与辣椒抗黄瓜花叶病毒紧密连锁的分子标记及其应用
【专利摘要】本发明涉及分子标记领域，具体涉及与辣椒抗黄瓜花叶病毒紧密连锁的分子标记。所述分子标记位于辣椒12号染色体上，该位点与侧翼SNP标记UN54228_1146的遗传距离为1cM。通过该分子标记可对辣椒抗CMV抗性进行鉴定，提高了育种效率。相比之前发现的其它分子标记，本发明的SNP标记UN54228_1146与抗性位点的遗传距离为1cM，在辣椒抗CMV育种中有重要意义。
【专利说明】
与辣椒抗黄瓜花叶病毒紧密连锁的分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及分子标记领域，具体涉及与辣椒抗黄瓜花叶病毒紧密连锁的分子标 记。
【背景技术】
[0002] 辣椒在世界范围内广泛种植，是我国第二大蔬菜作物。然而，随着辣椒种植面积的 不断增长，病害对辣椒生产的危害也愈发严重，其中黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV)成为为害我国辣椒成产的主要病毒病之一。辣椒受CMV为害后严重影响品质和 产量，因而培育辣椒抗CMV品种成为辣椒抗性育种的目标之一。然而目前与辣椒抗CMV连锁 标记的报道较少，目前还没有可用于辣椒抗黄瓜花叶病毒辅助育种的分子标记。因而探究 与辣椒抗CMV相关的分子标记有重要意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种与辣椒抗黄瓜花叶病毒紧密连锁的分子标记。
[0004] 根据本发明用于辅助抗黄瓜花叶病毒分子标记可通过以下步骤获得：
[0005] 本发明以辣椒抗病品种Perennial和感病品种83-58及其构建的RIL群体118个株 系为试验材料，以基于转录组开发的SNP标记，采用KASPar基因分型技术构建遗传图谱，再 结合表型数据进行QTL定位，结果在12号染色体上定位到一个与辣椒抗CMV相关的QTL位点， 该位点与侧翼SNP标记UN54228_1146的遗传距离为lcM，可以有效地用来辅助育种工作。
[0006] 本发明的用于辣椒抗CMV特异性筛选的KASPar引物，其信息如下所示。
[0007]
[0008]本发明的优点是不通过抗病性鉴定，只是在苗期对辣椒植株的DNA检测，就可以判 断辣椒对于CMV的抗性，可以广泛应用到分子标记辅助育种。并且该标记可用KASPar基因分 型技术进行大批量检测，可以提高效率，缩短鉴定时间。
[0009]本发明提供的分子标记实现了在苗期对辣椒植株抗CMV的鉴定，大大缩短了育种 时间，节约了人力物力。通过利用本发明提供的特异性引物采用KASPar基因分型技术，加以 抗性感亲本Perennial、83-58作对照，与抗性亲本Perennial同基因型的及杂合基因型的具 有抗性，与感病亲本83-58具有相同基因型的不具有抗性。通过该分子标记可对辣椒抗CMV 抗性进行鉴定，提高了育种效率。相比之前发现的其它分子标记，本发明的SNP标记 UN54228_1146与抗性位点的遗传距离为lcM，在辣椒抗CMV育种中有重要意义。
【具体实施方式】
[0010] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0011] 本发明以辣椒抗病品种Perennial和感病品种83-58两者的Fi及其所构建的RIL (F8)群体的118个株系为试验材料，以三生烟为病毒扩繁材料。
[0012] 1、RIL群体抗性鉴定
[0013]双亲、F1、RIL群体的118个株系，每个种植三个重复，每个重复种植10棵。于辣椒种 植前一个月种植三生烟，用于CMV病原的扩繁。
[0014]将烟草鲜病叶称重保存备用，待烟草幼苗长至5-6片叶时，按照鲜病叶与3mM pH = 8的PBS缓冲液质量体积比1: 5，在冰浴中研磨成匀浆，3000rpm离心，上清液即为接种液，置 于冰中备用。在长至5、6片叶的烟草幼苗叶片上撒少许600目金刚砂，采用摩擦接种法，手指 蘸取少量接种液，轻轻摩擦叶面，30min后用水冲去叶面多余汁液;3天后再接种一次。接种 后材料的生长温度控制在28°C左右。采集接种后10d的有明显病症的烟草叶片作为辣椒接 种病原，此时黄瓜花叶病毒的致病能力最强。将采集的烟草病原叶转接到长至三、四片叶的 辣椒植株，接种方法同上，接种辣椒幼苗的第1、2片真叶，用连续加样器每片叶片接种20yL 接种液，即每株接种40yL接种液。接种后材料的生长温度控制在28 °C左右。接种25d后参照 国家"八五"辣椒抗病育种攻关组分级标准(表1)进行抗性鉴定，三个重复的均值作为该材 料对CMV抗性水平的反应。
