存在时，别藻蓝蛋白分子按照特定的规律排列于晶胞中，色素基团包被于别藻蓝蛋白分子内而受到保护，不易被氧化和微生物降解；而别藻蓝蛋白以沉淀和冻干粉的形态保存时，别藻蓝蛋白的分子为无序排列，色素蛋白大量暴露于分子外围，容易被氧化或微生物降解而导致别藻蓝蛋白的变性，导致别藻蓝蛋白在650纳米波长下的吸光光度值的降低。
实施例11、别藻蓝蛋白的制备细胞破碎称取钝顶螺旋藻置入烧杯中，用蒸馏水清洗两次，加入pH值5.8、浓度0.005mol/L的磷酸缓冲液，搅拌均匀。于冰浴(0℃)中1800W超声破碎30分钟，将破碎好的藻液置于预冷的高速冷冻离心机中，8000转/分钟(rpm)0℃下离心60分钟，去掉沉淀，收集上清液；盐析在上清液中加入固体硫酸铵使之达到25％饱和度，0℃温度条件下静置10小时，6000转/分钟(rpm)、0℃冷冻离心60分钟，弃去沉淀。上清液中继续加入固体硫酸铵至80％饱和度，低温(0℃)静置10小时，6000转/分钟(rpm)0℃冷冻离心60分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH5.8)溶解，在0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.8)中充分透析。
第一次羟基磷灰石柱层析将透析后的粗品液加到羟基磷灰石层析柱上，加样量为5ml，然后以0.005-0.4mol/L的线性梯度磷酸盐缓冲液(pH5.8磷酸盐缓冲液，含0.1mol/L氯化钠)洗脱，流速为0.5ml/min，洗脱总体积为600ml。用自动部分收集器收集洗脱液。将别藻蓝蛋白含量和纯度较高的收集液合并在一起，分别加入固体硫酸铵至80％饱和度，于低温(0℃)条件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-100)柱层析上述纯化收集的别藻蓝蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-100)分子筛柱上。用0.005mol/L的磷酸盐缓冲液缓冲液(pH值5.8)洗脱，控制流速在5ml/min，收集A650/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羟基磷灰石柱层析将数次盐析浓缩后的别藻蓝蛋白合并，以6000转/分钟(rpm)0℃冷冻离心60分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH5.8)溶解，在0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.8)中充分透析。将透析后的别藻蓝加到羟基磷灰石层析柱上，洗脱方法与第一次羟基磷灰石柱层析时相同，洗脱体积为1000ml，收集A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5和A650/A280＞5.0的部分。
2.别藻蓝蛋白晶体的制备将制备A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5或A650/A280＞5.0的别藻蓝蛋白溶液收集在烧杯中，放入密闭、闭光、恒低温条件(温度控制在0℃)的超净工作上。溶液中加入0.2％(质量/体积，M/V)的氯化镁和4％(质量/体积，M/V)氯化钠。
将pH传感器浸入液面下，通过pH自动调控装置调节液体的pH值始终稳定在pH5.8。
将固体硫酸铵溶解于0.005mol/L的磷酸盐缓冲液(pH5.8)中制备成100％饱和度的硫酸铵溶液，并用0.2μm的滤膜过滤除菌。
将饱和硫酸铵溶液缓慢滴加到所盛别藻蓝蛋白溶液中，并轻微搅动，使溶液混合均匀，流速控制在1ml/6min，直到溶液中的别藻蓝蛋白以晶体的形式基本析出完全为止。
将晶体混合溶液放入事先低温(0℃)预冷的真空抽滤器中抽滤，抽除滤液，然后用65％饱和度的硫酸铵溶液洗涤晶体3遍。
将所得到的别藻蓝蛋白晶体溶解于0.005mol/L的磷酸盐缓冲液(pH5.8)中，按照以上结晶的方法和步骤，实施重结晶，再结晶，即得最后的晶体产品。
将晶体产品存放于65％硫酸铵饱和的磷酸盐缓冲液溶液中，加入微量防腐剂，于低温(0℃)条件下长期保存。
3.别藻蓝蛋白结构的确定别藻蓝蛋白(APC)的结构是由脱辅基蛋白通过一个硫醚键共价连接藻蓝素(PCB)——一种开链四吡咯发色团组成的，连接位点通常在半胱氨酸残基α84(α亚基第84位氨基酸)和β84(β亚基第84位氨基酸)等保守位点上。等摩尔量的α和β亚基构成(αβ)异二聚体再到(αβ)3三聚体的结构，每个亚基只含有一个藻蓝素PCB。藻蓝素PCB可能呈半环状和伸展状两种构象，通过硫醚键连到多肽上。
