因型GG、TT和GT对应失水率
[0043] 图5突变位点基因型GG和TT的UBXNl基因mRNA表达水平
【具体实施方式】
[0044] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段。
[0045] 实施例1
[0046] 1?实验材料
[0047] I. 1实验动物
[0048] 本研究采用119头杜长大商品猪，实验动物来自于南通嘉仑食品厂，在同一条件 下饲养，采集背最长肌分别用于DNA提取，RNA提取以及失水率的测定。
[0049] 1. 2DNA提取，RNA提取，PCR及电泳试剂
[0050]DNA提取试剂：Tris-饱和酸、氯仿、蛋白酶K、异戊醇、无水乙醇
[0051]RNA提取试剂：Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇
[0052] PCR及电泳试剂：2 X Taq PCR Mix、DNA Marker、2 X LA Taq PCR Mix
[0053] IOxTBE :Tris108g，EDTA? 2H20 7. 44g，硼酸 55g，溶于去离子水并定容至 1000mL。
[0054]I. 3仪器设备
[0055] 实时荧光定量PCR仪：美国应用生物系统公司
[0056]低温高速离心机：Eppendorf，德国
[0057] 超低温冰箱、NanoDrop分光光度计：Thermo,美国
[0058]可调式微量移液器：Eppendorf，德国
[0059] GEL EQ凝胶成像系统：BI〇-RAD，美国
[0060] 电子天平：Yamatoz，美国
[0061] 高压消毒锅：上海申安医疗器械厂
[0062] 恒温水浴锅：北京医疗设备厂
[0063] 手术镊子、手术剪、手术刀、医用纱布、游标卡尺、圆形取样器、新华定性滤纸、自封 袋、标签纸：南京农业大学后勤处
[0064] 土壤允许膨胀压缩仪：南京土壤仪器厂有限公司
[0065] 核苷酸序列测序由苏州金唯智生物科技有限公司进行
[0066] 2?实验方法
[0067]2. 1失水率测定
[0068] (1)取样部位：与屠宰后取背最长肌1.0 cm左右厚肉样；
[0069] (2)测量前处理：用直径2. 532cm圆形取样器切取面积为5cm2左右，厚约I.Ocm的 圆形肉样称重后，先用医用纱布包裹一层；
[0070] (3) 土壤允许膨胀仪归零：先将土壤允许膨胀仪加压至最大值，再减压至千分表 回0,重复3次；
[0071] (4)加压处理：将肉样上下各垫18层新华定性滤纸，置于土壤允许膨胀压缩仪内， 用35kg压力保持5min。撤除压力后立即将肉样取出再次称重，并做好记录。
[0072] ⑶计算公式：
[0073] 失水率=[(肉样压前重-肉样压后重）/肉样压前重]X100%
[0074]2. 2肌肉DNA的提取
[0075](1)剪下IOOmg左右样品，切碎，放到2. OmL EP管内；
[0076] (2)往EP管中分别加裂解液ImL和蛋白酶K50yL充分混匀，水浴锅内55°C水 浴消化12h至过夜，次日向2.OmL管中加Tris饱和酚900yL，摇匀器上混匀15min，4°C， 12000rpm离心 15min;
[0077] (3)吸取1000yL上层液体放入2mLEP管内，加氯仿/异戊醇（24 :I) 500yL和 500yL饱和酸，摇勾器上混勾15min，4°C、12000rpm离心15min;
[0078] (4)吸取850yL上层液体放入2mLEP管中，加氯仿/异戊醇（24 : 1)850yL，摇 勾器上混勾15111；[11，4°0，12000印1]1离心15111；[11;
[0079] (4)吸取700yL上层液体放入2mLEP管中，加氯仿700yL，摇匀器上混匀15min， 4°C，12000rpm离心 15min;
[0080](5)吸取500yL上层液体放入I. 5mLEP管中，加2倍体积无水乙醇，轻轻摇晃后， 4。(：，1000 Orpm离心IOmin;
[0081] (6)弃去上层液体，加ImL70%无水乙醇，轻轻摇晃，4°C，1000 Orpm离心5min;
[0082] (7)倒掉上层液体，除去管内剩余液体，超净台吹干至EP管内无水滴，干燥时间约 25min；
