一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法
【专利摘要】本发明提供一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法，主要对真姬菇栽培废料中残留的纤维素酶进行浸提条件的优化，通过硫酸铵沉淀、透析、SephadexG-100葡聚糖凝胶层析和DEAEC-52离子交换层析等方法对纤维素酶进行分离纯化，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，已达到电泳纯，分子量约为27.8KDa，酶比活达到1121.82U/mg，纯化倍数为12.13，最适作用温度和pH值分别为50℃和pH4.8，具有一定的耐酸碱特性，旨在为纤维素酶的应用提供更为科学的依据。此酶在造纸业和饲料业中具有较好的开发潜力和应用前景。
【专利说明】一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于真菌栽培废料生产【技术领域】，具体涉及一种从真姬菇栽培废料中提 取纤维素酶的方法。
【背景技术】
[0002] 真菌类的纤维素酶系，主要包括有外切β-1,4-葡聚糖酶、内切β-1,4-葡聚糖酶 β-葡聚糖苷酶，其中以CMC酶代表的内切β-1，4-葡萄糖酶最为常见。真姬菇栽培废料中 富含有纤维素酶等多种胞外酶，而真姬菇是目前工厂化生产主要品种之一，废菌袋来源稳 定，为工厂化提取纤维素酶提供了稳定原料来源，在市场上有着巨大的应用前景。
[0003] 纤维素酶是重要的水解纤维素类、半纤维素类物质的酶，在食品、造纸、饲料等许 多工业领域上有非常广泛地应用价值。我国的食用菌栽培废料数量巨大，长期以来因为没 有得到有效的利用，对环境和有机资源造成了恶劣的影响和巨大的浪费。据研究表明，食用 菌栽培废料中含有大量残余的胞外酶，这些残留的胞外酶在造纸业、饲料业等工业上有非 常广阔的利用价值和应用前景，利用食用菌采收后的废菌袋提取纤维素酶，在工艺上可节 省微生物培养工序，节省酶制剂厂的办厂投入，降低生产成本，拓宽食用菌产业链的延伸， 提高生产附加值，变废为宝。如何科学有效地开发利用这些资源，对于解决我国的能源短缺 和环境污染及食用菌可持续发展等问题都具有极为重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法，我国的食 用菌栽培废料数量巨大，长期以来因为没有得到有效的利用，对环境和有机资源造成了恶 劣的影响和巨大的浪费。对于解决我国的能源短缺和环境污染及食用菌可持续发展等问题 都具有极为重要的意义。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法，所述方法包括：通过硫酸铵沉淀、透 析、凝胶层析和离子交换层析对纤维素酶进行分离纯化，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，最终获得 纤维素酶。
[0006] 所述方法具体包括如下： (1) 粗酶液的制备：真姬菇栽培废料粉碎混匀，按1:3加入缓冲液，混匀，室温静置3h ; 纱布过滤,4°C下lOOOOr/min离心20min，取上清即为粗酶液； (2) 硫酸铵沉淀：取粗酶液10mL，20wt. %硫酸铵进行一次硫酸铵沉淀，80wt. %硫酸铵进 行二次硫酸铵沉淀，4°C盐析10_15h，4°C，10000r/min离心20min，分别收集上清和沉淀，沉 淀用缓冲液溶解至原体积，540nm波长处测定酶活； (3) 透析：粗酶液经硫酸铵沉淀后，IOml缓冲液至完全溶解，在同样的缓冲液，4°C，磁 力搅拌器上透析；每隔2h更换一次透析液，直至向透析液中加入0. lmol/L BaCl2溶液，检 测无白色沉淀产生为止；收集酶液，4°C，lOOOOr/min离心20min，取上清；冷冻干燥，少量缓 冲液将可溶蛋白溶解，4°C，lOOOOr/min离心20min，取上清； (4) 凝胶层析：缓冲液平衡Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析，流速为I. 5mL/min，直至 记录仪上的基准线值恒定，停止平衡；取2ml的透析纯化后酶液上柱，用缓冲液洗脱，收集 各洗脱峰，检测各管酶活，合并有酶活管，冷冻浓缩； (5) 离子交换层析：用Tris-HCl缓冲液平衡DEAE C-52,取2ml用Tris-HCl平衡缓冲 液溶解的经S印hadex G-100葡聚糖凝胶层析后的酶液上柱，采用含有NaCl浓度分别为0M、 0. IM和IM的平衡缓冲液进行盐离子梯度洗脱，收集各洗脱峰；检测各洗脱峰的酶活，收集， 冷冻干燥； (6) 酶纯度的鉴定：分离胶的浓度采用浓度为12%的聚丙烯酰胺，pH8. 8Tris-HCl缓冲 液，用考马斯亮蓝R-250进行染色。