α和β亚基分别由160和161个氨基酸组成。尽管α和β亚基的序列一致性只有38％，但它们的结构和折叠方式几乎一致。BE环(连接B螺旋和E螺旋)的第一部分在α亚基中完全暴露于溶剂并且不与发色基团相联系，而在β亚基中则与相邻单体的发色基团作用。BE环(连接B螺旋和E螺旋)的第二部分则显示了几乎一致的构相。作为一个显著的特征，α和β亚基BE环中都存在基序(motif)PGGNxY。别藻蓝蛋白(APC)的等电点约为4.6。
4.别藻蓝蛋白晶体结构的确定利用X-射线衍射的方法对本发明所制备的别藻蓝蛋白晶体结构进行分析，其结果如下别藻蓝蛋白的晶体结构属于P6322空间群，晶胞参数为a＝b＝101.9，c＝130.6，α＝β＝90°，γ＝120°，晶胞内的不对称单位中含有一个(αβ)单体。在P6322空间群中三聚体沿着c轴的方向相互连接，面对面的形成六聚体，但和PC，PE不同的是，在别藻蓝蛋白(APC)中β亚基提供了连接表面，发生在FG环(β120，β123-127，β173)。而且这种连接非常松散。
实施例21.别藻蓝蛋白的制备细胞破碎称取钝顶螺旋藻置入烧杯中，用蒸馏水清洗两次，加入pH值6.8、浓度0.005mol/L的磷酸缓冲液，搅拌均匀。于冰浴(0℃)中1800W超声破碎40分钟，将破碎好的藻液置于预冷的高速冷冻离心机中，8000转/分钟(rpm)2℃下离心45分钟，去掉沉淀，收集上清液；盐析在上清液中加入固体硫酸铵使之达到25％饱和度，2℃温度条件下静置12小时，8000转/分钟(rpm)2℃冷冻离心40分钟，弃去沉淀。上清液中继续加入固体硫酸铵至80％饱和度，低温(2℃)静置10小时，8000转/分钟(rpm)2℃冷冻离心45分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH6.8)溶解，在0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)中充分透析。
第一次羟基磷灰石柱层析将透析后的粗品液加到羟基磷灰石层析柱上，加样量为15ml，然后以0.005-0.05mol/L的线性梯度磷酸盐缓冲液(pH6.8磷酸盐缓冲液，含0.1mol/L氯化钠)洗脱，流速为0.8ml/min，洗脱总体积为600ml。用自动部分收集器收集洗脱液。将别藻蓝蛋白含量和纯度较高的收集液合并在一起，分别加入固体硫酸铵至80％饱和度，于低温(2℃)条件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-100)柱层析上述纯化收集的别藻蓝蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-100)分子筛柱上。用0.005mol/L的磷酸盐缓冲液缓冲液(pH值6.8)洗脱，控制流速在5ml/min，收集A650/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羟基磷灰石柱层析将数次盐析浓缩后的别藻蓝蛋白合并，以8000转/分钟(rpm)2℃冷冻离心50分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH6.8)溶解，在0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)中充分透析。将透析后的别藻蓝加到羟基磷灰石层析柱上，洗脱方法与第一次羟基磷灰石柱层析时相同，洗脱体积为1000ml，收集A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5和A650/A280＞5.0的部分。
2.别藻蓝蛋白晶体的制备将制备A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5和A650/A280＞5.0的别藻蓝蛋白溶液收集在烧杯中，放入密闭、闭光、恒低温条件(温度控制在5℃)的超净工作上。溶液中加入0.2％(质量/体积，M/V)的氯化镁和4％(质量/体积，M/V)氯化钠。
将pH传感器浸入液面下，通过pH自动调控装置调节液体的pH值始终稳定在pH6.8。
将固体硫酸铵溶解于0.005mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.8)中制备成100％饱和度的硫酸铵溶液，并用0.2μm的滤膜过滤除菌。
