穿心莲内酯的工业化制备色谱分离纯化方法
【专利摘要】本发明涉及一种穿心莲内酯的工业化制备色谱分离纯化方法。包括以下步骤：（1）将穿心莲叶粉碎后溶解于溶剂中，对原料浸提，固液分离后得到提取液；（2）将上述提取液用干燥方法除去液体，过滤获得穿心莲内酯粗品；(3)将穿心莲内酯粗品配置成溶液，过滤除去不溶物，获得穿心莲内酯溶液；(4)将上述穿心莲内酯溶液泵入动态轴向压缩柱制备色谱系统，经两次梯度洗脱，用检测波长为254mm的紫外光度检测器，收集保留时间在15—20min的馏出液。本发明所用溶剂廉价、安全，分离纯化过程一步完成，且可在线实时监测，大大提高了安全性，节约了原料和时间成本，适用于大规模工业化生产。
【专利说明】穿心莲内醒的工业化制备色谱分离纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及天然产物提取领域，特别是涉及一种穿也莲内醋的工业化制备色谱分 离纯化方法。
【背景技术】
[0002] 穿也莲为爵床科穿也莲属植物，在亚洲几个世纪W前就用于治疗胃肠道和呼吸道 感染、发热、疮疹、咽喉痛和各种细菌性感染。在中医里，穿也莲是一种治疗感冒的重要草 药，它用于退热、驱毒，且价格低廉。
[0003] 由于穿也莲内醋是穿也莲的主要有效成分，与茎、果相比，穿也莲叶中含穿也莲内 醋最高；穿也莲内醋为醋类结构，在水溶液中易水解、开环、异构化，故影响药物稳定性。在 对穿也莲内醋的稳定性研究中发现，在不同温度、不同抑值环境、不同的生物样品及不同 有机溶剂中，穿也莲内醋稳定性都有较明显的差异。温度越低，穿也莲内醋的稳定性越好； 在碱性条件下不稳定，且随着碱性强度的增加，其不稳定性增强；其在酸性条件下较稳定， 但并非酸性越强，稳定性就越好；其最稳定的抑值为3?5。目前已经发现穿也莲内醋具 有W下药理作用；抗菌消炎、解热作用；抗癌和免疫调节作用；病毒和免疫增强作用；也血 管作用；保护肝脏。
[0004] 有关穿也莲内醋提取分离的方法报道较多，有水提醇沉法、碱提己醇重结晶法、水 提大孔吸附树脂洗脱法等。专利号为201310096203. 0的中国专利"穿也莲内醋及其制备方 法"描述了一种重结晶制备穿也莲内醋的方法，该方法前处理步骤较为繁琐，需使用大量己 醇，且所得纯度不高。专利号为201310577892. 7的中国专利"高品质穿也莲内醋组分的制 备方法"描述了用反相色谱和亲水色谱结合进行少量高品质穿也莲内醋的提取方法，该方 法相较于前一篇专利，在分离方法上已有了较大提高，但仍存在分离时间较长，产品分离量 有限，且难W实时监测分离进度的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对目前穿也莲粗品精制过程中所存在的工艺繁 杂，纯度不高，分离时间较长，产品分离量有限，且难W实时监测分离进度等问题。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种采用工业化制备色谱分离系统一步在线 分离制备高纯度穿也莲内醋的新方法。本发明的技术方案如下：一种穿也莲内醋的工业化 制备色谱分离纯化方法，包括W下步骤： (1) 将穿也莲叶粉碎后溶解于溶剂中，在辅助作用下对原料浸提，固液分离后得到提取 液； (2) 将上述提取液用干燥方法除去液体，过滤获得穿也莲内醋粗品； (3) 将穿也莲内醋粗品配置成溶液，过滤除去不溶物，获得穿也莲内醋溶液； (4) 将上述穿也莲内醋溶液粟入动态轴向压缩柱制备色谱系统，经两次梯度洗脱，用检 测波长为254mm的紫外光度检测器，收集保留时间在15 - 20min的觸出液； 其中： 步骤（4)中所述动态轴向压缩柱制备色谱系统，柱尺寸为戀50*250mm，填料为10-50 y m反相球形娃胶，流动相为有机溶剂的水溶液，浓度为10 - 90wt%。
