一种重组人源性抗乙肝表面抗原(HBsAg)Fab抗体及其制取方法

专利名称：一种重组人源性抗乙肝表面抗原(HBsAg)Fab抗体及其制取方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体及其制取方法，特别是一种人源性抗HBsAg Fab抗体及其制取方法，属于生物制品领域。
背景技术：
乙型肝炎是一种世界范围的流行性传染病，全球乙肝病毒携带者有三亿人之多，其中我国乙肝病毒携带者有一亿多，乙型肝炎患者一千多万。据世界卫生组织统计，全世界每年死于该病者多达一百多万，临床缺乏有效的治疗方法。由于目前还没有治疗乙型肝炎的有效手段，因此预防其感染在控制该病的传染上显得尤为重要，使预防成为防治乙型肝炎的重点。
血源性抗乙肝表面抗原抗体可用于乙型肝炎的被动免疫，可有效地预防乙肝病毒急性感染。能与乙肝病毒表面抗原结合并阻止其侵袭肝细胞的乙肝表面抗体或其抗体片段是唯一能用于紧急预防的被动免疫生物制品，单独或与疫苗制成的免疫复合物还可防止乙型肝炎的母婴传播。但是，血源性抗体的来源却相当有限且具有潜在的传染性，给它的应用带来限制。
基因工程生产的人源性抗体或其单链抗体可代替血源性抗体在临床上具有防治乙型肝炎病毒的很好的应用前景，如防治新生儿乙型肝炎病毒的垂直传播、肝脏移植病人的病毒控制和用于制备治疗性乙肝疫苗等。Fab(抗原结合段，fragment ofantigen binding)抗体具有全抗体相同的抗原结合活性，且糖基对抗原抗体的结合活性没有影响。
甲醇酵母表达系统是近年来发展最快和最具潜能的的真核表达系统，表达量高，可进行分泌型表达且其培养基成分简单，有利于目的蛋白纯化等优点，已被成功地应用于多种异源蛋白高水平表达和商业化大规模生产。
对于基因工程人乙肝表面抗体的研究，目前国内外均应用噬菌体展示文库技术获得其Fab段基因，然后应用大肠杆菌表达，但其问题是Fab抗体呈双链，在大肠杆菌中进行分泌型表达，表达量很低，进行包涵体表达又难以复性。有人将其重新构建成IgG置于CHO细胞中表达，但其表达量极低，难以规模化生产。而重组成单链抗体在大肠杆菌中表达仍然存在变性复性的问题。应用甲醇酵母系统进行重组蛋白表达的表达量相当高，既可以分泌型表达，也可以胞内表达。由于真核表达系统胞内表达的蛋白是有活性的蛋白，属可溶性蛋白，无需复性处理，因此，非常有利于作为抗体的表达系统。国外应用此系统表达一些单链抗体已获成功，但应用于乙肝表面抗体则未见报道。国内尚未见进行这方面的研究。

发明内容
本发明的目的在于提供一种用作人乙肝表面抗体的重组人源性抗HBsAg抗体，所述抗体具有较强的HBsAg结合活性和抗原特异性和结合乙肝表面抗原的能力。
本发明的另一目的在于提供一种制取用作人乙肝表面抗体的重组人源性抗HBsAg抗体的方法，所述方法采用甲醇酵母表达载体，两步法转化酵母，表达量很高，表达出的抗体片段与原始基因序列推导出的一致。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种人源性抗HBsAg Fab抗体片段基因，包括下述序列结构人源性抗HBsAg Fab重链(Fd链)基因序列CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGACATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGCTGGGGGGGCAGCAGCTGGTACGGGGACGGCCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTAGC人源性抗HBsAg Fab轻链(k链)基因序列GACATTGTGTTGACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTTCAGGGGAAGGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAACGGCCAATTAACCTGG
TACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCACCAGTATGATGGCTCCCCGGAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAATCGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGATCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG一种用作人乙肝表面抗体的重组人源性抗HBsAg抗体，具有如下的氨基酸序列结构人源性抗HBsAg Fab抗体重链氨基酸序列FEQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAGGAAAGTGTAYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTS人源性抗HBsAg