专利名称：一种与抗黄矮病基因Bdv2连锁的同源序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗黄矮病基因Bdv2连锁的抗病基因同源序列及其特异引物与应用。
背景技术：
中间偃麦草是异源六倍体的多年生小麦近缘植物，具有许多对小麦改良有益的基因，如抗黄矮病、抗条锈、叶锈、秆锈、白粉病以及耐旱、抗寒、优质等基因，其中抗黄矮病基因是栽培小麦缺乏的基因。中间偃麦草已广泛用于小麦改良。目前，已将中间偃麦草第7部分同源群染色体7X长臂上抗黄矮病基因Bdv2成功地导入小麦，育成抗黄矮病的小麦—中间偃麦草小片段易位系HW642、YW443、YW243及TC系等(辛志勇等.Sciences in China(Series B)，1991，34(9)1055-10621；张增艳等.中国农业科学，1998，31(3)1-4；Banks等.Genome，1995，38395-405)。为了更好地利用中间偃麦草的抗黄矮病基因，彻底防治病害，分离克隆该抗病基因、揭示其抗病分子遗传机制十分必要。
目前分离克隆功能产物序列未知的植物抗病(resistance，R)基因主要采用图位克隆法和转座子标签法。图位克隆时必须要对R基因进行精细定位，寻找与该基因紧密连锁的分子标记，再利用基因区段两侧的标记筛选基因组文库(YAC，BAC或TAC文库)，构建克隆重叠群，确定侯选基因所在的克隆，对此克隆进行亚克隆，经互补试验来证实基因的功能。转座子标签法需要有效的转座子体系。小麦不仅基因组庞大，基因组大小为1.6×1010bp，相当水稻基因组的近40倍，而且重复序列含量丰富，未发现有效的转座子体系，因此小麦抗病基因克隆一直是国际难题和研究热点，至今尚未有分离到小麦抗病基因的报道。小麦-中间偃麦草易位系中抗黄矮病基因Bdv2来源于中间偃麦草染色体7XL。由于中间偃麦草与小麦染色体间重组交换频率很低，难以精确定位7XL上分子标记与Bdv2间遗传距离，采用上述方法克隆分离克隆抗黄矮病基因Bdv2十分困难。然而，已克隆植物R基因编码的蛋白质结构具有一定保守性，如具有核苷酸结合位点(NBS)、富亮氨酸重复(LRR)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STK)等保守区域，该特点为利用同源序列法分离其它植物抗病基因提供了依据和一条快捷的新途径(Leister等.Nature genet，1996，14421-429；王石平等.植物学报，1998，40(1)43-51)。国内外学者已利用同源序列法从多种植物中分离克隆了多个(resistance gene analog，RGA)(Kanazin等.Proc Natl Acad SciUSA，1996，9311746-11750；Aarts等.Mol Plant-MicrobeInteract，1998，11251-258；Collin等.Mol Plant-Microbe Interact，1998，11968-978；郑先武等.水稻NBS-LRR类R基因同源序列.中国科学(C辑)，2001，31(1)42-50；Collins等.Genome，2001，44375-381)。但迄今未见有关中间偃麦草抗病基因类似物(RGA)的报道。
与抗病基因紧密连锁的RGA片段是从基因组文库中分离抗病基因侯选克隆的重要探针。传统筛选文库的方法是菌落原位杂交法。由于小麦—中间偃麦草小片段易位系基因组庞大(相当于普通小麦基因组，约1.6×1010bp)，采用通常方法构建、保存和筛选该基因组文库的工作量和资金非常巨大。为了减少保存文库和筛选文库所需的工作量和资金，本发明的发明人构建了抗黄矮病小麦—中间偃麦草易位系HW642的基因组TAC(transformation-competent artificial chromosome)文库(王晓萍，张增艳，刘耀光等.遗传学报，2002，29712-718)，以混合克隆池法保存，每一克隆池保存了1000个不同的重组克隆，其中一个特定克隆只占每个克隆池的1/1000，难以用传统的菌落原位杂交法进行有效筛选。刘耀光等建立了克隆池PCR(Pooled-PCR)法筛选TAC文库的方法，并从“中国春”小麦TAC文库中筛选到I型硫素基因(Liu Y G等.PlantJournal，2000，23(5)687-695)。克隆池PCR法筛选基因组文库较传统的菌落原位杂交法有以下优点①由于构建基因组文库时，以大肠杆菌作为受体，因此与大肠杆菌基因组DNA有部分同源性的DNA序列，在菌落原位杂交时，背景往往很深，易于掩盖阳性克隆的信息，通过克隆池PCR法筛选则可解决该问题。②每1个混合克隆池有1000个不同的克隆，其中一个特定克隆只占每个克隆池的1/1000。用菌落原位杂交筛选时杂交信号过弱会影响筛选结果。而PCR扩增的灵敏度高，克隆池PCR法能够检测到混合克隆池中每个克隆。③PCR法速度快，效率高，易操作。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗黄矮病基因Bdv2连锁的抗病基因同源序列及其编码的蛋白。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案分别根据已克隆抗病R基因的NBS、LRR和STK(丝氨酸/苏氨酸)激酶等保守结构，设计简并引物。以中间偃麦草基因组DNA、抗病易位系HW642基因组DNA及显微分离的7XL扩增产物为模板，进行PCR扩增。对预想的产物进行序列分析与RFLP分折，得到一种抗黄矮病基因Bdv2连锁的NBS类抗病基因同源序列TirgaZ1。