将饱和硫酸铵溶液缓慢滴加到所盛别藻蓝蛋白溶液中，并轻微搅动，使溶液混合均匀，流速控制在1ml/6min，直到溶液中的别藻蓝蛋白以晶体的形式基本析出完全为止。
将晶体混合溶液放入事先低温(0℃)预冷的真空抽滤器中抽滤，抽除滤液，然后用60％饱和度的硫酸铵溶液洗涤晶体4遍。
将所得到的别藻蓝蛋白晶体溶解于0.005mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.8)中，按照以上结晶的方法和步骤，实施重结晶，再结晶，即得最后的晶体产品。
将晶体产品存放于65％硫酸铵饱和的磷酸盐缓冲液溶液中，加入微量防腐剂，于低温(5℃)条件下长期保存。
3.别藻蓝蛋白结构的确定别藻蓝蛋白(APC)的结构是由脱辅基蛋白通过一个硫醚键共价连接藻蓝素(PCB)——一种开链四吡咯发色团组成的，连接位点通常在半胱氨酸残基α84(α亚基第84位氨基酸)和β84(β亚基第84位氨基酸)等保守位点上。等摩尔量的α和β亚基构成(αβ)异二聚体再到(αβ)3三聚体的结构，每个亚基只含有一个藻蓝素PCB。藻蓝素PCB可能呈半环状和伸展状两种构象，通过硫醚键连到多肽上。
α和β亚基分别由160和161个氨基酸组成。尽管α和β亚基的序列一致性只有38％，但它们的结构和折叠方式几乎一致。BE环(连接B螺旋和E螺旋)的第一部分在α亚基中完全暴露于溶剂并且不与发色基团相联系，而在β亚基中则与相邻单体的发色基团作用。BE环(连接B螺旋和E螺旋)的第二部分则显示了几乎一致的构相。作为一个显著的特征，α和β亚基BE环中都存在基序(motif)PGGNxY。APC的等电点约为4.6。
4.别藻蓝蛋白晶体结构的确定利用X-射线衍射的方法对本发明所制备的别藻蓝蛋白晶体结构进行分析，其结果如下别藻蓝蛋白的晶体结构属于P6322空间群，晶胞参数为a＝b＝101.9，c＝130.6，α＝β＝90°，γ＝120°，晶胞内的不对称单位中含有一个(αβ)单体。在P6322空间群中三聚体沿着c轴的方向相互连接，面对面的形成六聚体，但和PC，PE不同的是，在APC中β亚基提供了连接表面，发生在FG环(β120，β123-127，β173)。而且这种连接非常松散。
实施例31.别藻蓝蛋白的制备细胞破碎称取钝顶螺旋藻置入烧杯中，用蒸馏水清洗两次，加入pH值7.1、浓度0.005mol/L的磷酸缓冲液，搅拌均匀。于冰浴(0℃)中1800W超声破碎40分钟，将破碎好的藻液置于预冷的高速冷冻离心机中，8000转/分钟(rpm)4℃下离心45分钟，去掉沉淀，收集上清液；盐析在上清液中加入固体硫酸铵使之达到30％饱和度，5℃温度条件下静置16小时，7000转/分钟(rpm)4℃冷冻离心40分钟，弃去沉淀。上清液中继续加入固体硫酸铵至80％饱和度，低温(5℃)静置18小时，6000转/分钟(rpm)4℃冷冻离心40分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH7.1)溶解，在0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.1)中充分透析。
第一次羟基磷灰石柱层析将透析后的粗品液加到羟基磷灰石层析柱上，加样量为20ml，然后以0.005-0.05mol/L的线性梯度磷酸盐缓冲液(pH7.1磷酸盐缓冲液，含0.1mol/L氯化钠)洗脱，流速为1.2ml/min，洗脱总体积为800ml。用自动部分收集器收集洗脱液。将别藻蓝蛋白含量和纯度较高的收集液合并在一起，分别加入固体硫酸铵至80％饱和度，于低温(5℃)条件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-100)柱层析上述纯化收集的别藻蓝蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-100)分子筛柱上。用0.005mol/L的磷酸盐缓冲液缓冲液(pH值7.1)洗脱，控制流速在5ml/min，收集A650/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羟基磷灰石柱层析将数次盐析浓缩后的别藻蓝蛋白合并，以8000转/分钟(rpm)4℃冷冻离心50分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH7.1)溶解，在0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.1)中充分透析。将透析后的别藻蓝加到羟基磷灰石层析柱上，洗脱方法与第一次羟基磷灰石柱层析时相同，洗脱体积为1000ml，收集A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5和A650/A280＞5.0的部分。
