基于小球藻的金属硫蛋白制备方法
【专利摘要】本发明提供基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，按照下述步骤进行，向小球藻反应器中分别加入锌铜离子进行培养；微孔滤膜浓缩；小球藻常压破壁；叶绿素的提取；金属硫蛋白的提取。金属硫蛋白的来源拓宽到藻类，显著降低金属硫蛋白生产成本；利用小球藻提取金属硫蛋白具有突出优点，生长迅速，积累量大，加工容易；利用本方法提取出金属硫蛋白后的藻干粉可用于制备畜牧业的饲料；先利用乙醇对小球藻内的叶绿素进行提取，降低叶绿素对于金属硫蛋白提取分离过程的影响，提高金属硫蛋白的质量；采用锌、铜交替胁迫诱导制备金属硫蛋白，得到金属硫蛋白的产率高达10g/250kg，纯化后可得到更高纯度的金属硫蛋白。
【专利说明】基于小球藻的金属硫蛋白制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及金属硫蛋白制备【技术领域】，更具体地说涉及一种基于小球藻的金属硫蛋白制备方法。
【背景技术】
[0002]金属硫蛋白(metalloth1nein)是由微生物和动植物产生的金属结合蛋白，富含半胱氨酸的短肽，对多种重金属有高度亲和性。它是分子质量较低，半胱氨酸残基和金属含量极高的蛋白质。与其结合的金属主要是镉、铜和锌，广泛地存在于从微生物到人类各种生物中，其结构高度保守。
[0003]根据金属硫蛋白在化妆品、保健品和新医药等三个领域的应用发展情况，结合我国消费者的实际水平，以及新医药发展的步骤和速度，化妆品行业年需求20公斤左右，婴幼儿食品添加年需求10公斤左右，中老年保健食品年需求10-20公斤，新医药年需求20公斤左右，而产量为:2003年为6.8公斤，2004年为8.6公斤，2005年为9.5公斤，远远不能满足实际需求。2005年国内市场价:化妆品、保健品用300万元/公斤，医药用800-1000万元/公斤。2005年国外最新报价为82.50美元/毫克，273.7美元/5毫克。
[0004]目前国内采用的都是用兔肝生产金属硫蛋白，设备投入大，转让费高，而且产量低，难以满足现在市场对于金属硫蛋白的需求。
【发明内容】
[0005]本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种基于小球藻的金属硫蛋白制备方法。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
[0007]基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，按照下述步骤进行:
[0008]步骤1，将培养液置于反应器内，120°C下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25°C光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25 °C无光照的培养箱中，培养5h，然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复3-10次，向处于对数生长期的小球藻中加入5-100 μ mol/L锌离子溶液，培养24-120h后，再向经过上述处理后的小球藻中加入5-100 μ mo I/L铜离子溶液，再培养3-10天；
[0009]步骤2，培养3-10天后，将培养液以及其中的小球藻进行微孔滤膜浓缩，浓缩至原培养液体积的0.2-0.6 %，膜浓缩参数:膜浓缩压力为0.05-0.09MPa，膜浓缩温度为25-30°C，得小球藻浓缩液；
[0010]步骤3，将步骤2中所得的小球藻浓缩液在常温下进行压力破壁，所述常温压力破壁的条件:破壁温度为25°C，破壁压力为300-500MPa，破壁时间为l_2h，得到破壁后的混合藻液；
[0011]步骤4，将步骤3中得到的破壁后的混合藻液用80-95%的乙醇溶液进行叶绿素的提取，提取温度为55-65°C，提取时间为5-7h，提取3-5次，提取后的混合液经过离心，离心条件:转速为80-120r/min，离心时间为10_15min，离心2_3次，得到叶绿素提取液以及经过脱色的混合藻液；
