化妆品用蚯蚓活性蛋白的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别设及一种化妆品用祇蝴活性蛋白的提取方法。
【背景技术】
[0002] 随着药妆品工业的持续发展，研究和开发策略将更多地转向医药类型的产品， 利用先进医学技术的药妆品已经得到了快速发展，而且该一趋势还将会更加强劲。目前， 美容手术包括微晶磨皮术和化学磨皮术、肉毒素护理和激光更新皮肤等，该些方法都能消 除不平滑的皮肤表面、老年斑和细小的皱纹，然而，大部分消费者更加青睐于使用化妆水 和枯皱精华等化妆品来美化肌肤。
[0003] 本研究所使用的祇蝴品种为赤子爱胜蝴，本品种在分类学上属于正蝴科爱胜属。 赤子爱胜蝴繁殖率高、适应性强，很适合人工养殖，是目前世界上养殖最为普遍的一个品 种，其体内的药用成分也十分丰富，所W临床上的制剂多W赤子爱胜蝴为原料。随着生物技 术的发展，赤子爱胜蝴的药用价值越来越多的被人们研究和关注。
[0004] 祇蝴的药用价值与其体内的活性物质关系密切；实验室前期的研究中发现祇蝴活 性蛋白提取物在动物水平上能够促进烫伤创面的愈合，在细胞水平上能够促进成纤维细胞 的增殖和迁移；但是，还未见从祇蝴中提取抗皱成分的资料，现有技术中祇蝴提取物提取工 艺还不是很完善，提取物中往往包含小分子成分的混合物、纯度低；本发明的研究的主要任 务是科学提取出赤子爱胜蝴中促进成纤维细胞增殖的活性蛋白，并W其为原料研制出具有 抗皱活性的优质化妆品。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种化妆品用祇蝴活性蛋白的提取方法，通过该方法提取 的虫丘蝴活性蛋白不含小分子杂质，纯度高，使用效果好。
[0006] 本发明的化妆品用祇蝴活性蛋白的提取方法，包括W下步骤： a、 取清洗干净的鲜祇蝴，加入20mmol/L、抑为6. 8~7. 2的磯酸盐缓冲液，冰浴条件下高 速匀浆，得到祇蝴匀浆液，并在4°C下静置2~化，使蛋白充分溶出； b、 将祇蝴匀浆液分装于离屯、管中，在4°C下，高速离屯、20~30min，取上清液；在室温条 件下，加研细的硫酸锭进行盐析，达到50%饱和度，使杂蛋白沉淀析出，得盐析液； C、将盐析液分装于离屯、管中，在4°C下，高速离屯、20~30min，取上清液过0. 45化的膜， 取滤液； d、盐析所述滤液采用0. 2化的中空纤维膜组件超滤的方式除去大分子物质，然后用截 留分子量为20k-50k中空纤维膜组件超滤的方式脱盐，最后冷冻干燥即得所述化妆品用虫丘 蝴活性蛋白。
[0007] 本发明的有益效果是；本方法W新鲜的赤子爱胜蝴为原料，采用匀浆、离屯、、盐析、 微滤、超滤、冷冻干燥等技术对其中的活性蛋白进行分离纯化、采用NIH3T3成纤维细胞进 行活性跟踪，获得了具有较高增殖活性的祇蝴活性蛋白；在此基础上，采用正交设计实验考 察溶剂、料液比、温度、提取时间四因素对活性蛋白提取的影响，通过不同盐析浓度的研究 考察盐析对祇蝴活性蛋白提取的影响，通过考察不同截留分子量中空纤维膜脱盐的效果， 获得的祇蝴活性蛋白不含小分子杂质，纯度高，使用效果好；为从祇蝴中提取具有促成纤维 细胞增殖活性的蛋白提供了实验依据；将本发明方法制备的祇蝴活性蛋白应用于化妆品， 具有使皮肤柔滑、补水保湿及延缓衰老的作用，可作为护肤品，直接用于皮肤。
【具体实施方式】
[0008] 下面将对本发明实施例中的方案进行清楚、完整的描述，基于本发明的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发 明保护的范围。
[000引实施例1; 取清洗干净的鲜祇蝴500g，加入1000ml20mmol/L、抑7. 2的磯酸盐缓冲液，用高速匀 浆机W220(K)巧m，冰浴条件下匀浆5min;将祇蝴匀浆液4°C静置化，使蛋白充分溶出。
[0010] 将匀浆液分装于离屯、管中，在4°C下，W15000巧m高速离屯、25min，取上清液。在 室温条件下，加研细的硫酸锭进行盐析，达到50%饱和度，使杂蛋白沉淀析出，此过程中要 不断揽拌；硫酸锭须在30min内加完，加完后继续揽拌30min使硫酸锭充分溶解，4°C静置 Ih，使杂蛋白充分沉淀。
[0011] 将盐析液分装于离屯、管中，在4°C下，W16500巧m离屯、28min，取上清液过0. 45化 的膜，取滤液。