[0083] (8)样品加50yL55°C去离子水，使DNA完全溶解，进行样品质量检测，最用放 入-20°C冰箱保存。
[0084] 2. 3DNA浓度测定及DNA样品混池
[0085] 采用NanoDrop分光光度计测定119头猪背最长肌样品DNA浓度，计算0D260/ 0D280比值判定DNA提取质量，如果所有样品0D260/0D280比值应为1. 8-2. 0,则说明该DNA 的提取质量是合格的。
[0086] 根据失水率筛选较高个体和较低个体各18个，高组失水率平均值 (0.3743±0.0127)，系水力水平较低；低组失水率（0? 1133±0.0014)，系水力水平较高；
[0087] 将每个个体DNA样品的浓度稀释到70ng/yL，从每个DNA样品中分别取2yL，分 别构建DNA样品混池（较高组混18个样品，较低组混18个样品），再进行测序，对比两组样 品序列的差异，用来筛选高低组差异显著的SNP位点。
[0088] 2. 4引物设计合成
[0089]依据GenBank数据库猪基因序列UBXNl(Chromosome2， NC_010444. 3(8418673. 8421335))设计包含相应UBXNl启动子混合样测序引物和PCR-SSCP 引物（PU-F和PU-R)。引物序列见表1。
[0090] 表1猪PGAM2基因引物设计信息
[0091]
[0099] PCR反应程序：
[0100] 94°C5min；
[0101] 94°C30s、X30s、72°C30s、35 个循环；
[0102] 72°C7min；
[0103] 4°C保存
[0104]X= 58°C、60°C、62°C、68°C
[0105] 2. 6主要软件及网站
[0106] 相关网站：
[0107]用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 得到相关基因序列
[0108] 2. 7PCR-SSCP
[0109] 用引物对PU-F和PU-R将获得的DNA进行PCR扩增，获得扩增片段；取5yLPCR扩 增产物加等体积上样变性缓冲液，98°C变性lOmin，立即冰浴lOmin，使之保持变性状态，变 性后的PCR产物在12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中150V、4°C条件下电泳12~16h，银染显 色。观察到不同基因型的条带不同，再进行测序验证，得到不同基因型。
[0110] 统计分析UBXNl的各基因型等位基因频率和基因型频率，运用SPSS16. 0单因素 方差法等分析SNP位点遗传多态性及其与失水率的相关性。
[0111] 2. 9组织RNA提取
[0112] (1)用DEPC水清洗擦净匀浆机转子，最后再用Trizol清洗；
[0113] (2)取约IOOmg背最长肌组织放于2mLEP管内，往管中加入500yL的Trizol，用 匀浆机处理组织样，最后再加入500yL的Trizol。室温下放置5min。
[0114] (3)每个EP管中加入200yL氯仿，用振荡器震荡30s，使液体和组织完全混匀后， 室温静置 3min。4°C、12000rpm离心 15min;
[0115] (4)取上层液体加入到新取的I. 5mLEP管中，向EP管中加入500yL异丙醇，完全 混勾后，室温静置lOmin，4°C、12000rpm离心IOmin;
[0116] (6)倒掉上层液体，注意底部的沉淀，加入ImL的预冷75%乙醇，温和震荡，悬浮沉 淀。4°C、12000rpm离心 5min;
[0117] (8)倒掉上层液体，保留底部RNA，若底部仍有水分再用移液枪去除，置超净台中 风干25min;
[0118] (9)在EP管中加入30yL55°C的DEPC7K，静置l〇min，测定RNA质量后放于-70°C 保存或直接用于反转录。
[0119] 2. 10RNA浓度测定
[0120] 采用NanoDrop分光光度计测定各个样品RNA浓度。
[0121] 2. 11 反转录
[0122] 反应体系为IOliL:
[0123] 5XPrimeScript?RTMasterMix2yL
[0124]TotalRNAlug
[01