Fab抗体轻链氨基酸序列DIVLTQSPGTLSLSSGEGATLSCRASQSVSNGQLTWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYDGSPETFGQGTKVEINRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLRSPVTKSFNRGEC上述重组人源性抗HBsAg抗体的制备方法为利用噬菌体展示技术，获得一株人源性抗HBsAg Fab片段的基因，在原核表达系统中进行表达，在此基础上，利用PCR技术将Fab的轻重链基因扩增出来，构建到甲醇酵母表达载体中，转化酵母，构建Fab工程菌，分泌表达生产Fab抗体片段。
对该抗体结合活性进行的研究显示，该Fab抗体具有较强的HBsAg结合活性和抗原特异性。
其中人源性抗HBsAg Fab片段的基因的获得采用如下方法对乙肝疫苗志愿者加强免疫注射后取血，分离单核细胞，提取mRNA，反转录合成cDNA，用设计好的引物PCR扩增出抗体的轻链基因和重链Fd的片段基因，分别插入到载体pComb3H的相应位点构建含有抗体轻链和重链Fd段的载体质粒。用该质粒转化XL1-Blue，重组菌体在SB培养基中培养，然后加入噬菌体VCSM13培养，其上清即为噬菌体抗体库。
其中Fab抗体酵母表达体系的建立-工程菌的构建及表达采用如下方法采用Pichia pastoris载体系统(购自Invitrogen公司，见EasyselectTMPichia Expressionkit，A manual of Methods for Expression of Recombinant proteins Using pPICZ and pPICZαin Pichia pastoris)，构建高效分泌表达Fab的酵母工程菌，可以进一步提高抗HBsAg抗体Fab段的表达量，并能大规模发酵来生产Fab抗体，并对该Fab抗体进行分泌表达和纯化，使纯化的Fab抗体纯度达到95％以上。
本发明对重组Fab抗体的等电点(PI)、与HBsAg结合能力(ELISA测定)、抗乙肝表面抗原单链抗体(以下简称为ScFv)单克隆抗体的制备、鼠抗ScFv单克隆抗体结合能力、分子量测定以及重组Fab抗体活体中HBsAg进行了测定。质谱分子量分析和肽图分析证明表达出的Fab抗体片段与原始基因序列推导出的大小一致。ELISA试验、2215细胞(表面)抗原中和试验以及乙肝表面抗原转基因小鼠的中和试验表明，分泌表达的Fab抗体片段具有很强的结合乙肝表面抗原的能力。因而在临床上可用于治疗重型乙型肝炎、慢性乙型肝炎、乙型肝炎的母婴垂直传播、暴露者被动免疫保护及肝移植保护等。


图1为本发明所述的重链序列图2为本发明所述的轻链序列图3为本发明所述人源性抗HBsAg Fab重链(Fd段)基因序列同源性比较图4为本发明人源性抗HBsAg Fab轻链(k链)基因序列同源性比较具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
一、噬菌体展示技术获得抗HBs Fab抗体片段基因对乙肝疫苗志愿者加强免疫注射后第五天取血，分离单核细胞，提取mRNA，反转录合成cDNA，用设计好的引物PCR扩增出抗HBsAg抗体的轻链基因和重链Fd的段基因，分别插入到载体pComb3H(Carlos F.Barbas and Dennis R.Burton，1994，ColdSpring Harbor Laboratory，Monoclonal Antibodies from combinatorial Libraries)的相应位点构建含有抗体轻链和重链Fd段的载体质粒。用该质粒转化XL1-Blue(CarlosF.Barbas and Dennis R.Burton，1994，Cold Spring Harbor Laboratory，MonoclonalAntibodies from combinatorial Libraries)，重组菌体在SB培养基[Super-Broth，含3％Tryptone(购自OXOID公司)，2％ yeast extract(购自OXOID公司)，1％Mops，Ph7.0]中培养2小时后加入噬菌体VCSM13(Carlos F.Barbas and Dennis R.Burton，1994，Cold Spring Harbor Laboratory，Monoclonal Antibodies from combinatorial Libraries)培养过夜，其上清即为噬菌体抗体库。