[0007] 进一步地，步骤（4)中所述流动相为己醇和水，第一次梯度范围为30:70-80:20， 流速为1001111/111111，洗脱时间为30111111，第二次梯度范围为90:10，洗脱时间为20111山。
[0008] 进一步地，步骤（4)中所述流动相为甲醇和水，第一次梯度范围为40:60-20:80， 流速为120ml/min洗脱时间为50min，第二次梯度范围为90:10,洗脱时间为lOmin。
[0009] 进一步地，步骤（4)中所述流动相为己膳和水，第一次梯度范围为20:80-30:70， 流速为8〇1111/111111，洗脱时间为3〇111111，第二次梯度范围为50:50，洗脱时间为2〇111111。
[0010] 进一步地，步骤（4)中所述反相球形娃胶为反相正十八焼基娃胶。
[0011] 进一步地，步骤（4)中所述反相正十八焼基娃胶粒径为lOym或22ym。
[0012] 进一步地，步骤（1)中所述溶剂为水或有机溶剂或水和有机溶剂的混合物。
[0013] 进一步地，步骤（1)中所述辅助作用为加热，采用微波或超声波加热。
[0014] 进一步地，步骤（2)中所述干燥方法为喷雾或旋蒸。
[0015] 本发明的有益效果是直接采用粗品提取后的穿也莲提取液来制备穿也莲内醋，无 需大量复杂繁琐的前处理过程，所用溶剂廉价、安全，分离纯化过程一步完成，且可在线实 时监测，大大提高了安全性，节约了原料和时间成本，适用于大规模工业化生产。高效液相 色谱最终测定显示，穿也莲内醋纯度大于97%，总杂小于3%。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是原始穿也莲内醋粗品的高效液相色谱测定图谱。
[0017] 图2是用填充了 10 ym正十八焼基反相娃胶填料的动态轴向压缩柱分离纯化穿 也莲内醋的高效液相色谱测定图谱，进样400mg。
[0018] 图3是用填充了 10 y m正十八焼基反相娃胶填料的动态轴向压缩柱分离纯化穿也 莲内醋的高效液相色谱测定图谱，进样Ig。
[0019] 图4是用填充了 10 ym正十八焼基反相娃胶填料的动态轴向压缩柱分离纯化穿也 莲内醋的高效液相色谱测定图谱，进样3g。
[0020] 图5是用填充了 10 y m正十八焼基反相娃胶填料的动态轴向压缩柱分离纯化穿也 莲内醋的制备图谱，进样3g。
【具体实施方式】
[0021] 下面通过具体的实施例对本发明做进一步说明。
[0022] 将穿也莲叶粉碎后用水或有机溶剂或水/有机溶剂混合溶剂在辅助作用下对原 料进行浸提，其中辅助作用包括加热，采用微波或超声等；固液分离后得到墨绿色穿也莲提 取液；再采用干燥手段除去液体，其中干燥手段包括喷雾或旋蒸等，获得穿也莲内醋粗品 (穿也莲内醋含量在10-50%之间)，此时，穿也莲内醋粗品的高效液相色谱测定图谱如图1 所示。
[0023] 采用高效液相色谱（册LC)研究和优化穿也莲内醋的最佳分离纯化条件。尔后将 其等比例放大，于填充有反相正十八焼基娃胶填料的动态轴向压缩柱（DAC)内进行分离，在 线收集穿也莲内醋对应色谱峰的洗脱液，一步分离纯度>95%，最高可达99% W上；收率一般 在70%~90%范围内，与纯度成反比。