[0015]病情指数(DI)计算公式:病情指数(?Ι) = [Σ(各级发病株数X病级数)/(9X调查 株数)]X100。
[0016] 抗病性划分标准:免疫（I):DI = 0;高抗(HR):0〈DI彡5;抗病(R): 5〈DI彡15;中抗 (MR) :15〈DI彡30;感病（S) :30〈DI彡40;高感(HS) :DI>40。
[0017] 表1国家"八五"辣椒抗病育种攻关组分级标准
[0018]
[0019] 2、遗传连锁图谱的构建
[0020] 2.1KASPar 标记
[0021]本发明所采用的每对KASPar分子标记含有3条引物序列:六1^2、(：。其中41^2仅仅 是末端的SNP位点存在差异，在A1、A2的5 '端分别加有共同的接头序列：5 ' GAAGGTGACCAAGTTCATGCT3'、5'GAAGGTCGGAGTCAACGGATT3'。此两段序列与Master Mix里带 有荧光的序列互补，配对后会激发荧光，C为反向互补序列。
[0022]引物预混
[0023] 表2 KASPar引物预混
[0024]
[0025] 荧光值的读取在Roche 480Π 荧光定量仪，按照37°Clmin，Read fluorescence Is 进行，再按照Endpt Geno分析读取焚光值。对RIL群体多态性进行统计，与亲本Perennial相 同的Allele X型记为"a"，与亲本83-58相同的Allele Y型记为带型"b"，杂合位点（Both Alleles)记为"h"，未能识别的记为。利用Joinmap4.0软件进行遗传连锁图谱的构建，对 RIL群体基因分型的原始数据进行规范化处理，并转化为软件要求的具体格式;再将所得到 的数据导入软件进行计算分析并构建连锁图谱。参数设置为L0D多3,步长为0.5。用Kosambi 函数进行遗传距离的计算，结果用厘摩尔根(cM)表示。
[0026] 3、抗黄瓜花叶病毒SPN标记的获得
[0027]基于已构建的连锁图谱，结合表型鉴定数据，利用MapQTL 4.0软件进行QTL定位。 采用区间作图方法（IM，Interval Mapping)，结合Permutation Test检验确定QTL位点存在 时对应的L0D值，并将连锁群上L0D值最高的点看作一个QTL位点，并分析QTL的加性效应及 表型变异的贡献率。结果在12号染色体上定位到三个位点(表3)。
[0028]表3辣椒抗黄瓜花叶病毒QTL的基本信息
[0029]
[0030] 其中标记UN54228_1146与主效QTL位点CMV12.3紧密连锁。可用于辣椒抗CMV分子 标记辅助育种。
【主权项】
1. 与辣椒抗黄瓜花叶病毒紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记位于辣椒 12号染色体上，该位点与侧翼SNP标记UN54228_1146的遗传距离为lcM。2. 用于辣椒抗CMV特异性筛选的KASPar引物，其特征在于，所述引物的序列为： 前引物Al: TGGATTGGCAAACAACACGAATGACC; 前引物A2: GCATCTTGAATGGAGATTTTCTTGACACGATG; 后引物C: GCATCTTGAATGGAGATTTTCTTGACACGATT。3. -种鉴定辣椒抗CMV性的方法，其特征在于所述方法包括使用以下引物进行扩增的 步骤： 所述引物的序列为： 前引物Al: TGGATTGGCAAACAACACGAATGACC; 前引物A2: GCATCTTGAATGGAGATTTTCTTGACACGATG; 后引物C: GCATCTTGAATGGAGATTTTCTTGACACGATT。4. 权利要求1所述与辣椒抗黄瓜花叶病毒紧密连锁的分子标记的应用。
【文档编号】C12N15/11GK105907755SQ201610405984
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月10日
【发明人】张宝玺, 王立浩, 张正海, 曹亚从, 王兴兴
【申请人】中国农业科学院蔬菜花卉研究所