1、引物设计重链(VH)5′引物为VH1aCAGGTGCAGCTCGAGCAGTCTGGGVH1fCAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGGVH2fCAGGTGCAGCTACTCGAGTCGGGVH3aGAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGGVH4fCAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGGVH4gCAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGGVH6aVAGGTACAGCTCGAGCAGTCAGG重链3’引物CG1aGCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGGCG2aCTCGACACTAGTTTTGCGCTCAACTGTCTTCG3aTGTGTGACTAGTGTCACCAAGTGGGGTTTTCG4aGCATGAACTAGTTGGGGGACCATATTTGGAK链5’引物；V1a GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCAV2a GATATTGAGCTCACTCAGTCTCCAV3a GAAATTGAGCTGACGCAGTCTCCAK链3’引物5’--ACT GTG GCT GCA CCA TCT G--32、PCR的扩增分别取1ul上述反应物为模板，10倍的PCR缓冲液(500mM KCl；100mM Tris.ClPH8.3；20mM MgCl2)，1.5ul的0.1mMdNTP，1.2ul的20uM不同组合的3’，5’端引物，0.5ul的Vent DNA聚合酶(购自基因有限公司)，12.75ul的双蒸水。反应30个循环(94℃，45秒，50℃60秒，72℃120秒)，反应产物用1.2％琼脂糖(购自Promega公司)电泳回收。
3、噬菌体抗体的筛选向预先包被HBsAg的微孔板内，每孔加入全套抗体库液50ul，37℃温育2小时，弃上清，用适量的0.5％Tween20的TBS(含50mmol/L Tris Base，150mmol/L Nacl)清洗数遍。每孔加入50ul洗脱缓冲液，吸出孔内液体，室温放置10min，用适量的2mol/LTris调PH至中性。用洗脱液感染2ml新鲜制备的XL1-blue，培养6-8小时，加辅助噬菌体VCSM13继续培养过夜，重新获得噬菌体，重复上述步骤，3轮筛选后收集感染的细菌，提取双链噬菌体DNA(含Fab抗体基因)。
4、阳性克隆的的序列分析及同源性比较从筛选到的抗HBsAg的Fab阳性的克隆，即为含Fab抗体基因的克隆。将抗体的轻、重链基因片段插入到测序载体测序鉴定，结果如图1，同源性比较如图2、图3。
二、Fab抗体酵母表达体系的建立-工程菌的构建及表达为了进一步提高抗HBsAg抗体Fab段的表达量，并能大规模发酵来生产Fab抗体，以开发抗乙型肝炎病毒的新药，本发明选用近年来发展最快的Pichia pastoris载体系统，构建高效分泌表达Fab的酵母工程菌，并对该Fab抗体进行分泌表达和纯化。
1、引物设计为Fab重链(H链)基因上游引物为5’-CGGAATTCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT-3’下游引物为5’-GGGGTACCTTAGCTAGTTTTGTCACAAGA-3’。
Fab轻链(L链)基因上游引物为5’-GGAATTGTGTTGACCCAGTCT-3’，下游引物为5’-CGGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTGA-3’。
2、载体构建以噬菌体抗体筛选得到的阳性克隆为模板，在50ul反应体系中加入5ul反应缓冲液(500mM KCl，100mM Tris.Cl PH8.3，20mM MgCl2)，1.5ul 0.1mol/L的dNTPs(Gene公司)，1ul的20uM不同组合的3’，5’端引物，0.5ul的Vent DNA聚合酶(Gene公司)，补加双蒸水至50ul。反应30个循环(95℃*45秒，60℃*60秒，72℃*120秒)，反应产物用1.2％琼脂糖电泳回收。将H、L链的PCR产物回收EcoR I和Xba I双酶切，分别插入到克隆载体pGEM-7Zf相应的EcoR I和Xba I酶切窗口上，构建H、L链基因的克隆载体，对这两个克隆载体进行序列测定，结果表明克隆的H、L链基因的碱基序列与预期的完全一致。EcoR I和Xba I双酶切出重链基因片段，连接到载体pPICZα(购自Invitrogen公司，见EasyselectTMPichia Expression kit，A manual ofMethods for Expression of Recombinant proteins Using pPICZ and pPICZα in Pichiapastoris)的强启动子PAOXI下游的相应酶切窗口上构建酵母表达载体pPICZα-A-H，BamH I和EcoR I双酶切出轻链基因片段，插入到载体质粒pPIC9K强启动子PAOXI下游的BamH I+EcoR I酶切窗口中，构建表达载体pPIC9K-L。
