专利名称：拟穴青蟹微卫星dna标记及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及DNA分子标记技术，特别涉及拟穴青蟹(Scylla paramamosain)微卫星DNA标记及其筛选方法。
背景技术：
微卫星序列(microsatellite sequences),又称简单重复序列(simple sequence repeats, SSRs)，是指基因组中由2 6个核苷酸基本单位重复多次构成的一段DNA序列。 微卫星DNA的高突变性、共显性表达及其在真核生物基因组中的普遍性，使其成为第二代分子标记，在遗传多样性分析(UMc Connel S，1995，Aquaculture，137 19-30)、遗传连锁图谱构建及分子标记辅助选育(2、Cnaani Α. , 2003, Aquaculture, 223 :117-128)中被广泛应用。拟穴青蟹(Scylla paramamosain)隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲 (Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹属(Scylla)。在我国长江以南沿海均产，以福建、广东、广西、海南居多，是我国东南沿海重要的海洋经济蟹类之一。 我国青蟹养殖业目前尚处于初期阶段，绝大多数的苗种来自自然水域。由于养殖业对苗种的需求巨大，导致自然海域的苗种也面临着巨大的捕捞压力。这种不规范的产业模式使野生群体面临种质退化和遗传多样性丧失的风险。为保证青蟹产业的健康快速发展，我国现已开展拟穴青蟹的遗传改良工作，但目前报道的拟穴青蟹微卫星DNA标记非常稀少。因此开发拟穴青蟹微卫星标记对研究拟穴青蟹种质资源的遗传结构及加强分子标记辅助选育具有重要意义
发明内容
1)构建拟穴青蟹微卫星富集文库，挑选单克隆并进行测序；2)使用微卫星DNA位点查找软件获得含有拟穴青蟹微卫星序列的阳性克隆，确定拟穴青蟹微卫星DNA标记。本发明提供了拟穴青蟹微卫星DNA标记A508以及扩增拟穴青蟹微卫星标记A508 的引物序列和扩增方法。A508微卫星标记可用于拟穴青蟹遗传结构分析、种质资源保护及分子标记辅助选育，其重复性良好，是一种可靠有效的分子标记。本发明获得的拟穴青蟹微卫星DNA标记为拟穴青蟹的遗传结构分析、种质资源保护及分子标记辅助选育等奠定基石出。
图1为用拟穴青蟹微卫星DNA标记A508位点的特异性引物扩增20个拟穴青蟹个体DNA的STR分型图。在图1中，1 20为20个拟穴青蟹个体。
具体实施例方式实施例1拟穴青蟹微卫星富集文库的构建1)采用常规方法提取10只拟穴青蟹螯肢肌肉组织基因组DNA并等量混合构建拟穴青蟹基因组DNA池，利用限制性内切酶Mse I对基因组DNA池进行酶切。酶切产物在 1.5%琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切取500 IOOObp的DNA片段并用凝胶回收试剂盒(购自Qiagen公司)纯化回收的酶切产物。2)将上述的回收片段与5’端磷酸化的接头，用T4DNA连接酶进行连接，所述接头的序列第一链为 5，-GACGATGAGTCCTGAG-3，，第二链为 5，-TACTCAGGACTCAT-3，。3)以上述连接产物为模板，以接头中的长链(序列为5’ -GACGATGAGTCCTGAG-3’) 为引物，利用PCR方法进行扩增，并使用PCR产物清洁试剂盒(购自Omega公司)将扩增产物浓缩至约120ng/yL。4)生物素标记的寡核苷酸探针(CT) 15和(CA) 15与PCR产物杂交。具体操作为取上述清洁后的PCR产物5 μ L (约600ng)，加495 μ L灭菌超纯水，在95 °C水浴中解链IOmin， 迅速转入冰水混合物冷却3min，在冰浴中加入2 μ L (CA) 15和(CT) 15混合生物素标记探针 (约200pmol)，并加入13 μ L 20 X SSC缓冲液。在55°C水浴锅中放置一加有去离子水的烧杯，将杂交混合体系放入烧杯中，于55°C孵育5min。将烧杯连同杂交混合体系一起取出，于室温缓慢冷却。5)取一管 600 μ L 链霄素亲禾口素磁珠(Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles, Promega公司)，平衡后重悬于IOOyL 0. 5 X SSC缓冲液，并与上述杂交复合物充分混合，于室温下放置lOmin。6)用磁铁吸附磁珠，弃上清。磁珠用300 μ L 0. 1 X SSC缓冲液在室温下洗涤3次， 每次5min。7)用磁铁吸附磁珠，弃上清。磁珠用100 μ L无菌水在室温下快洗2次。8)最后加入100 μ L无菌水，在94°C下保温lOmin，在磁铁作用下小心吸取上清。 在上清液中加0. 3M醋酸钠(pH5. 2)和2倍体积的无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤1次，溶于 30 μ L无菌水。并以接头中的长链为引物对其进行扩增。