该抗黄矮病基因Bdv2连锁的同源序列TirgaZ1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；
2)编码序列表中SEQ ID №2多肽序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列；4)与序列表中SEQ ID №1互补的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №1，由537个碱基组成，其读码框为自5’端第1到537位碱基，具有NBS结构的保守域p-loop(kinase1)、kinase2、kinase3及domain1(GLPLA)。
该抗病基因同源序列TirgaZ1与Bdv2共分离，位于7XL上，是与Bdv2连锁的RGA基因片段，可作为筛选文库的探针。
抗黄矮病基因Bdv2连锁的同源序列TirgaZ1编码的蛋白，是具有序列表中序列2氨基酸序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
本发明的第二个目的是提供一种抗黄矮病基因Bdv2连锁序列TirgaZ1的专用引物，以便用PCR法高效地筛选TAC文库。
为了达到上述目的，本发明根据序列TirgaZ1设计了能够检测抗黄矮病基因Bdv2的专用引物SC-TZ1，是5’端的前六个核苷酸为gtatga和aggcaa的由6-30个核苷酸组成的核苷酸序列，其中优选的是与序列表中的SEQ ID №3、4限定的DNA序列具有90％以上同源性的核苷酸序列，最优选的是TZ1U+TZ1L，即序列表中的SEQ ID №3、4。用该引物能够在含有Bdv2的抗黄矮病材料中扩增出约460bp的单一产物，而感病材料中无任何扩增产物，因此可作为引物，用于PCR法筛选文库。
本发明的TirgaZ1可以作为筛选抗黄矮病侯选基因的探针得到广泛应用。用SC-TZ1为引物筛选抗黄矮病候选基因发明人已经用引物SC-TZ1及克隆池PCR法，筛选了抗黄矮病小麦—中间偃麦草易位系HW642的基因组TAC文库，获得了4个阳性单克隆T1，T2，T3，T4。用限制性内切酶分析确定该4个阳性克隆分为2类，T1，T2，T3为1类，T4为另1类，插入片段分别为23、25kb左右，它们具共有序列也有不同序列。然后用TirgaZ1片段作探针，对T1和T4进行Southern杂交分析，发现这2个克隆为含有NBS类R基因片段TirgaZ1的侯选抗病基因克隆。Southern杂交结果表明，阳性克隆T1和T4是中间偃麦草易位染色体片段7XL的侯选抗黄矮病基因克隆。
本发明不仅筛选出抗黄矮病基因Bdv2连锁的抗病基因同源序列，也可为筛选抗病基因，揭示植物抗病分子机制，彻底防治植物病害，提供了坚实的基础。对于快速培育优良的抗病作物品种，提高作物的产量和品质具有重要的意义。
图1为RGA引物扩增基因组DNA的电泳分析图2为TirgaZ1/EcoRI的Southern杂交结果图3为以TZ1U+TZ1L为引物扩增的结果图4为第二轮筛选TAC文库部分结果图5为TZ1U+TZ1L扩增阳性克隆和对照图6为TirgaZ1作探针与内切酶消化阳性克隆产物的Southern杂交具体实施方式
实施例1、中间偃麦草RGA的克隆与序列分析材料携有抗黄矮病基因Bdr2的小麦—中间偃麦草易位系HW642、YW443、YW243、Y991029及附加系L1、中间偃麦草；感病材料感病系HW641S(HW642姊妹系)、小麦亲本中8601、中7902、中国春(CS)，Vilmorin 27(Vi)；小麦—中间偃麦草易位系HW642基因组TAC文库(王晓萍，张增艳，刘耀光等.遗传学报，2002，29712-718)；均由中国农业科学院作物育种栽培研究所，农业部作物遗传育种重点实验室培育、收集、构建、保存1)RGA引物的设计和PCR扩增分别根据已克隆R基因的NBS、LRR和STK(丝氨酸/苏氨酸)激酶等保守结构，设计简并引物。
以中间偃麦草基因组DNA、抗病易位系HW642基因组DNA及显微分离的7XL扩增产物为模板，分别利用表1中的引物对进行PCR扩增。PCR扩增反应总体积为25ul，反应液组成10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μmol/L，模板DNA 50ng，正反引物各0.4～0.5μmol/L，Taq聚合酶1U，加水至25μl，覆以石醋油1滴，在PCR扩增仪(Perkin Elmer Cetus，DNA Thermal cycle480)上进行。程序如下94℃预变性5min，再进行35个循环(94℃45s，50℃ 1.5min，72℃ 1.5min)，最后72℃延伸10min。