3、工程菌的构建表达载体pPIC9K-L转化Pastoris pichia酵母GS115(购自Invitrogen公司，见EasyselectTMPichia Expression kit，A manual of Methods for Expression of Recombinantproteins Using pPICZ and pPICZα in Pichia pastoris)，G418(Geneticin，一种抗生素，购自GIBCO公司)抗性平板筛选重组酵母，得到表达Fab L链基因的重组酵母，分别挑取筛选出的多拷贝重组子单菌落，接种到发酵培养基中，28℃培养至OD600约为5-6左右，离心收菌，重悬于BMMY培养基[含2％Tryptone(购自OXOID公司)，1％yeastextract(购自OXOID公司)，100mM磷酸盐(pH6.0)，1.34％YNB(购自Invitrogen公司)，4×10-5％biotin(购自Invitrogen公司)，0.5％甲醇(购自广州化学试剂厂)]中进行甲醇诱导培养，培养上清液进行SDS-PAGE和Western Blotting分析，结果显示，在分子量约为28KD处，可见重组子表达上清中有特异的轻链蛋白带。再以此表达量最高的重组酵母为宿主菌，将表达载体pPICZα-A-H转入，用Zeocin(一种抗生素，购自Invitrogen公司)抗性板筛选得到Fab工程菌。分别挑取筛选出的多拷贝重组酵母GS115/Fab的单菌落，接种到BMGY培养基[含2％Tryptone(购自OXOID公司)，1％yeast extract(购自OXOID公司)，100mM磷酸盐(pH6.0)，1.34％YNB(购自Invitrogen公司)，4×10-5％biotin(购自Invitrogen公司)，1％甘油(购自广州化学试剂厂)]中，28℃培养至OD600约为5-6左右，离心收菌，重悬于BMMY培养基中进行甲醇诱导培养，对诱导培养第4天的培养液上清分别进行SDS-PAGE和WesternBlotting分析，结果显示，在分子量28KD附近有两条特异蛋白带。非还原处理的SDS-PAGE结果显示，在45KD附近有一条特异的蛋白带，分子量大小与理论计算的一致。ELISA分析表明表达产物具有较强的结合HBsAg的能力。
三、重组人源性抗HBsAg Fab抗体酵母工程发酵工艺研究重组人源性抗HBsAg Fab抗体酵母工程菌通过摇瓶培养，其重组Fab抗体的表达量可达到30～50mg/L。在此基础上我们对该工程菌进行了5L发酵罐的发酵研究，初步确立的重组Fab抗体酵母工程菌的发酵工艺。从新鲜YPD[含2％Tryptone(购自OXOID公司)，1％yeast extract(购自OXOID公司)，2％葡萄糖(购自广州化学试剂厂)，2％琼脂粉]平板挑重组人源性抗HBsAg Fab抗体酵母工程菌GS115/Fab23或GS115/Fab51单菌落接种于100ml种子培养基中，30℃振荡培养20-24小时备用。按10％接种量接入2.5L发酵基础培养基中(5L发酵罐内)，用氨水调PH至5-6。发酵开始搅拌转速为500rpm，30C恒温发酵。当溶氧加速上升时，开始流加补料生长培养基(流加速率维持溶氧大于20％)。当光密度OD600为150-250左右时，停止补料，甘油耗尽后流加发酵诱导培养基。通过调节转速、罐压、通气量和甲醇流加速率使溶氧大于20％。发酵液的甲醇浓度控制在10g/L，诱导发酵100小时左右。经分析发酵上清总蛋白达到2.2g/L，目的蛋白约占总蛋白的19.3％。发酵液最后的蛋白量基本处于最高水平。
四、人源性抗HBsAg Fab抗体的纯化工艺研究根据酵母表达的人源性抗HBsAg Fab抗体的特点，从经济、实用、纯化效率等方面为出发点，我们设计了三套纯化方案，采用两种亲和层析方法和离子交换层析法，对酵母表达的人源性抗HBsAg Fab抗体的纯化方法进行了比较研究。三套纯化方案均达到了从酵母诱导表达的培养液中高效纯化人源性抗HBsAg Fab抗体的目的。
1、抗Fab抗体亲和层析柱纯化重组人源性抗HBsAg Fab抗体诱导表达的培养上清液先用(NH4)2SO4沉淀，脱盐后用羊抗人Fab偶联的HiTrap抗体柱(Pharmacia公司)进行亲和纯化。用0.1mol/L的Tris.Cl(PH8.0)平衡，流速1ml/min，1小时后上样，上样完后改用10倍柱体积0.1mol/L的Tris.Cl(PH8.0)缓冲液洗涤，再用10倍柱体积的0.01mol/L的Tris.Cl(PH8.0)的缓冲液进行洗涤。将杂蛋白全部洗出后改用0.1mol./L的甘氨酸(PH 3.0)缓冲液进行洗脱，280nm检测洗脱蛋白峰，收集蛋白峰(第一洗脱峰)。SDS-PAGE电泳鉴定，纯化的Fab抗体的纯度达到90％以上。将亲和纯化的Fab抗体进一步做分子筛(Sephadex G75)层析纯化。用0.01mol/L Tris.Cl(PH8.0)缓冲液平衡，流速0.6ml/min，上样后用同样的缓冲液进行洗脱，280nm检测蛋白峰，收集目的蛋白峰(第一峰)。SDS-PAGE电泳鉴定，纯化的Fab抗体的纯度可达到95％以上。