2.别藻蓝蛋白晶体的制备将制备A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5或A650/A280＞5.0的别藻蓝蛋白溶液收集在烧杯中，放入密闭、闭光、恒低温条件(温度控制在10℃)的超净工作上。溶液中加入0.2％(质量/体积，M/V)的氯化镁和4％(质量/体积，M/V)氯化钠。
将pH传感器浸入液面下，通过pH自动调控装置调节液体的pH值始终稳定在pH7.1。
将固体硫酸铵溶解于0.005mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.1)中制备成100％饱和度的硫酸铵溶液，并用0.2μm的滤膜过滤除菌。
将饱和硫酸铵溶液缓慢滴加到所盛别藻蓝蛋白溶液中，并轻微搅动，使溶液混合均匀，流速控制在1ml/6min，直到溶液中的别藻蓝蛋白以晶体的形式基本析出完全为止。
将晶体混合溶液放入事先低温(5℃)预冷的真空抽滤器中抽滤，抽除滤液，然后用60％饱和度的硫酸铵溶液洗涤晶体5遍。
将所得到的别藻蓝蛋白晶体溶解于0.005mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.1)中，按照以上结晶的方法和步骤，实施重结晶，再结晶，即得最后的晶体产品。
将晶体产品存放于65％硫酸铵饱和的磷酸盐缓冲液溶液中，加入微量防腐剂，于低温(5℃)条件下长期保存。
3.别藻蓝蛋白结构的确定别藻蓝蛋白(APC)的结构是由脱辅基蛋白通过一个硫醚键共价连接藻蓝素(PCB)——一种开链四吡咯发色团组成的，连接位点通常在半胱氨酸残基α84(α亚基第84位氨基酸)和β84(β亚基第84位氨基酸)等保守位点上。等摩尔量的α和β亚基构成(αβ)异二聚体再到(αβ)3三聚体的结构，每个亚基只含有一个藻蓝素PCB。藻蓝素PCB可能呈半环状和伸展状两种构象，通过硫醚键连到多肽上。
α和β亚基分别由160和161个氨基酸组成。尽管α和β亚基的序列一致性只有38％，但它们的结构和折叠方式几乎一致。BE环(连接B螺旋和E螺旋)的第一部分在α亚基中完全暴露于溶剂并且不与发色基团相联系，而在β亚基中则与相邻单体的发色基团作用。BE环(连接B螺旋和E螺旋)的第二部分则显示了几乎一致的构相。作为一个显著的特征，α和β亚基BE环中都存在基序(motif)PGGNxY。APC的等电点约为4.6。
4.别藻蓝蛋白晶体结构的确定利用X-射线衍射的方法对本发明所制备的别藻蓝蛋白晶体结构进行分析，其结果如下别藻蓝蛋白的晶体结构属于P6322空间群，晶胞参数为a＝b＝101.9，c＝130.6，α＝β＝90°，γ＝120°，晶胞内的不对称单位中含有一个(αβ)单体。在P6322空间群中三聚体沿着c轴的方向相互连接，面对面的形成六聚体，但和PC，PE不同的是，在APC中β亚基提供了连接表面，发生在FG环(β120，β123-127，β173)。而且这种连接非常松散。
实施例41.别藻蓝蛋白的制备细胞破碎称取钝顶螺旋藻置入烧杯中，用蒸馏水清洗两次，加入pH值7.2、浓度0.005mol/L的磷酸缓冲液，搅拌均匀。于冰浴(0℃)中1800W超声破碎60分钟，将破碎好的藻液置于预冷的高速冷冻离心机中，10000转/分钟(rpm)10℃下离心40分钟，去掉沉淀，收集上清液；盐析在上清液中加入固体硫酸铵使之达到35％饱和度，10℃温度条件下静置8小时，10000转/分钟(rpm)、7℃冷冻离心35分钟，弃去沉淀。上清液中继续加入固体硫酸铵至80％饱和度，低温(10℃)静置8小时，10000转/分钟(rpm)7℃冷冻离心35分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶解，在0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)中充分透析。