9)将扩增产物纯化后连接到pMD 18-T载体(TaKaRa公司)，然后将连接产物转化到大肠杆菌iToplO感受态细胞，在Amp+LB平板上进行筛选。实施例2含微卫星序列的阳性克隆的测序和微卫星引物的设计1)挑取Amp+LB平板上的单克隆菌落，在Amp+LB液体培养基试管进行培养。2)以上述接头中的长链(GACGATGAGTCCTGAG)为正反向引物，以菌液为模板进行 PCR0 PCR体系20 μ L，退火温度55°C，延伸时间30S，30个循环。3)将菌液PCR产物进行琼脂糖电泳检测，扩增产物条带在500 IOOObp的为连接成功的克隆，扩增产物条带在IOObp左右的为载体自连。4)将菌液PCR鉴定获得的具有片段插入的克隆进行测序。使用微卫星DNA位点查找软件SSmumter对测序结果进行微卫星筛选，获得阳性克隆和序列信息。5)使用ft~imer 5对阳性序列进行引物设计，并合成普通引物，以构建文库的10只青蟹基因组为模板进行PCR检测，筛选出能够稳定扩增的A508微卫星位点。实施例3利用拟穴青蟹微卫星DNA标记进行种群遗传学分析合成A508微卫星标记的荧光标记引物，用于拟穴青蟹群体遗传学分析。具体操作步骤如下1)使用试剂盒(购自天根公司)提取一野生群体20只拟穴青蟹个体的基因组 DNA。2)用A508位点的引物(参见表1)扩增这20个个体的DNA。表1 A508位点引物特性表
权利要求
1.拟穴青蟹微卫星DNA标记，其特征在于所述拟穴青蟹微卫星DNA标记编号为A508， 核苷酸序列为tcctgagtaacagcatacaccctacctaacagtgccagcatgaccattagagataagagt60cagaataccgataaaagctgaaggccatggatccgccaaaaataactatgatgacgccag120cagccctgagactgacgacaactacacttcgattttcgtcgctaaaataacaatgtggac180agaataaggtgcgtgcgtgatacggctggcgtgctaagcctgtgttactataaccactac240caagccacgcaccgcagccttccttccttagccgccagatacttcacagccgacgctaga300cacataccacggccaccacc3. C C 3. C C 3. C 3.3.ccactacatccaccacactaccacgcacca360ctgctcccatcagctgcacacaatcgctccaggaattctctctctgcttcacccctcacc420cttgtgctgtgacggtgcctccagcttccaC3.C3.C3.C3.C3.cagtcactcacacacagaaa480cacacatagccggaggtcttccaacaggaggcgaacaaaacgcaagccaaC 3.3.3.3.3. 3.3. C540gctaagtcctcagtggtacctatgtttttagccggccgatgctattatgtgtttgagtcc600ctttat606 ο
2.如权利要求1所述的拟穴青蟹微卫星DNA标记的筛选方法，其特征在于其包括以下步骤1)构建拟穴青蟹微卫星富集文库，挑选单克隆并进行测序；2)使用微卫星DNA位点查找软件获得含有拟穴青蟹微卫星序列的阳性克隆，确定拟穴青蟹微卫星DNA标记。
3.如权利要求1所述的拟穴青蟹微卫星DNA标记在拟穴青蟹的遗传结构分析、种质资源保护及分子标记辅助选育中的应用。
全文摘要
拟穴青蟹微卫星DNA标记及其筛选方法。涉及DNA分子标记技术，提供拟穴青蟹微卫星DNA标记及其筛选方法。所述拟穴青蟹微卫星DNA标记可编号为A508，筛选方法为构建拟穴青蟹微卫星富集文库，挑选单克隆并进行测序；使用微卫星DNA位点查找软件获得含有拟穴青蟹微卫星序列的阳性克隆，确定拟穴青蟹微卫星DNA标记。A508微卫星标记可用于拟穴青蟹遗传结构分析、种质资源保护及分子标记辅助选育，其重复性良好，是一种可靠有效的分子标记。获得的拟穴青蟹微卫星DNA标记为拟穴青蟹的遗传结构分析、种质资源保护及分子标记辅助选育等奠定基础。
文档编号C12Q1/68GK102181535SQ20111006888
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月21日 优先权日2011年3月21日
发明者叶海辉, 李少菁, 王克坚, 王桂忠, 许晓军 申请人:厦门大学