[0007] 步骤（1)- (4)中的缓冲液为0· 02M ρΗ4· 8乙酸-乙酸钠缓冲液；步骤（5)所述的 Tris-HCl缓冲液为0. 02Μ pH7. 0 Tris-HCl平衡缓冲液。
[0008] 本发明的优点在于： (1)真姬菇栽培废料中纤维素酶的最佳条件为：ρΗ4. 8,0. 02 M ρΗ4. 8乙酸-乙酸钠缓 冲液，浸提温度25°C、浸提时间为3h、料液比为lg/3mL。真姬菇栽培废料中纤维素酶浸提液 最终酶活达到107. 36U，酶活有了显著的提高，达到了优化的效果。
[0009] (2)真姬菇栽培废料酶液经硫酸铵盐析、透析除盐、冷冻干燥、S印hadex G-100葡 聚糖凝胶层析、透析除盐、冷冻干燥、DEAE C-52离子交换层析等分离纯化后，SDS-PAGE鉴 定已达到电泳纯。纯化后的纤维素酶比活达到1121. 82U/mg，纯化倍数为12. 13,回收率为 2. 64%。
[0010] (3)分离纯化获得的纤维素酶蛋白分子大小约为27. 8kDa。该酶的最适作用温度 为501：，在20?501：内酶活较稳定。该酶最适作用？!1值为？!14.8，？!1值在3.0?10.0的范围 内相对稳定，具有较广的酸碱稳定性。
[0011] (4)不同金属离子对纤维素酶的影响中，Na+、K+对此纤维素酶有轻微的促进作用； Mg2+、Mn2+有激活作用；Fe2+、Ca2+在低浓度下有促进作用，随着浓度的提高，对纤维素酶的抑 制作用增强；Zn 2+、Cu2+、Fe3+具有强烈抑制作用。
[0012] (5)以CMC-Na作为底物进行此纤维素酶的动力学的研究表明，此底物的酶促反 应，符合米氏方程。Vmax 为 24. 45 yg/mL/min，Km 为 9. 77 mg/mL，Vmax/Km 为 2. 50。说明 此底物具有较高的亲和力。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1纤维素酶的Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析层析色谱图。其中NaCl concertration为氯化钠梯度。
[0014] 图2纤维素酶的DEAE C-52阴离子交换层析色谱图。其中NaCl concertration 为氯化钠梯度。
[0015] 图3纤维素酶的DEAE C-52阴离子交换层析色谱图。其中NaCl concertration 为氯化钠梯度。
[0016] 图 4 SDS-PAGE 电泳图谱。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1 1纤维素酶的浸提优化 1. 1单因素优化 (1)浸提液PH值的优化 纤维素酶浸提液PH值的优化，选择pH值在4. (Γ10. 0范围，每0. 4设一个梯度，共设 16个梯度。每组中加入相同质量的碾碎后搅拌均匀的栽培废料，分别加入不同pH值浸提 液，搅拌并于常温下静置，每个梯度作3个平行。纱布过滤，4°C，10000r/min离心20min，取 上清。测定各组浸提液的纤维素酶活，结果表明，从PH4. 0开始，纤维素酶活逐渐上升，在 pH4. 8时，纤维素酶活达到最高值，约84. 06U。之后，纤维素酶活大小随pH值的增大而逐渐 减小。说明纤维素酶在PH4. 8时具有最高的酶活，因此采用pH4. 8作为真姬菇栽培废料中 纤维素酶的最佳浸提PH值。