2、鼠抗HBs ScFv单克隆抗体亲和层析柱纯化重组人源性抗HBsAg Fab抗体(1)鼠抗HBs ScFv单克隆抗体的制备为了方便后期重组Fab抗体产品的检测和纯化，我们用与该Fab抗体基因序列同源的ScFv抗体免疫小鼠制备单克隆抗体。将与Fab抗体基因序列同源的ScFv与完全弗式佐剂(购自GIBCO公司)混合，注射于BALB/C雌小鼠腹股沟皮下，两周后同部位再注射一次，于第一次注射后0天检测小鼠组中抗ScFv抗体的滴度。将免疫成功的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以1∶5比例在聚乙二醇条件下进行融合。以有限稀释液将杂交瘤细胞克隆，第二次克隆后阳性率应达100％，再行二次克隆后，分离到13株能分泌抗ScFv单抗的杂交瘤细胞。我们选用抗HBs ScFv的14F7单克隆抗体细胞株，注射BALB/C小鼠腹腔进行单克隆抗体扩增，收获的腹水经辛酸纯化法纯化，用于制备14F7亲和层析柱。
(2)14F7亲和层析柱的制备①将初步纯化的鼠抗HBs ScFv MAb 14F7置于偶联缓冲液中透析平衡。
②装置5mL HiTrapTMNHS activatited Sepharose HP柱，3×10ml冰冷1mmol/L HCl洗柱，流速0.5ml/min，洗脱柱上的异丙醇。
③注入5～10ml MAb 14F7溶液，25℃吸附30min。
④灭活缓冲液A、B交替洗柱，洗脱非特异性结合抗体并灭活未结合的活化基团。
⑤中和缓冲液至pH中性，4℃保存备用。
(3)14F7亲和层析柱纯化重组Fab抗体先用再生缓冲液洗柱，0.1mol/L PH8.0的磷酸缓冲液(30～40mL)平衡，再将脱盐样品直接从进样口上样，接着用0.1mol/L PH8.0、0.01mol/L PH8.0磷酸缓冲液分别洗去杂蛋白，最后用0.1mol/L甘氨酸-HCl洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱下来。收集样品洗脱液，将有目的蛋白的样品洗脱液分部收集并进行SDS-PAGE检测。薄层扫描分析显示，用14F7亲和层析柱纯化的重组Fab抗体的纯度可达98％左右。而且用该方法纯化的回收率有了大幅度的提高，可达70-85％。
3、离子交换层析柱纯化重组Fab抗体从理论上看，Fab抗体的等电点应在PI＝7.5-8.5之间，当抗体在缓冲液的PH为6.5时，Fab带正电荷，过阴离子柱时被穿流，过阳离子柱时被吸附，所以我们采用离子交换法来纯化Fab抗体。步骤如下①样品先过阴离子柱(DEAE-Sepharose)Buffer为0.01M PB，PH为6.5，收集穿流峰，即上样峰。因为Fab抗体此时带正电荷，被不吸附，而部分杂蛋白则被吸附上，从而达到初步纯化的目的。②将收集的阴离子柱的穿流峰过阳离子柱(CM-Sepharose)，缓冲液为0.01M PB，PH为6.5，用1M NaCL洗脱，收集目的峰。因为Fab抗体此时带正电荷，被吸附，而部分杂蛋白被穿流，从而达到进一步纯化的目的。薄层扫描分析显示，所纯化的Fab抗体的纯度达95％以上，可用于分子量的确证和活性检测。
五、人源性抗HBsAg Fab抗体的结构检测及活性分析
1、人源性抗HBsAg Fab抗体的PI测定(等电聚焦)人源性抗HBsAg FabPI的测定参照《蛋白质电泳实验技术》的方法进行，结果表明重组抗体的PI值为7.25-7.53。
2、人源性抗HBsAg Fab的ELISA测定(HBsAg结合能力)在包被好HBsAg的多孔板中分别加入抗HBsAg抗体Fab重组酵母(GS115/Fab)培养上清液，10倍系列稀释的纯化的Fab抗体进行ELISA检测，血源性抗HBsAg免疫球蛋白(8U/ml)为阳性对照，重组酵母培养上清的吸收值达到1.05-1.99，与阴性对照的比值高达21-39.8，显示出重组酵母培养上清具有很好的HBsAg结合活性。
3、人源性抗HBsAg Fab的ELISA测定(鼠抗ScFv单克隆抗体结合能力测定)将纯化的重组Fab抗体(7ug/ml和0.7ug/ml)及表达上清(10倍稀释和100倍稀释)分别包被多孔板，4℃过夜，0.5％牛血清白蛋白封闭，洗涤后，按1∶1000，1∶10000，1∶15000，1∶100000，1∶200000，1∶400000稀释抗ScFv单克隆抗体，加样，37℃温育1小时，洗涤，加羊抗鼠IgG-HRP(购自华美生物工程公司)(1∶1000)，37℃温育30min，加邻苯二胺显色，493nm波长比色测定吸收值。结果显示重组Fab抗体与抗ScFv单抗具有很强的结合能力。该单抗可以用来作为重组Fab抗体亲合纯化用抗体和用于产品检测。