[0012] 盐析上清液采用0. 2化的中空纤维膜组件超滤的方式除去大分子物质，然后用截 留分子量为20k-50k中空纤维膜组件超滤的方式脱盐，最后冷冻干燥即得本发明的化妆品 用虫丘蝴活性蛋白。
[001引实施例2; 取清洗干净的鲜祇蝴500g，加入800ml20mmol/L、p册.8的磯酸盐缓冲液，用高速匀浆 机W180(K)巧m，冰浴条件下匀浆5min。将祇蝴匀浆液4°C静置2.化，使蛋白充分溶出。
[0014] 将匀浆液分装于离屯、管中，在4°C下，W15000巧m高速离屯、25min，取上清液。在 室温条件下，加研细的硫酸锭进行盐析，达到50%饱和度，使杂蛋白沉淀析出，此过程中要 不断揽拌。硫酸锭须在30min内加完，加完后继续揽拌30min使硫酸锭充分溶解，4°C静置 Ih，使杂蛋白充分沉淀。
[0015] 将盐析液分装于离屯、管中，在4°C下，W12000巧m离屯、30min，取上清液过0. 45化 的膜，取滤液。
[0016] 盐析上清液采用0. 2化的中空纤维膜组件超滤的方式除去大分子物质，然后用截 留分子量为20k-50k中空纤维膜组件超滤的方式脱盐，最后冷冻干燥即得本发明的化妆品 用虫丘蝴活性蛋白。
[0017] 实施例3; 采用祇蝴活性蛋白制备化妆水及其理化性质的检测： (1)化妆水的配方：甘油Ig;1%透明质酸lOg;芦芭胶Ig;海藻糖2g;水溶性维生素E0. 2g;杰马0. 4g;虫丘蝴活性蛋白5g;人参提取液5g;香精0.Olg;纯净水补足到lOOg。
[0018] (2)化妆水的制备方法为：按照W上配方精确称量甘油，1%透明质酸溶液，海藻 糖，水溶性维生素E及杰马置烧杯中，玻璃椿揽匀后，加入5g人参提取液及5g祇蝴活性蛋 白提取液；继续揽拌至均匀后加双蒸水至lOOg，全部溶解后加入1滴香精对化妆品的香型 进行调节。
[0019] (3)检测结果如表1所示；化妆水的抑为6. 8,在非阳光直射条件下观察化妆水 的色泽，呈均匀透明的浅黄色，无杂质；将化妆水擦于皮肤上，在室内及非阳光直射条件下 观察，结构细腻，亲和性较好；嗅觉辨别化妆水的香型，味道符合规定香型。在耐热实验中， 40°C保持2化后，恢复室温后与试验前无明显的性状差异。在耐寒实验中，4°C保持2化后， 恢复室温后与试验前无明显性状差异。
【主权项】
1.化妆品用蚯蚓活性蛋白的提取方法，其特征是包括如下步骤： a、 取清洗干净的鲜蚯蚓，加入20mmol/L、pH为6. 8~7. 2的磷酸盐缓冲液，冰浴条件下高 速匀浆，得到蚯蚓匀浆液，并在4°C下静置2~3h，使蛋白充分溶出； b、 将蚯蚓匀浆液分装于离心管中，在4°C下，高速离心20~30min，取上清液；在室温条 件下，加研细的硫酸按进行盐析，达到50%饱和度，使杂蛋白沉淀析出，得盐析液； c、 将盐析液分装于离心管中，在4°C下，高速离心20~30min，取上清液过0. 45Mm的膜， 取滤液； d、 盐析所述滤液采用0. 2Mm的中空纤维膜组件超滤的方式除去大分子物质，然后用截 留分子量为20k-50k中空纤维膜组件超滤的方式脱盐，最后冷冻干燥即得所述化妆品用蚯 蚓活性蛋白。
【专利摘要】本发明公开了一种化妆品用蚯蚓活性蛋白的提取方法，包括以下步骤：取清洗干净的鲜蚯蚓，加入磷酸盐缓冲液，冰浴条件下高速匀浆，得到蚯蚓匀浆液；并分装于离心管中，高速离心，取上清液；加研细的硫酸铵进行盐析，使杂蛋白沉淀析出；将盐析液分装于离心管中，取上清液过0.45μm的膜，取滤液；采用超滤的方式除去大分子物质，然后用截留分子量为20k-50k中空纤维膜组件超滤的方式脱盐，最后冷冻干燥即得蚯蚓活性蛋白；本方法以新鲜的赤子爱胜蚓为原料，采用匀浆、离心、盐析、微滤、超滤、冷冻干燥等技术对其中的活性蛋白进行分离纯化获得了具有较高增殖活性的蚯蚓活性蛋白，不含小分子杂质，纯度高，使用效果好。
【IPC分类】C07K1-36, C07K1-34, A61K8-64, A61Q19-00, C07K1-30, A61Q19-08
【公开号】CN104725466
【申请号】CN201510088980
【发明人】李振, 张勇, 单辉, 周海洋, 卞宪名, 叶素艳
【申请人】济宁华能制药厂有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年2月27日