[0018] (2)浸提缓冲液的优化 浸提缓冲液选用四组溶液：去离子水、0.02 M pH4. 8乙酸-乙酸钠缓冲液、0.02 M PH4. 8柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、0.02 M pH4. 8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。用适当的料 液比浸泡，混匀并常温下静置。纱布过滤，4°C，lOOOOr/min离心20min，取上清，测定各浸提 液的纤维素酶活大小，结果表明，浸提缓冲液选用去离子水时，酶活最小，选用乙酸-乙酸 钠缓冲液酶活最大，说明纤维素酶在乙酸-乙酸钠缓冲液中具有最高的酶活，因此采用乙 酸-乙酸钠缓冲液作为真姬菇栽培废料中纤维素酶的最佳浸提缓冲液。
[0019] 1.2正交试验优化 纤维素酶浸提条件优化的L16 (44)正交试验结果。经Minitab 16.0软件分析，结果表 明：以测定的纤维素酶活为指标，浸提温度的极差最大，表明浸提温度对酶活力大小影响最 大。各因素对纤维素酶活的影响程度依次为A (浸提温度）>C (料液比）>B (浸提时间），且 A (浸提温度）因素对纤维素酶活的影响达到了极显著差异（p〈0. 01)(表2-2)。由此分析， 此优化反应的最佳组合为A3B2C2,即浸提温度25°C、浸提时间为3h、料液比为lg/3mL。
[0020] 按照选取的纤维素酶浸提条件优化工艺条件（A3B2C2)制备3批样品，实验结果表 明：浸提液纤维素酶活达到107. 36U，明显优于正交试验的其他组，可以验证正交试验的结 果，酶活有了显著的提高，达到预期的效果。
[0021] 2硫酸铵沉淀 分别取粗酶液10mL，加入硫酸铵饱和度为20%、25%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%进行盐析，540nm波长处分别测定上清和沉淀的酶活。结果可以看出，硫酸铵 浓度在20%时，上清酶活最大，硫酸铵的浓度从25%起，上清酶活逐渐减小，至硫酸铵浓度为 75%时，上清酶活最小。硫酸铵浓度在20%时，沉淀酶活几乎为0,硫酸铵的浓度从25%开始， 沉淀酶活逐渐增高，至硫酸铵浓度为75%时，沉淀酶活最大。因此采用20%硫酸铵进行一次 硫酸铵沉淀，75%硫酸铵浓度进行二次硫酸铵沉淀。
[0022] 3 Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析 用0.02M pH4.8乙酸-乙酸钠缓冲液平衡S印hadex G-100葡聚糖凝胶层析，流速为 I. 5mL/min，直至记录仪上的基准线值恒定，停止平衡。取适量的透析纯化后酶液上柱，用 0. 02M pH4. 8乙酸-乙酸钠缓冲液洗脱，收集各洗脱峰，结果如图1。将硫酸铵盐析液经 S印hadex G-IOO葡聚糖凝胶层析(见图1)，主要有三个洗脱峰，检测各管酶活，发现第三个 洗脱峰含有较高纤维素酶活，将这些管收集冷冻干燥后用于下一步分离纯化。
[0023] 4 DEAE C-52离子交换层析 4. I DEAE C-52阴离子交换层析缓冲液pH的确定 取8支小试管，分别装入DEAE C-52 200mg，进行不同的pH值下（3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、 7. 0、8. 0、9. 0、10. 0)DEAE C-52阴离子交换层析对纤维素酶的最佳吸附量实验。每组做三个 平行。结果显示，pH值在3. (Γ4. 0时，酶活很小，酶活随着pH值增大而逐渐增大，至pH7. 0 后酶活开始逐渐下降。因此，确定PH7.0 Tris-HCl为DEAE C-52阴离子交换最适层析缓冲 液。
[0024] 4. 2 DEAE C-52阴离子交换层析洗脱盐浓度的确定 用 0.02M pH7.0 Tris-HCl 缓冲液平衡 DEAE C-52,取适量的用 0.02M pH7.0 Tris-HCl 平衡缓冲液溶解的经S印hadex G-100葡聚糖凝胶层析后的酶液上柱，采用含有NaCl浓度 分别为0M、0. IM和IM的平衡缓冲液进行盐离子梯度洗脱，收集各洗脱峰。检测各洗脱峰的 酶活，寻找纤维素酶蛋白洗脱的最佳盐浓度，结果如图2。结果表明，用不同NaCl浓度的缓 冲液进行梯度洗脱，不同的蛋白质组分在不同的阶段被洗脱出来。但是含有纤维素酶活力 的蛋白主要集中在第三个峰顶端，即约在NaCl浓度为0. 6mol/L洗脱时的色谱峰。