4、人源性抗HBsAg Fab抗体的分子量测定对重组Fab抗体进行分子量测定，用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS，BRUKER公司，仪器型号Bruker Reflex III)测定Fab的平均分子量，该Fab抗体的平均分子量为49609道尔顿。
5、人源性抗HBsAg Fab抗体活体中和HBsAg测定用重组Fab抗体(0.35mg/ml)200ul静脉注射HBsAg转基因小鼠，每组六只，30min后眼眶取血200ul，分离的血清用于HBsAg的ELISA测定，结果显示，重组Fab抗体(0.35mg/ml)的HBsAg的中和率为30％-40％。
权利要求
1.人源性抗HBsAg Fab抗体片段基因，其特征在于包括下述序列结构人源性抗HBsAg Fab重链(Fd链)基因序列CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGACATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGCTGGGGGGGCAGCAGCTGGTACGGGGACGGCCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTAGC人源性抗HBsAg Fab轻链(k链)基因序列GACATTGTGTTGACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTTCAGGGGAAGGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAACGGCCAATTAACCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCACCAGTATGATGGCTCCCCGGAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAATCGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGATCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
2.一种用作人乙肝表面抗体的重组人源性抗HBsAg Fab抗体，具有如下的序列结构人源性抗HBsAg Fab抗体重链氨基酸序列FEQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAGGAAAGTGTAYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTS人源性抗HBsAg Fab抗体轻链氨基酸序列DIVLTQSPGTLSLSSGEGATLSCRASQSVSNGQLTWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYDGSPETFGQGTKVEINRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLRSPVTKSFNRGEC
3.一种用作人乙肝表面抗体的重组人源性抗HBsAg抗体，其等电点为7.0-7.6，分子量为50KD，重组人源性抗HBsAg Fab抗体对HBsAg具有较强的中和作用。
4.根据权利要求1、2或3所述的重组人源性抗HBsAg抗体，其中所述抗体具有轻度的糖基化，SDS-PAGE和Western Blotting分析中，在分子量28KD附近有两条特异蛋白带，非还原处理的SDS-PAGE结果显示，在45KD附近有一条特异的蛋白带。
5.权利要求1所述的人源性抗HBsAg Fab抗体片段基因的制取方法，包括如下步骤1)对乙肝疫苗志愿者加强免疫注射后取血，分离淋巴细胞，提取mRNA，反转录合成cDNA；2)用引物PCR扩增出抗HBsAg抗体的轻链基因和重链Fd的段基因，分别插入到载体pComb3H的相应位点构建含有抗体轻链和重链Fd段的载体质粒；3)用该质粒转化XL1-Blue，重组菌体在培养基中培养后加入噬菌体培养过夜，其上清即为噬菌体抗体库。