[0012]步骤5，将步骤4中经过脱色的混合藻液离心，离心条件:离心转速为1000-20001./min，离心时间为10-15min，离心3_5次，取上清液，采用葡聚糖凝胶对上述上清液进行层析，洗脱液选用5-20mmol/L的盐酸提取液，经柱层析之后得到收集液，离心后所得藻泥在50-60°C下干燥得到藻干粉；
[0013]步骤6，将上述收集液进行合并，经过真空冷冻干燥之后，用超纯水对其进行溶解，采用脱盐柱对其进行层析，洗脱液采用超纯水，脱盐纯化1-4次，将所得的洗脱液用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后的滤液在-40-25 °C下进行干燥得到金属硫蛋白。
[0014]优选的，基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，按照下述步骤进行:
[0015]步骤1，将培养液置于反应器内，120°C下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25°C光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25 °C无光照的培养箱中，培养5h，然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复8次，向处于对数生长期的小球藻中加入50 ymol/L锌离子溶液，培养90h后，再向经过上述处理后的小球藻中加入70ymol/L铜离子溶液，再培养8天；
[0016]步骤2，培养8天后，将培养液以及其中的小球藻进行微孔滤膜浓缩，浓缩至原培养液体积的0.4%，膜浓缩参数:膜浓缩压力为0.07MPa，膜浓缩温度为25°C，得小球藻浓缩液；
[0017]步骤3，将步骤2中所得的小球藻浓缩液在常温下进行压力破壁，所述常温压力破壁的条件:破壁温度为25°C，破壁压力为450MPa，破壁时间为1.5h，得到破壁后的混合藻液；
[0018]步骤4，将步骤3中得到的破壁后的混合藻液用90%的乙醇溶液进行叶绿素的提取，提取温度为60°C，提取时间为6.5h，提取4次，提取后的混合液经过离心，离心条件:转速为lOOr/min，离心时间为12min，离心3次，得到叶绿素提取液以及经过脱色的混合藻液；
[0019]步骤5，将步骤4中经过脱色的混合藻液离心，离心条件:离心转速为1800r/min，离心时间为12min，离心4次，取上清液，采用葡聚糖凝胶对上述上清液进行层析，洗脱液选用12mmol/L的盐酸提取液，经柱层析之后得到收集液，离心后所得藻泥在56°C下干燥得到藻干粉；
[0020]步骤6，将上述收集液进行合并，经过真空冷冻干燥之后，用超纯水对其进行溶解，采用脱盐柱对其进行层析，洗脱液采用超纯水，脱盐纯化3次，将所得的洗脱液用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后的滤液在-35 °C下进行干燥得到金属硫蛋白。
[0021 ] 所述步骤I中的培养液的原料为2g/L的NaHC03、0.5g/L的KN03、0.02g/L的KH2PO4、0.3mg/L 的 Vbi^P 1.0 μ g/L 的 V B12o
[0022]所述小球藻与所述培养液按照体积比为1:1-3的比例进行接种。
[0023]所述步骤I中的锌离子能够采用硫酸锌、氯化锌、葡萄糖酸锌中的一种或几种，铜离子能够采用硫酸铜、氯化铜、葡萄糖酸铜中的一种或几种。
[0024]本发明的有益效果为:金属硫蛋白的来源从传统主要来源为动物，拓宽到藻类，显著降低了金属硫蛋白的生产成本；利用小球藻提取金属硫蛋白具有突出优点，生长迅速，积累量大，加工容易；并且利用本发明方法提取出金属硫蛋白后的所得到的副产物藻干粉仍可用于制备畜牧业的饲料，降低了生产成本；同时，先利用乙醇对小球藻内的叶绿素进行提取，降低了叶绿素对于金属硫蛋白提取分离过程的影响，使得最终得到的金属硫蛋白不带有叶绿素的颜色，提高了金属硫蛋白的质量；采用自养-异养交替方式培养小球藻，使小球藻的繁殖速率较其他培养方式高30%以上；采用锌、铜交替胁迫诱导制备金属硫蛋白，得到金属硫蛋白的产率高达10g/250kg，纯化后可得到更高纯度的金属硫蛋白。
【具体实施方式】
[0025]下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
[0026]实施例1
[0027]基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，按照下述步骤进行:
[0028]步骤I，小球藻培养液的原料为2g/L的NaHC03、0.5g/L的KN03、0.02g/L的ΚΗ2Ρ04、0.3mg/L的Vbi和1.0 μ g/L的Vb12，将培养液置于反应器内，120°C下灭菌，小球藻与培养液按照体积比为1:3的比例进行接种，再置于25°C光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25°C无光照的培养箱中，培养5h，然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复10次，向处于对数生长期的小球藻中加入5 μ mol/L硫酸锌溶液，培养120h后，再向经过上述处理后的小球藻中加入5 μ mol/L氯化铜溶液，再培养10天；
[0029]步骤2，培养10天后，将培养液以及其中的小球藻进行微孔滤膜浓缩，浓缩至原培养液体积的0.6%，膜浓缩参数:膜浓缩压力为0.09MPa，膜浓缩温度为30°C，得小球藻浓缩液；
[0030]步骤3，将步骤2中所得的小球藻浓缩液在常温下进行压力破壁，所述常温压力破壁的条件:破壁温度为25°C，破壁压力为500MPa，破壁时间为2h，得到破壁后的混合藻液；
[0031]步骤4，将步骤3中得到的破壁后的混合藻液用95%的乙醇溶液进行叶绿素的提取，提取温度为65°C，提取时间为7h，提取5次，提取后的混合液经过离心，离心条件:转速为120r/min，离心时间为15min，离心3次，得到叶绿素提取液以及经过脱色的混合藻液；
[0032]步骤5，将步骤4中经过脱色的混合藻液离心，离心条件:离心转速为2000r/min，离心时间为15min，离心5次，取上清液，采用葡聚糖凝胶对上述上清液进行层析，洗脱液选用20mmol/L的盐酸提取液，经柱层析之后得到收集液，离心后所得藻泥在60°C下干燥得到藻干粉；
[0033]步骤6，将上述收集液进行合并，经过真空冷冻干燥之后，用超纯水对其进行溶解，采用脱盐柱对其进行层析，洗脱液采用超纯水，脱盐纯化4次，将所得的洗脱液用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后的滤液在-25 °C下进行干燥得到金属硫蛋白。
[0034]实施例2
[0035]基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，按照下述步骤进行:
[0036]步骤I，小球藻培养液的原料为2g/L的NaHC03、0.5g/L的KN03、0.02g/L的ΚΗ2Ρ04、0.3mg/L的Vbi和1.0 μ g/L的V B12，将培养液置于反应器内，120°C下灭菌，小球藻与培养液按照体积比为1:1的比例进行接种，再置于25°c光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25°C无光照的培养箱中，培养5h，然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复3次，向处于对数生长期的小球藻中加入100 μ mol/L氯化锌以及葡萄糖酸锌混合溶液，培养24h后，再向经过上述处理后的小球藻中加入100 μ mol/L硫酸铜以及葡萄糖酸铜混合溶液，再培养3天；
[0037]步骤2，培养3天后，将培养液以及其中的小球藻进行微孔滤膜浓缩，浓缩至原培养液体积的0.2%，膜浓缩参数:膜浓缩压力为0.05MPa，膜浓缩温度为25°C，得小球藻浓缩液；
[0038]步骤3，将步骤2中所得的小球藻浓缩液在常温下进行压力破壁，所述常温压力破壁的条件:破壁温度为25°C，破壁压力为300MPa，破壁时间为lh，得到破壁后的混合藻液；
[0039]步骤4，将步骤3中得到的破壁后的混合藻液用80%的乙醇溶液进行叶绿素的提取，提取温度为55°C，提取时间为5h，提取3次，提取后的混合液经过离心，离心条件:转速为80r/min，离心时间为lOmin，离心2次，得到叶绿素提取液以及经过脱色的混合藻液；
[0040]步骤5，将步骤4中经过脱色的混合藻液离心，离心条件:离心转速为1000r/min，离心时间为lOmin，离心3次，取上清液，采用葡聚糖凝胶对上述上清液进行层析，洗脱液选用5mmol/L的盐酸提取液，经柱层析之后得到收集液，离心后所得藻泥在50°C下干燥得到藻干粉；