[0025] 2. 3. 4. 3 DEAE C-52阴离子交换层析结果 取与2. 3. 4. 2中同样体积的上样液，采用含有NaCl浓度分别为0M、0. 2M和0. 6M的平 衡缓冲液进行盐离子梯度洗脱，对目标蛋白所在的峰（〇. 6mol/LNaCl洗脱的蛋白峰)进行分 管收集，结果如图3。检测各管酶活，发现第三个洗脱峰含有较高的纤维素酶活，将这些管合 并为一管，进行冷冻干燥。
[0026] 5纤维素酶纯度的鉴定 将分离纯化后的酶液进行SDS-PAGE电泳，结果见图4。电泳条带从右往左分别为：M : Marker ; I :硫酸铵透析液；II :Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析浓缩酶液；III :DEAE C-52 离子交换层析浓缩酶液。由SDS-PAGE电泳图谱，可以看到蛋白电泳是单一条带，说明纯化 后酶液已达到考马斯亮蓝电泳纯。
[0027] 6分离纯化结果汇总 粗酶液经离心、收集上清、硫酸铵沉淀透析、Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析、DEAE C-52离子交换层析，各步骤分离纯化结果如表1。
[0028] 灰I纤维素_的分离纯化汇总
【权利要求】
1. 一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法，其特征在于：所述方法包括：通过 硫酸铵沉淀、透析、凝胶层析和离子交换层析对纤维素酶进行分离纯化，SDS-PAGE鉴定蛋白 纯度，最终获得纤维素酶。
2. 根据从权利要求1所述的一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法，其特征在 于：所述方法具体包括如下： (1) 粗酶液的制备：真姬菇栽培废料粉碎混匀，按1:3加入缓冲液，混匀，室温静置3h ; 纱布过滤,4°C下10000r/min离心20min，取上清即为粗酶液； (2) 硫酸铵沉淀：取粗酶液10mL，20wt. %硫酸铵进行一次硫酸铵沉淀，80wt. %硫酸铵进 行二次硫酸铵沉淀，4°C盐析10_15h，4°C，10000r/min离心20min，分别收集上清和沉淀，沉 淀用缓冲液溶解至原体积，540nm波长处测定酶活； (3) 透析：粗酶液经硫酸铵沉淀后，10ml缓冲液至完全溶解，在同样的缓冲液，4°C，磁 力搅拌器上透析；每隔2h更换一次透析液，直至向透析液中加入0. lmol/L BaCl2溶液，检 测无白色沉淀产生为止；收集酶液，4°C，10000r/min离心20min，取上清；冷冻干燥，少量缓 冲液将可溶蛋白溶解，4°C，10000r/min离心20min，取上清； (4) 凝胶层析：缓冲液平衡Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析，流速为1. 5mL/min，直至 记录仪上的基准线值恒定，停止平衡；取2ml的透析纯化后酶液上柱，用缓冲液洗脱，收集 各洗脱峰，检测各管酶活，合并有酶活管，冷冻浓缩； (5) 离子交换层析：用Tris-HCl缓冲液平衡DEAE C-52,取2ml用Tris-HCl平衡缓冲 液溶解的经S印hadex G-100葡聚糖凝胶层析后的酶液上柱，采用含有NaCl浓度分别为0M、 0. 1M和1M的平衡缓冲液进行盐离子梯度洗脱，收集各洗脱峰；检测各洗脱峰的酶活，收集， 冷冻干燥； (6) 酶纯度的鉴定：分离胶的浓度采用浓度为12%的聚丙烯酰胺，pH8. 8Tris-HCl缓冲 液，用考马斯亮蓝R-250进行染色。
3. 根据从权利要求1所述的一种从真姬菇栽培废料中提取纤维素酶的方法，其特征 在于：步骤（1)- (4)中的缓冲液为0.02M pH4. 8乙酸-乙酸钠缓冲液；步骤（5)所述的 Tris-HCl缓冲液为0. 02M pH7. 0 Tris-HCl平衡缓冲液。
【文档编号】C12N9/42GK104278018SQ201410524498
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】胡开辉, 杨云龙, 黄彩梅, 万春和 申请人:福建农林大学