6.根据权利要求5所述的人源性抗HbsAg Fab抗体片段基因的制取方法，其中所述引物为重链(VH)5’引物VH1a CAGGTGCAGCTCGAGCAGTCTGGGVH1f CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGGGVH2f CAGGTGCAGCTACTCGAGTCGGGVH3aGAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGGVH4fCAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGGVH4gCAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGGVH6aVAGGTACAGCTCGAGCAGTCAGG重链3’引物CG1aGCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGGCG2aCTCGACACTAGTTTTGCGCTCAACTGTCTTCG3aTGTGTGACTAGTGTCACCAAGTGGGGTTTTCG4aGCATGAACTAGTTGGGGGACCATATTTGGAK链5’引物；V1a GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCAV2a GATATTGAGCTCACTCAGTCTCCAV3a GAAATTGAGCTGACGCAGTCTCCAK链3’引物GCGCCGTCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGATCTCAG
7.根据权利要求5所述的人源性抗HBsAg Fab抗体片段基因的制取方法，其中PCR的扩增包括取反应物为模板，10倍的PCR缓冲液，1.5ul的0.1mM dNTP，1.2ul的20uM不同组合的3’，5’端引物，0.5ul的Vent DNA聚合酶，12.75ul的双蒸水；反应30个循环，反应产物用1.2％琼脂糖电泳回收；其中噬菌体抗体的筛选为向预先包被HBsAg的微孔板内，每孔加入全套抗体库液50ul，37℃温育2小时，弃上清，用适量的0.5％Tween20的TBS清洗数遍；每孔加入50ul洗脱缓冲液，吸出孔内液体，室温放置10min，用适量的2mol/L Tris调PH至中性；用洗脱液感染2ml新鲜制备的XL1-blue，培养6-8小时，加辅助噬菌体VSM继续培养过夜，重新获得噬菌体，重复上述步骤，3轮筛选后收集感染的细菌，提取含Fab抗体基因双链噬菌体DNA。
8.权利要求2、3或4所述的人乙肝表面抗体的重组人源性抗HBsAg抗体的制取方法，包括如下步骤1)利用噬菌体展示技术，获得一株人源性抗HBsAg Fab片段的基因；2)在原核表达系统中表达人源性抗HBsAg Fab片段的基因；3利用PCR技术将Fab的轻重链基因扩增出来，构建到甲醇酵母表达载体中；4)两步法转化酵母，构建Fab工程菌，分泌表达生产Fab抗体片段。
9.根据权利要求8所述的方法，其中a)利用噬菌体展示技术，获得一株人源性抗HBsAg Fab片段的基因所采用的方法为1)对乙肝疫苗志愿者加强免疫注射后取血，分离单核细胞，提取mRNA，反转录合成cDNA；2)用引物PCR扩增出抗HBsAg抗体的轻链基因和重链Fd的段基因，分别插入到载体pComb3H的相应位点构建含有抗体轻链和重链Fd段的载体质粒；3)用该质粒转化XL1-Blue，重组菌体在培养基中培养后加入噬菌体培养过夜，其上清既为噬菌体抗体库；b)在原核表达系统中进行表达人源性抗HBsAg Fab片段的基因并利用PCR技术将Fab的轻重链基因扩增出来，构建到甲醇酵母表达载体中采用如下方法以阳性克隆为模板，在反应缓冲液中加入3’、5’端引物、聚合酶反应，反应产物用1.2％聚丙酰胺电泳回收，将H、L链的PCR产物回收酶切，分别插入到克隆载体pGEM-7Zf的相应酶切窗口上，构建H、L链基因的克隆载体，EcoR I和Xba I双酶切出重链基因片段，连接到载体pPICZα的强启动子PAOXI下游的相应酶切窗口上构建酵母表达载体pPICZα-A-H，BamH I和EcoR I双酶切出轻链基因片段，插入到载体质粒pPIC9K强启动子PAOXI下游的BamH I+EcoR I酶切窗口中，构建表达载体pPIC9K-L。c)两步法转化酵母，构建Fab工程菌，分泌表达生产Fab抗体片段工程菌的构建采用下述方法表达载体pPIC9K-L转化Pastoris pichia酵母GS115、G418抗性平板筛选重组酵母，得到表达Fab L链基因的重组酵母，分别挑取筛选出的多拷贝重组子单菌落，接种到BMGY培养基中，28℃培养至OD600约为5-6左右，离心收菌，重悬于BMMY培养基中进行甲醇诱导培养，培养上清液进行SDS-PAGE和Western Blotting分析；再以此表达量最高的重组酵母为宿主菌，将表达载体pPICZα-A-H转入，用Zeocin抗性板筛选得到Fab工程菌；分别挑取筛选出的多拷贝重组酵母GS115/Fab的单菌落，接种到BMGY培养基中，28℃培养至OD600约为5-6左右，离心收菌，重悬于BMMY培养基中进行甲醇诱导培养；其中的重组Fab抗体酵母工程菌的发酵工艺为从新鲜YPD，I％yeast extract，2％葡萄糖，2％琼脂粉]平板挑重组人源性抗HBsAg Fab抗体酵母工程菌GS115/Fab23或GS115/Fab51单菌落接种于100ml种子培养基中，30℃振荡培养20-24小时备用；按10％接种量接入2.5L发酵基础培养基中，5L发酵罐内，用氨水调PH至5-6；发酵开始搅拌转速为500rpm，30C恒温发酵。当溶氧加速上升时，开始流加补料生长培养基，流加速率维持溶氧大于20％；当光密度OD600为150-250左右时，停止补料，甘油耗尽后流加发酵诱导培养基。通过调节转速、罐压、通气量和甲醇流加速率使溶氧大于20％；发酵液的甲醇浓度控制在10g/L，诱导发酵100小时左右；经分析发酵上清总蛋白达到2.2g/L，目的蛋白约占总蛋白的19.3％。