[0041]步骤6，将上述收集液进行合并，经过真空冷冻干燥之后，用超纯水对其进行溶解，采用脱盐柱对其进行层析，洗脱液采用超纯水，脱盐纯化I次，将所得的洗脱液用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后的滤液在-40 °C下进行干燥得到金属硫蛋白。
[0042]实施例3
[0043]基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，按照下述步骤进行:
[0044]步骤I，小球藻培养液的原料为2g/L的NaHC03、0.5g/L的KN03、0.02g/L的ΚΗ2Ρ04、
0.3mg/L的Vbi和1.0 μ g/L的V B12，将培养液置于反应器内，120°C下灭菌，小球藻与培养液按照体积比为1:2的比例进行接种，再置于25°C光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25°C无光照的培养箱中，培养5h，然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复8次，向处于对数生长期的小球藻中加入50 μ mol/L氯化锌溶液，培养90h后，再向经过上述处理后的小球藻中加入70 μ mol/L氯化铜溶液，再培养8天；
[0045]步骤2，培养8天后，将培养液以及其中的小球藻进行微孔滤膜浓缩，浓缩至原培养液体积的0.4%，膜浓缩参数:膜浓缩压力为0.07MPa，膜浓缩温度为25°C，得小球藻浓缩液；
[0046]步骤3，将步骤2中所得的小球藻浓缩液在常温下进行压力破壁，所述常温压力破壁的条件:破壁温度为25°C，破壁压力为450MPa，破壁时间为1.5h，得到破壁后的混合藻液；
[0047]步骤4，将步骤3中得到的破壁后的混合藻液用90%的乙醇溶液进行叶绿素的提取，提取温度为60°C，提取时间为6.5h，提取4次，提取后的混合液经过离心，离心条件:转速为lOOr/min，离心时间为12min，离心3次，得到叶绿素提取液以及经过脱色的混合藻液；
[0048]步骤5，将步骤4中经过脱色的混合藻液离心，离心条件:离心转速为1800r/min，离心时间为12min，离心4次，取上清液，采用葡聚糖凝胶对上述上清液进行层析，洗脱液选用12mmol/L的盐酸提取液，经柱层析之后得到收集液，离心后所得藻泥在56°C下干燥得到藻干粉；
[0049]步骤6，将上述收集液进行合并，经过真空冷冻干燥之后，用超纯水对其进行溶解，采用脱盐柱对其进行层析，洗脱液采用超纯水，脱盐纯化3次，将所得的洗脱液用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后的滤液在-35 °C下进行干燥得到金属硫蛋白。
[0050]以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
【权利要求】
1.基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征在于:按照下述步骤进行: 步骤1，将培养液置于反应器内，120°c下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25°C光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25°C无光照的培养箱中，培养5h，然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复3-10次，向处于对数生长期的小球藻中加入5-100 ymol/L锌离子溶液，培养24-120h后，再向经过上述处理后的小球藻中加入5-100 ymol/L铜离子溶液，再培养3-10天； 步骤2，培养3-10天后，将培养液以及其中的小球藻进行微孔滤膜浓缩，浓缩至原培养液体积的0.2-0.6%,膜浓缩参数:膜浓缩压力为0.05-0.09MPa，膜浓缩温度为25_30°C，得小球藻浓缩液； 步骤3，将步骤2中所得的小球藻浓缩液在常温下进行压力破壁，所述常温压力破壁的条件:破壁温度为25°C，破壁压力为300-500MPa，破壁时间为l_2h，得到破壁后的混合藻液； 