第一次羟基磷灰石柱层析将透析后的粗品液加到羟基磷灰石层析柱上，加样量为30ml，然后以0.005-0.1mol/L的线性梯度磷酸盐缓冲液(pH7.2磷酸盐缓冲液，含0.1mol/L氯化钠)洗脱，流速为1.6ml/min，洗脱总体积为900ml。用自动部分收集器收集洗脱液。将别藻蓝蛋白含量和纯度较高的收集液合并在一起，分别加入固体硫酸铵至80％饱和度，于低温(10℃)条件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-100)柱层析上述纯化收集的别藻蓝蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-100)分子筛柱上。用0.005mol/L的磷酸盐缓冲液缓冲液(pH值7.2)洗脱，控制流速在5ml/min，收集A650/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羟基磷灰石柱层析将数次盐析浓缩后的别藻蓝蛋白合并，以10000转/分钟(rpm)7℃冷冻离心35分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶解，在0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)中充分透析。将透析后的别藻蓝加到羟基磷灰石层析柱上，洗脱方法与第一次羟基磷灰石柱层析时相同，洗脱体积为1000ml，收集A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5和A650/A280＞5.0的部分。
2.别藻蓝蛋白晶体的制备将制备A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5或A650/A280＞5.0的别藻蓝蛋白溶液收集在烧杯中，放入密闭、闭光、恒低温条件(温度控制在10℃)的超净工作上。溶液中加入0.2％(质量/体积，M/V)的氯化镁和4％(质量/体积，M/V)氯化钠。
将pH传感器浸入液面下，通过pH自动调控装置调节液体的pH值始终稳定在pH7.2。
将固体硫酸铵溶解0.005mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中制备成100％饱和度的硫酸铵溶液，并用0.2μm的滤膜过滤除菌。
将饱和硫酸铵溶液缓慢滴加到所盛别藻蓝蛋白溶液中，并轻微搅动，使溶液混合均匀，流速控制在1ml/6min，直到溶液中的别藻蓝蛋白以晶体的形式基本析出完全为止。
将晶体混合溶液放入事先低温(5℃)预冷的真空抽滤器中抽滤，抽除滤液，然后用60％饱和度的硫酸铵溶液洗涤晶体5遍。
将所得到的别藻蓝蛋白晶体溶解于0.005mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中，按照以上结晶的方法和步骤，实施重结晶，再结晶，即得最后的晶体产品。
将晶体产品存放于65％硫酸铵饱和的磷酸盐缓冲液溶液中，加入微量防腐剂，于低温(5℃)条件下长期保存。
3.别藻蓝蛋白结构的确定别藻蓝蛋白(APC)的结构是由脱辅基蛋白通过一个硫醚键共价连接藻蓝素(PCB)——一种开链四吡咯发色团组成的，连接位点通常在半胱氨酸残基α84(α亚基第84位氨基酸)和β84(β亚基第84位氨基酸)等保守位点上。等摩尔量的α和β亚基构成(αβ)异二聚体再到(αβ)3三聚体的结构，每个亚基只含有一个藻蓝素PCB。藻蓝素PCB可能呈半环状和伸展状两种构象，通过硫醚键连到多肽上。
α和β亚基分别由160和161个氨基酸组成。尽管α和β亚基的序列一致性只有38％，但它们的结构和折叠方式几乎一致。BE环(连接B螺旋和E螺旋)的第一部分在α亚基中完全暴露于溶剂并且不与发色基团相联系，而在β亚基中则与相邻单体的发色基团作用。BE环(连接B螺旋和E螺旋)的第二部分则显示了几乎一致的构相。作为一个显著的特征，α和β亚基BE环中都存在基序(motif)PGGNxY。APC的等电点约为4.6。
4.别藻蓝蛋白晶体结构的确定利用X-射线衍射的方法对本发明所制备的别藻蓝蛋白晶体结构进行分析，其结果如下别藻蓝蛋白的晶体结构属于P6322空间群，晶胞参数为a＝b＝101.9，c＝130.6，α＝β＝90°，γ＝120°，晶胞内的不对称单位中含有一个(αβ)单体。在P6322空间群中三聚体沿着c轴的方向相互连接，面对面的形成六聚体，但和PC，PE不同的是，在APC中β亚基提供了连接表面，发生在FG环(β120，β123-127，β173)。而且这种连接非常松散。