10.根据权利要求8或9所述的方法，还包括对表达产物Fab抗体的纯化，所述纯化步骤包括诱导表达的培养上清液先用(NH4)2SO4沉淀，脱盐后用羊抗人Fab偶联的HiTrap抗体柱进行亲和纯化，用0.1mol/L的Tris.Cl平衡，流速1ml/min，1小时后上样，上样完后改用10倍柱体积0.1mol/L的Tris.Cl缓冲液洗涤，再用10倍柱体积的0.01mol/L的Tris.Cl的缓冲液进行洗涤，将杂蛋白全部洗出后改用0.1mol./L的Gly缓冲液进行洗脱，280nm检测洗脱蛋白峰，收集蛋白峰；SDS-PAGE电泳鉴定，纯化的Fab抗体的纯度达到90％以上；将亲和纯化的Fab抗体进一步做分子筛层析纯化；用0.01mol/L Tris.Cl缓冲液平衡，流速0.6ml/min，上样后用同样的缓冲液进行洗脱，280nm检测蛋白峰，收集目的蛋白峰；SDS-PAGE电泳鉴定，纯化的Fab抗体的纯度可达到95％以上；或者首先制备鼠抗HBs ScFv单克隆抗体用与该Fab抗体基因序列同源的ScFv抗体免疫小鼠制备单克隆抗体；将与Fab抗体基因序列同源的ScFv与完全弗式佐剂混合，注射于BALB/C雌小鼠腹股沟皮下，两周后同部位再注射一次，于第一次注射后0天检测小鼠组中抗ScFv抗体的滴度。将免疫成功的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以1∶5比例在聚乙二醇条件下进行融合；以有限稀释液将杂交瘤细胞克隆，第二次克隆后阳性率应达100％，再行二次克隆后，分离到13株能分泌抗ScFv单抗的杂交瘤细胞；选用抗HBs ScFv的14F7单克隆抗体细胞株，注射BALB/C小鼠腹腔进行单克隆抗体扩增，收获的腹水经辛酸纯化法纯化，用于制备14F7亲和层析柱；然后制备14F7亲和层析柱①将初步纯化的鼠抗HBs ScFv MAb 14F7置于偶联缓冲液中透析平衡；②装置5mL HiTrapTMNHS activatited Sepharose HP柱，3×10ml冰冷1mmol/L HCl洗柱，流速0.5ml/min，洗脱柱上的异丙醇；③注入5～10ml MAb 14F7溶液，25℃吸附30min；④灭活缓冲液A、B交替洗柱，洗脱非特异性结合抗体并灭活未结合的活化基团；⑤中和缓冲液至pH中性，4℃保存备用；14F7亲和层析柱纯化重组Fab抗体先用再生缓冲液洗柱，0.1mol/L PH8.0的磷酸缓冲液平衡，再将脱盐样品直接从进样口上样，接着用0.1mol/L PH8.0、0.01mol/L PH8.0磷酸缓冲液分别洗去杂蛋白，最后用0.1mol/L甘氨酸-HCl洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱下来；收集样品洗脱液，将有目的蛋白的样品洗脱液分部收集并进行SDS-PAGE检测；薄层扫描分析显示，用14F7亲和层析柱纯化的重组Fab抗体的纯度可达98％左右，纯化的回收率可达70-85％；或者采用离子交换层析柱纯化重组Fab抗体步骤如下①样品先过阴离子柱Buffer为0.01M PB，PH为6.5，收集穿流峰，即上样峰；②将收集的阴离子柱的穿流峰过阳离子柱，缓冲液为0.01M PB，PH为6.5，用1M NaCL洗脱，收集目的峰；薄层扫描分析显示，纯化的Fab抗体纯度达95％以上。
全文摘要
本发明提供一种用作人乙肝表面抗体的重组人源性抗乙肝表面抗原(HBsAg)Fab抗体及其制取方法。上述重组人源性抗HBsAg抗体的制备方法为利用噬菌体展示技术，获得一株人源性抗HBsAg Fab片段的基因，在原核表达系统中进行表达。在此基础上，利用PCR技术将Fab的轻重链基因扩增出来，构建到甲醇酵母表达载体中，两步法转化酵母，构建Fab工程菌，分泌表达生产Fab抗体片段。对该抗体结合活性进行的研究显示，该Fab抗体具有较强的HBsAg结合活性和抗原特异性。该基因的表达产物在临床的肝病治疗中具有较高应用价值。
文档编号C12P19/34GK1495193SQ0314596
公开日2004年5月12日 申请日期2003年7月18日 优先权日2002年7月19日
发明者余宙耀, 粟宽源, 任向荣, 高辉, 杨安钢 申请人:余宙耀, 粟宽源