步骤4，将步骤3中得到的破壁后的混合藻液用80-95%的乙醇溶液进行叶绿素的提取，提取温度为55-65°C，提取时间为5-7h，提取3-5次，提取后的混合液经过离心，离心条件:转速为80-120r/min，离心时间为10_15min，离心2_3次，得到叶绿素提取液以及经过脱色的混合藻液； 步骤5，将步骤4中经过脱色的混合藻液离心，离心条件:离心转速为1000-20001./min，离心时间为10-15min，离心3_5次，取上清液，采用葡聚糖凝胶对上述上清液进行层析，洗脱液选用5-20mmol/L的盐酸提取液，经柱层析之后得到收集液，离心后所得藻泥在50-60°C下干燥得到藻干粉； 步骤6，将上述收集液进行合并，经过真空冷冻干燥之后，用超纯水对其进行溶解，采用脱盐柱对其进行层析，洗脱液采用超纯水，脱盐纯化1-4次，将所得的洗脱液用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后的滤液在-40-25 °C下进行干燥得到金属硫蛋白。
2.根据权利要求1所述的基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征在于: 步骤1，将培养液置于反应器内，120°C下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25°C光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25°C无光照的培养箱中，培养5h，然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复8次，向处于对数生长期的小球藻中加入50 ymol/L锌离子溶液，培养90h后，再向经过上述处理后的小球藻中加入70 μ mol/L铜离子溶液，再培养8天； 步骤2，培养8天后，将培养液以及其中的小球藻进行微孔滤膜浓缩，浓缩至原培养液体积的0.4%，膜浓缩参数:膜浓缩压力为0.07MPa，膜浓缩温度为25°C，得小球藻浓缩液； 步骤3，将步骤2中所得的小球藻浓缩液在常温下进行压力破壁，所述常温压力破壁的条件:破壁温度为25°C，破壁压力为450MPa，破壁时间为1.5h，得到破壁后的混合藻液； 步骤4，将步骤3中得到的破壁后的混合藻液用90%的乙醇溶液进行叶绿素的提取，提取温度为60°C，提取时间为6.5h，提取4次，提取后的混合液经过离心，离心条件:转速为lOOr/min，离心时间为12min，离心3次，得到叶绿素提取液以及经过脱色的混合藻液； 步骤5，将步骤4中经过脱色的混合藻液离心，离心条件:离心转速为1800r/min，离心时间为12min，离心4次，取上清液，采用葡聚糖凝胶对上述上清液进行层析，洗脱液选用12mmol/L的盐酸提取液，经柱层析之后得到收集液，离心后所得藻泥在56°C下干燥得到藻干粉； 步骤6，将上述收集液进行合并，经过真空冷冻干燥之后，用超纯水对其进行溶解，采用脱盐柱对其进行层析，洗脱液采用超纯水，脱盐纯化3次，将所得的洗脱液用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后的滤液在-35 °C下进行干燥得到金属硫蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征在于:所述步骤I中的培养液的原料为2g/L的NaHC03、0.5g/L的KN03、0.02g/L的KH2P04、0.3mg/L的Vbi和 l.0yg/L 的乂.。
4.根据权利要求1或2所述的基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征在于:所述小球藻与所述培养液按照体积比为1:1-3的比例进行接种。
5.根据权利要求1或2所述的基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征在于:所述步骤I中的锌离子能够采用硫酸锌、氯化锌、葡萄糖酸锌中的一种或几种，铜离子能够采用硫酸铜、氯化铜、葡萄糖酸铜中的一种或几种。
【文档编号】C07D487/22GK104480173SQ201410795199
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月18日 优先权日:2014年12月18日
【发明者】季延滨, 李涛 申请人:天科慧洋科技发展（天津）有限公司