2)PCR产物的克隆与分析PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液进行分析。电泳结果表明，除NLRRR+NLRRF引物对外，其余9对引物分别在中间偃麦草基因组DNA中扩增到1～3条理想带(如图1所示)。图1中样品1、6、11、15、20、25、307XL；2、7、16、21、26、31HW642；4-6、8-10、12-14、17-19、22-24、27-29、32-34中间偃麦草；引物1-3K2A/EGF引物对；4EGF；5K2A；6-7NLRRF/NLRRR引物对；9NLRRR；10NLRRF；11-12RFKF/RLKR引物对；13RLKR；14RLKR；15-17S1/AS1引物对；18AS1；19S1；20-22ST2F/ST2R引物对，23ST2R；24ST2F；25-27CF9F/CF9R；28CF9R29CF9F；30-32K1A/HD引物对；33HD；34K1A；Mλ/EcoRI+HindIII分子marker。
用玻璃奶试剂盒回收中间偃麦草及7XL的预想PCR扩增片段，回收产物用pGEM-Teasy vector(Promega)连接，电激转化E.coli JM109菌株感受态细胞，涂于含IPTG、X-gal和氨苄青霉素(75mg/ml)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单个白色菌落，液体LB培养后用碱裂解法提取质粒DNA。以最接近克隆位点的EcoRI酶切来检测插入片段的有无与大小，再用Sau3AI酶解重组克隆进行初步分类，每类抽取1-2个克隆，采用T7或SP6引物测定插入片段的序列，用Blast软件在GenBank数据库进行同源序列搜索。结果表明，获得10个具有开放阅读框的中间偃麦草RGA，分别属于NBS，STK，LRR类。
实施例2、与抗黄矮病基因Bdv2连锁的RGA的鉴定与转化1)RFLP分析RFLP分析程序参见张增艳等(Science in China(Series C)，1999，42(6)663-668)。利用中间偃麦草RGA片段为探针，对EcoRI、EcoRV、BamHI、HindIII、DraI、PstI、XhoI、XbaI、BglII限制性内切酶消化的中间偃麦草、HW642、HW641S和小麦亲本中8601等基因组DNA进行RFLP分折。结果表明，大多数RGA片段/酶切组合没有多态性，只有1个RGA片段TirgaZ1(即序列表中的序列1，其编码蛋白序列为序列2)与EcoRI酶切组合，能够检测出抗病杂交带；进一步扩大抗病与感病样品，结果表明，TirgaZ1/EcoRI组合能够在含有Bdv2的抗病材料(中间偃麦草，L1、抗病易位系HW642、YW443、YW243、Y991029及F2抗病单株)中检测到约3.5kb的特异杂交带，而没有Bdv2的感病系HW641S，感病小麦亲本中7902、Vi、CS及F2感病单株没有上述特异杂交带(如图2所示)，图中，1-2中间偃麦草，37XL，4-7抗病易位系，8-9感病系和小麦亲本。说明TirgaZ1是Bdv2连锁的RGA基因片段，可作为筛选文库的探针。
分析TirgaZ1序列，其具有NBS结构的保守域p-loop(kinase1)、kinase2、kinase3及domain1(GLPLA)。该序列含有537bp碱基，其读码框为自5’端第1到537位碱基。
2)特异PCR标记的建立为了用PCR法高效地筛选文库，根据TirgaZ1序列及其与大肠杆菌基因组序列比较的结果，分别从5‘端88-112碱基、447-470碱基设计了1对特异PCR引物，见序列表中的序列3和4，TZ1UGTA TGA TGG TAA AGC TTT GCT GCT A
TZ1LAGG CAA CTT CTT GGG TCA CTG TAT优化PCR扩增条件后，以具有Bdv2抗病材料和没有Bdv2的感病材料的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。结果表明，TZ1U、TZ1L能够在具有Bdv2的抗黄矮病材料中扩增出约460bp的单一产物，而感病材料中无任何扩增产物(图3)，说明特异的TirgaZ1/EcoRI标记成功地转换为经典的特异PCR标记(SC-TZ1)，可用于PCR法筛选文库。图3中，CS、Vi、中7902、中8601、HW641S为感病材料，7XL、YW243、YW443、HW642、Y991029、L1、TAF46、中间偃麦草为抗黄矮病材料，M为Marker。