[0024] 采用填料为10-50微米反相球形娃胶，优选10或22微米C18反相球形娃胶； 流动相为有机溶剂的水溶液，有机溶剂包括但不限于甲醇、己醇、己膳等，浓度在 10-90wt%之间，出于成本考虑，优选甲醇、己醇。
[0025] 实施例1 1. 取400mg穿也莲内醋粗品配置成溶液，过滤除去不溶物； 2. 将穿也莲内醋溶液粟入动态轴向压缩柱制备色谱系统，柱尺寸为〇50X250mm， 正十八焼基反相娃胶填料粒径为10 ym，上样量为400mg，流动相为己醇与水，梯度范围为 30 ;70?80 ;20,流速为lOOml/min，洗脱时间30min。之后将梯度调整为90 ;10,继续洗脱 20min，一个分离周期结束。采用的紫外光度检测器的检测波长为254nm，收集保留时间在 15?20min的觸出液。如图2所示，经HPLC分析纯度为99. 0%。
[002引 实施例2 1. 取Ig穿也莲内醋粗品配置成溶液，过滤除去不溶物； 2. 将穿也莲内醋溶液粟入动态轴向压缩柱制备色谱系统，柱尺寸为050X250mm， 正十八焼基反相娃胶填料粒径为10 y m，上样量为Ig，流动相为己醇与水，梯度范围为 30 ;70?80 ;20,流速为lOOml/min，洗脱时间30min。之后将梯度调整为90 ;10,继续洗脱 20min，一个分离周期结束。采用的紫外光度检测器的检测波长为254nm，收集保留时间在 15?20min的觸出液。如图3所示，经HPLC分析纯度为99. 3%。
[0027] 实施例3 1. 取3g穿也莲内醋粗品配置成浓度溶液，过滤除去不溶物； 2. 将穿也莲内醋溶液粟入动态轴向压缩柱制备色谱系统，柱尺寸为〇50X250mm， 正十八焼基反相娃胶填料粒径为lOym，上样量为3g，流动相为己醇与水，梯度范围为 30 ;70?80 ;20,流速为lOOml/min，洗脱时间30min。之后将梯度调整为90 ;10,继续洗脱 20min，一个分离周期结束。采用的紫外光度检测器的检测波长为254nm，收集保留时间在 15?20min的觸出液。如图4所示，经HPLC分析纯度为99. 90%。填料粒径为10 y m正十八 焼基反相娃胶填料的动态轴向压缩柱分离纯化穿也莲内醋的制备图谱，如图5所示。
[002引 实施例4 1. 取3g穿也莲内醋粗品配置成浓度溶液，过滤除去不溶物； 2. 将穿也莲内醋溶液粟入动态轴向压缩柱制备色谱系统，柱尺寸为050X250mm，填 料采用22微米反相球形娃胶，上样量为3g，流动相为己醇与水，梯度范围为30 ;70?80 ;20， 流速为lOOml/min，洗脱时间30min。之后将梯度调整为90 ;10,继续洗脱20min，一个分离 周期结束。采用的紫外光度检测器的检测波长为254nm，收集保留时间在15?20min的觸出 液。经HPLC分析纯度为98. 3%。
[0029] 实施例5 1. 取3g穿也莲内醋粗品配置成浓度溶液，过滤除去不溶物； 2. 将穿也莲内醋溶液粟入动态轴向压缩柱制备色谱系统，柱尺寸为0 50X 250mm，正 十八焼基反相娃胶填料粒径为10 y m，上样量为3g，采用流动相为甲醇与水，梯度范围为 40 ;60?20 ;80,流速为120ml/min，洗脱时间50min。之后将梯度调整为90 ;10,继续洗脱 lOmin，一个分离周期结束。采用的紫外光度检测器的检测波长为254nm，收集保留时间在 15?20min的觸出液。经HPLC分析纯度为99. 5〇/〇。