实施例51.别藻蓝蛋白的制备细胞破碎称取钝顶螺旋藻置入烧杯中，用蒸馏水清洗两次，加入pH值7.4、浓度0.005mol/L的磷酸缓冲液，搅拌均匀。于冰浴(0℃)中1800W超声破碎50分钟，将破碎好的藻液置于预冷的高速冷冻离心机中，7000转/分钟(rpm)10℃下离心50分钟，去掉沉淀，收集上清液；盐析在上清液中加入固体硫酸铵使之达到35％饱和度，4℃温度条件下静置8小时，7000转/分钟(rpm)10℃冷冻离心50分钟，4℃温度条件下静置12小时，7000转/分钟(rpm)10℃冷冻离心50分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解，在0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)中充分透析。
第一次羟基磷灰石柱层析将透析后的粗品液加到羟基磷灰石层析柱上，加样量为30ml，然后以0.005-0.3mol/L的线性梯度磷酸盐缓冲液(pH7.4磷酸盐缓冲液，含0.1mol/L氯化钠)洗脱，流速为2.5ml/min，洗脱总体积为600ml。用自动部分收集器收集洗脱液。将别藻蓝蛋白含量和纯度较高的收集液合并在一起，分别加入固体硫酸铵至80％饱和度，于低温(5℃)条件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-100)柱层析上述纯化收集的别藻蓝蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-100)分子筛柱上。用0.005mol/L的磷酸盐缓冲液缓冲液(pH值7.4)洗脱，控制流速在5ml/min，收集A650/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羟基磷灰石柱层析将数次盐析浓缩后的别藻蓝蛋白合并，以7000转/分钟(rpm)10℃冷冻离心50分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解，在0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)中充分透析。将透析后的别藻蓝加到羟基磷灰石层析柱上，洗脱方法与第一次羟基磷灰石柱层析时相同，洗脱体积为1000ml，收集A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5和A650/A280＞5.0的部分。
2.别藻蓝蛋白晶体的制备将制备A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5或A650/A280＞5.0的别藻蓝蛋白溶液收集在烧杯中，放入密闭、闭光、恒低温条件(温度控制在5℃)的超净工作上。溶液中加入0.2％(质量/体积，M/V)的氯化镁和4％(质量/体积，M/V)氯化钠。
将pH传感器浸入液面下，通过pH自动调控装置调节液体的pH值始终稳定在pH7.4。
将固体硫酸铵溶解于0.005mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中制备成100％饱和度的硫酸铵溶液，并用0.2μm的滤膜过滤除菌。
将饱和硫酸铵溶液缓慢滴加到所盛别藻蓝蛋白溶液中，并轻微搅动，使溶液混合均匀，流速控制在1ml/6min，直到溶液中的别藻蓝蛋白以晶体的形式基本析出完全为止。
将晶体混合溶液放入事先低温(5℃)预冷的真空抽滤器中抽滤，抽除滤液，然后用60％饱和度的硫酸铵溶液洗涤晶体3遍。
将所得到的别藻蓝蛋白晶体溶解于0.005mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，按照以上结晶的方法和步骤，实施重结晶，再结晶，即得最后的晶体产品。
将晶体产品存放于65％硫酸铵饱和的磷酸盐缓冲液溶液中，加入微量防腐剂，于低温(5℃)条件下长期保存。
3.别藻蓝蛋白结构的确定别藻蓝蛋白(APC)的结构是由脱辅基蛋白通过一个硫醚键共价连接藻蓝素(PCB)——一种开链四吡咯发色团组成的，连接位点通常在半胱氨酸残基α84(α亚基第84位氨基酸)和β84(β亚基第84位氨基酸)等保守位点上。等摩尔量的α和β亚基构成(αβ)异二聚体再到(αβ)3三聚体的结构，每个亚基只含有一个藻蓝素PCB。藻蓝素PCB可能呈半环状和伸展状两种构象，通过硫醚键连到多肽上。
α和β亚基分别由160和161个氨基酸组成。尽管α和β亚基的序列一致性只有38％，但它们的结构和折叠方式几乎一致。BE环(连接B螺旋和E螺旋)的第一部分在α亚基中完全暴露于溶剂并且不与发色基团相联系，而在β亚基中则与相邻单体的发色基团作用。BE环(连接B螺旋和E螺旋)的第二部分则显示了几乎一致的构相。作为一个显著的特征，α和β亚基BE环中都存在基序(motif)PGGNxY。APC的等电点约为4.6。