实施例3、抗病易位系基因组TAC文库的筛选1)克隆池PCR法进行TAC文库筛选用碱裂解法提取抗病易位系HW642的基因组TAC文库的所有混合质粒。通过克隆池PCR法进行筛选第1轮筛选以1000个混合克隆的质粒作为一个扩增模板进行；第2轮筛选将初级阳性克隆池稀释铺单板、收集50-60个克隆构成次级克隆池作为1个扩增模板，第三轮筛选是将次级阳性克隆池再次稀释分离单菌落作为扩增模板。PCR扩增反应总体积为25μl，其组成为10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，dATP、dTTP、dGTP、dCTP各0.2mmol/L，Taq聚合酶1U，10-50ng质粒，特异PCR引物TZ1U+TZ1L各为0.5μmol/L，补水至25μl，反应在PCR仪9600或PTC-100上进行，扩增程序95℃变性3min，(94℃ 45s，64℃ 1min，72℃ 1.5min)35个循环；然后72℃延伸10min。
通过第一轮筛选，分离到3个初级阳性克隆。每个初级克隆池稀释涂布，50-60个菌构成1个次级克隆池，再次pooled-PCR筛选，获得13个次级阳性克隆池(如图4所示，为1-17个次级克隆池)，将次级阳性克隆池稀释铺成单菌落，对每个次级阳性克隆池挑取96-192个单菌落分别做模板进行PCR筛选，获得4个阳性单克隆T1，T2，T3，T4。同时用引物对TZ1U+TZ1L扩增这4个单克隆和抗病对照(中间偃麦草Ti、抗病易位系HW642R)与感病对照(感病系HW641SS、小麦亲本8601)基因组DNA。结果(图5)表明，这4个阳性单克隆与抗病对照扩增带一致，4个阳性单克隆为侯选克隆。
2)阳性单克隆的鉴定用EcoRI、EcoRV、NotI、PstI、ScaI、XhoI、HindIII、XbaI、BamHI等9种限制性内切酶消化上述4个阳性TAC克隆质粒，结果表明4个阳性克隆分为2类，T1，T2，T3为1类，T4为另1类，插入片段分别为23、25kb左右，它们有共有序列也有不同序列。然后将阳性克隆T1和T4的酶切产物碱变性后转移到尼龙膜上，用标记的TirgaZ1片段作探针，进行Southern杂交分析。结果表明，各种酶切产物均有明显的不同杂交带，并且同一酶切产物杂交带中包含1-2条相同带和1-3相异带(如图6所示)，说明这2个克隆为含有NBS类R基因片段TirgaZ1的抗病侯选基因克隆。
将阳性克隆T1和T4的酶切产物碱变性后转移到尼龙膜上，分别以中间偃麦草、抗病易位系HW642、小麦亲本中8610基因组DNA(约30ng)作探针，进行Southern分析，程序同上。由Southern分析图谱可知，阳性克隆T1、T4的XhoI，EcoRV，EcoRI，PstI酶切产物，能与中间偃麦草、HW642的基因组DNA杂交出与小麦杂交不存在的特异杂交带，说明阳性克隆T1和T4插入片段中有中间偃麦草特异片段。
上述结果说明，阳性克隆T1和T4是来源于抗黄矮病易位系的中间偃麦草易位染色体片段7XL的抗黄矮病侯选基因克隆。
序列表<160>4<210>1<211>537<212>DNA<213>中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)<400>1caacgctagt ggcaatccat cacatttctt tgcaagcttt ctcccaagtt tttcaaactc 60gtccacatca cgtatggcag accttttgta tgatggtaaa gctttgctgc taaatagttc120ccaacttttc tcttcatcta acttcttcaa atgatgaaca tgggttggca tttggacatg180atttgcaaca tcttccttcc gggtggttaa tagtactcta ctaccattag ttgcatctgg240aaaagcttta acccttttat ttatctggtc ccatgtgtcg gtttcccaca catcatcaag300aactaccaag tatctttttt gcaatagaaa atcatggatc tcctttccca cctcatactc360attcatctta gcaattgact catctctgcc ccccattatt tgtttcataa tatcctttag420taaatcaatg cccttgaatt tttgagatac agtgacccaa gaagttgcct caaagtgttg480tttgacacta gatgaagtgt atacttttct agcgagcgtt gtcttcccaa ccccacc 537<210>2<211>179<212>PRT<213>中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)<400>2Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Ala Arg Lys Val Tyr Thr Ser1 5 10 15Ser Ser Val Lys Gln His Phe Glu Ala Thr Ser Trp Val Thr Val20 25 30Ser Gln Lys Phe Lys Gly Ile Asp Leu Leu Lys Asp Ile Met Lys35 40 45Gln Ile Met Gly Gly Arg Asp Glu Ser Ile Ala Lys Met Asn Glu50 55 60Tyr Glu Val Gly Lys Glu Ile His Asp Phe Leu Leu Gln Lys Arg65 70 75Tyr Leu Val Val Leu Asp Asp Val Trp Glu Thr Asp Thr Trp Asp80 85 90