[0030] 实施例6 1. 取3g穿也莲内醋粗品配置成浓度溶液，过滤除去不溶物； 2. 将穿也莲内醋溶液粟入动态轴向压缩柱制备色谱系统，柱尺寸为〇50X250mm， 正十八焼基反相娃胶填料粒径为10 ym，上样量为3g，采用流动相为己膳与水，梯度范围 为20 ;80?30 ;70,流速为80ml/min，洗脱时间30min。之后将梯度调整为50 ;50,继续洗脱 20min，一个分离周期结束。采用的紫外光度检测器的检测波长为254nm，收集保留时间在 15?20min的觸出液。经HPLC分析纯度为98. 8〇/〇。
[0031] W上所述仅为用W解释本发明的优选实施例，并非据W对本发明作任何形式上的 限制，故凡是在本发明的创作精神基础上所作的任何形式修饰或变更，皆应属于本发明的 保护范畴。
【权利要求】
1. 一种穿心莲内酯的工业化制备色谱分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤； 将穿心莲叶粉碎后溶解于溶剂中，在辅助作用下对原料浸提，固液分离后得到提取 液； 将上述提取液用干燥方法除去液体，过滤获得穿心莲内酯粗品； 将穿心莲内酯粗品配置成溶液，过滤除去不溶物，获得穿心莲内酯溶液； 将上述穿心莲内酯溶液泵入动态轴向压缩柱制备色谱系统，经两次梯度洗脱，用检测 波长为254mm的紫外光度检测器，收集保留时间在15 - 20min的馏出液； 其中： 步骤（4)中所述动态轴向压缩柱制备色谱系统，柱尺寸为05〇*25〇mm，填料为10- 50μm反相球形硅胶，流动相为有机溶剂的水溶液，浓度为10 - 90wt%。
2. 根据权利要求1所述的穿心莲内酯的工业化制备色谱分离纯化方法，其特征在 于：步骤（4)中所述流动相为乙醇和水，步骤（4)中所述两次梯度洗脱，第一次梯度范围为 30:70-80:20，流速为1001111/1^11，洗脱时间为301^11，第二次梯度范围为90 :10，洗脱时间 为 20min〇
3. 根据权利要求1所述的穿心莲内酯的工业化制备色谱分离纯化方法，其特征在 于：步骤（4)中所述流动相为甲醇和水，步骤（4)中所述两次梯度洗脱，第一次梯度范围为 40:60-20:80,流速为120ml/min洗脱时间为50min，第二次梯度范围为90:10,洗脱时间为 IOmin0
4.根据权利要求1所述的穿心莲内酯的工业化制备色谱分离纯化方法，其特征在 于：步骤（4)中所述流动相为乙腈和水，步骤（4)中所述两次梯度洗脱，第一次梯度范围为 20:80-30:70,流速为80ml/min，洗脱时间为30min，第二次梯度范围为50:50,洗脱时间为 20min〇
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的穿心莲内酯的工业化制备色谱分离纯化方法， 其特征在于：步骤（4)中所述反相球形硅胶为反相正十八烷基硅胶。
6. 根据权利要求5所述的穿心莲内酯的工业化制备色谱分离纯化方法，其特征在于： 所述反相正十八烧基娃胶粒径为10μm或22μm。
7. 根据权利要求1所述的穿心莲内酯的工业化制备色谱分离纯化方法，其特征在于： 步骤（1)中所述溶剂为水或有机溶剂或水和有机溶剂。
8. 根据权利要求1所述的穿心莲内酯的工业化制备色谱分离纯化方法，其特征在于： 步骤（1)中所述辅助作用为加热，采用微波或超声波加热。
9. 根据权利要求1所述的穿心莲内酯的工业化制备色谱分离纯化方法，其特征在于： 步骤（2)中所述干燥方法为喷雾或旋蒸。
【文档编号】C07D307/60GK104447642SQ201410795234
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月19日 优先权日:2014年12月19日
【发明者】黄曦 申请人:黄曦