4.别藻蓝蛋白晶体结构的确定利用X-射线衍射的方法对本发明所制备的别藻蓝蛋白晶体结构进行分析，其结果如下别藻蓝蛋白的晶体结构属于P6322空间群，晶胞参数为a＝b＝101.9，c＝130.6，α＝β＝90°，γ＝120°，晶胞内的不对称单位中含有一个(αβ)单体。在P6322空间群中三聚体沿着c轴的方向相互连接，面对面的形成六聚体，但和PC，PE不同的是，在APC中β亚基提供了连接表面，发生在FG环(β120，β123-127，β173)。而且这种连接非常松散。
权利要求
1.一种别藻蓝蛋白溶液的制备方法，其特征在于，将藻细胞破碎后，通过过滤和0-4℃下，6000-10000转/分钟(rpm)高速冷冻离心分离，去除沉淀，收集上清，分级盐析后收集别藻蓝蛋白沉淀，沉淀溶解于磷酸盐缓冲液后依次经过羟基磷灰石、葡聚糖凝胶Sephadex G-100、羟基磷灰石柱层析，羟基磷灰石柱层析时使用浓度范围为0.005-0.4摩尔/升的线性梯度磷酸盐缓冲液洗脱，控制流速在0.5-2.5毫升/分钟，最后收集A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5、A650/A280＞5.0一种或多种不同纯度要求的别藻蓝蛋白溶液，制成不同纯度级别的别藻蓝蛋白溶液。
2.根据权利要求1所述的别藻蓝蛋白溶液的制备方法，其特征在于，所述别藻蓝蛋白溶液在羟基磷灰石柱层析过程中使用浓度范围为0.005-0.05摩尔/升的线性梯度磷酸盐缓冲液洗脱。
3.根据权利要求1所述的别藻蓝蛋白溶液的制备方法，，其特征在于，所述别藻蓝蛋白溶液在羟基磷灰石柱层析过程中使用线性梯度磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱流速控制在0.8-1.6毫升/分钟。
4.一种别藻蓝蛋白制备成晶体的方法，其特征在于，将一定纯度的别藻蓝蛋白放在闭光封闭的环境中，加入0.05-0.2％氯化镁和2-4％氯化钠，调节pH值使其在晶体的成长过程中始终稳定在pH5.8～7.4的范围内，并线性梯度地加入硫酸氨并轻微搅动，使其转变成粗晶体，通过重结晶，再结晶，即得最后的晶体产品。
5.根据权利要求4所述的一种别藻蓝蛋白制备成晶体的方法，其特征在于，所述的在晶体的成长过程中始终稳定在pH6.8～7.2的范围内。
6.一种别藻蓝蛋白晶体，分子结构由脱辅基蛋白通过一个硫醚键共价连接藻蓝素(PCB)，连接位点包括半胱氨酸残基α-84(α亚基第84位氨基酸)和β-84(β亚基第84位氨基酸)，α和β亚基构成(αβ)异二聚体由异二聚体在聚合成(αβ)3三聚体的结构，特征吸收峰为630～660nm，荧光发射峰为656～660nm，等电点为4.5～4.7。其特征在于所述的别藻蓝蛋白为晶体结构，所述的晶体结构属于P6322空间群。
7.根据权利要求6所述的一种别藻蓝蛋白晶体，其特征在于，所述的P6322空间群中三聚体沿着C轴的方向相互连接面对面的形成六聚体。
8.根据权利要求6或7所述的一种别藻蓝蛋白晶体，其特征在于，所述的别藻蓝蛋白晶体的晶胞参数为a＝b＝101.9，c＝130.6，α＝β＝90°，γ＝120°所述的晶胞内包含不对称单位。
9.根据权利要求8所述的一种别藻蓝蛋白晶体，其特征在于，所述的晶胞内的不对称单位中含有一个单体，所述的单体为αβ单体，所述的α和β亚基只含有一个藻蓝素(PCB)，所述的藻蓝素(PCB)基本上有半环状和伸展状两种构象组成，所述的藻蓝素(PCB)通过硫醚键连在多肽上。
10.根据权利要求6或7所述的一种别藻蓝蛋白晶体，其特征在于，所述的别藻蓝蛋白晶体的特征光谱吸收峰为650nm，荧光发射峰为658nm，等电点为4.6。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白、晶体制造工艺及制品，尤其涉及的是在一般条件下从藻类中提取的能发射强烈荧光的别藻蓝蛋白并将其转化为晶体形态，本发明别藻蓝蛋白晶体具有能够长期保存，所需的保藏条件要求小，荧光活性高的特点，其制作方法在普通的实验条件下就可以完成，简单易行；并在科研、医疗、检测、信电等领域得到广泛的应用。
文档编号C07K1/36GK1786025SQ200410089528
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者骆建华, 刘维国, 刘俊 申请人:刘维国