Gln Ile Asn Lys Arg Val Lys Ala Phe Pro Asp Ala Thr Asn Gly95 100 105Ser Arg Val Leu Leu Thr Thr Arg Lys Glu Asp Val Ala Asn His110 115 120Val Gln Met Pro Thr His Val His His Leu Lys Lys Leu Asp Glu125 130 135Glu Lys Ser Trp Glu Leu Phe Ser Ser Lys Ala Leu Pro Ser Tyr140 145 150Lys Arg Ser Ala Ile Arg Asp Val Asp Glu Phe Glu Lys Leu Gly155 160 165Arg Lys Leu Ala Lys Lys Cys Asp Gly Leu Pro Leu Ala Leu170 175 179<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gtatgatggt aaagctttgc tgcta 25<210>4<211>
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4aggcaacttc ttgggtcact gtat 2权利要求
1.一种抗黄矮病基因Bdv2连锁的抗病同源序列TirgaZ1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2多肽序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列；4)与序列表中SEQ ID №1互补的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的连锁序列TirgaZ1，其特征在于所述连锁序列的核苷酸序列是序列表中的SEQ ID №1。
3.一种抗黄矮病基因Bdv2连锁的抗病同源序列TirgaZ1编码的蛋白，是具有序列表中序列2氨基酸序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于它是具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。
5.一种抗黄矮病基因Bdv2连锁序列TirgaZ1的专用引物SC-TZ1，是5’端的前六个核苷酸为gtatga和aggcaa的由6-30个核苷酸组成的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的专用引物SC-TZ1，其特征在于所述SC-TZ1核苷酸序列是与序列表中的SEQ ID №3、4限定的DNA序列具有90％以上同源性的序列。
7.根据权利要求5或6所述的专用引物SC-TZ1，其特征在于所述SC-TZ1核苷酸序列是序列表中的SEQ ID №3、4。
8.权利要求1所述的连锁的抗病同源序列TirgaZ1作为筛选抗黄矮病候选基因探针的应用。
9.一种筛选抗黄矮病候选基因的方法，其特征在于用SC-TZ1为引物进行筛选。
全文摘要
本发明公开了一种抗黄矮病基因Bdv2连锁的抗病同源序列及其专用引物与应用。该连锁序列TirgaZ1与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，其蛋白序列是具有序列表中序列2氨基酸序列的蛋白质。将TirgaZ1转化为稳定的PCR专用引物SC－TZ1，即与序列表中的SEQ ID №3、4限定的DNA序列具有90％以上同源性的序列。本发明还提供了一种利用上述引物筛选抗黄矮病候选基因的方法，以TirgaZ1为探针，筛选得到四个抗黄矮病候选基因，并对其中一个克隆T1进行测序。本发明为筛选抗病基因，彻底防治植物病害提供了坚实的基础，对快速培育优良的抗病作物，提高作物的产量和质量具有重大的意义。
文档编号C12P19/34GK1566345SQ03146360
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月10日 优先权日2003年7月10日
发明者张增艳, 辛志勇, 许景升, 王晓萍, 刘耀光, 林志珊, 李连城, 马有志, 徐惠君, 陈孝 申请人:中国农业科学院作物育种栽培研究所