制造具有氧化还原活性的低金属化金属硫蛋白的方法及含有该金属硫蛋白的医药组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是关于具有氧化还原活性的低金属化（hypo-metal lated)金属硫 (metallothionein，MT)蛋白的制造，特别是特定数目的金属硫蛋白半胱氨酸结合位（MT cysteinyl binding sites)与生理相关金属离子（physiologically relevant metal ions)结合的金属硫蛋白的制造。本发明并关于含有具有氧化还原活性的低金属化金属 硫蛋白的医药组合物，以及使用该组合物治疗起因自高氧化压力及/或锌失衡所造成的疾 病，其中清除自由基活性分子（free reactive species)以及平衡游离锌含量以回应内部 氧化还原电位，是有利于治疗的。
【背景技术】
[0002] 氧化压力是一种经常发生于人体内的有害形式的化学压力，主要发生于细胞内能 量转换之处，亦即粒线体内。自粒线体电子传递链中泄漏的电子被视为是造成细胞内自由 基，例如活性氧物质（reactive oxygen species, R0S)、活性氮物质（reactive nitrogen species，RNS)等，产生的主因。外在刺激如环境化学物质、辐射、病毒感染，以及营养不良 与生活习惯，都会造成自由基的产生，导致内部氧化压力。因为自由基如R0S或RNS等含有 未配对的电子，因此其显现出相当程度的化学反应性（Cadenas等人，2000)，且会造成各种 细胞内损伤如DNA氧化作用、脂质过氧化作用、酶不活化作用、RNA氧化作用等（Swindell， 2011年）。若不加以控制，这样的氧化压力及随之而来的分子损伤会表现出一系列的病症 (Swindel 1，2011年）。例如，氧化压力现被视为是代谢失调的潜在原因，包含但不限于糖尿 病、高脂血症以及肥胖症，与年龄相关的神经性疾病，包含但不限于帕金森氏症与阿滋海默 症，以及各种形式的癌症（Swindell，2011年；Chimienti，2013年；Furukawa等人，2004年； Ozcan 等人，2004 年；Miyazaki 等人，2008 年；Vasto 等人，2008 年；Moreli 等人，2014 年）。
[0003] 自由基的产生与细胞内氧化还原状态有着紧密的关联，其中，氧化还原状态必须 被维持在严格的生理范围内，以维持正常的身体功能（Jiang等人，1998年）。自由基的清 除与不活化作用是由生理性抗氧化剂如麸胱甘肽（glutathione，GSH)、维生素C及E、类脂 酸、类黄酮以及其他具有氧化还原活性的成分来完成（Aquilano等人，2014年）。这些具有 保护作用的抗氧化剂的氧化还原活性亦与细胞的氧化还原状态紧密连结，且其抗氧化能力 的再生以及细胞内氧化还原电位的平衡是经由氧化还原活性金属离子、酵素与受质等耦合 的复杂交互作用所完成（Jiang等人，1998年；Aquilano等人，2014年）。内在抗氧化保护 机制与氧化压力源的超载，以及因此造成的细胞间氧化还原电位不平衡，将会无可避免地 导致细胞内组成分的损伤与功能障碍，其表现于细胞、组织、器官以及最终系统性崩坏。
[0004] 金属硫蛋白（MT)家族的成员在人类体内的中心作用包含如：氧化还原活性、自由 基清除与金属离子结合蛋白，连结抗氧化活性、自由基结合与金属离子滴定至细胞内氧化 还原电位等。金属硫蛋白为低分子量、具有非常高含量的半胱胺酸的单链多胜肽。该半胱 胺酸残基上的硫氢基（sulfhydryl)使金属硫蛋白可与金属离子结合，且该半胱胺酸残基 上的硫氢基负责清除活性物质、展现抗氧化活性，以及对胞内氧化还原电位的改变作出反 应（Babula 等人，2012 年）。
[0005] 在人类中，金属硫蛋白被分成四个亚群（MT1-4)，其中MT1亚群含有至少8个确定 的成员，且MT2-4亚群各含有1个确定的成员（Babula等人，2012年）。所有金属硫蛋白异 构物的活性半胱胺酸残基在数量与位置上具有保守性，异构物之间的差异仅在于将这些半 胱胺酸分隔开来的结构氨基酸，以及控制表现结构域的调苄基因区域（Babula等人，2012 年）。
[0006] 金属硫蛋白MT1与MT2在人体内大部分的软组织中表达，表达量最高在肝脏及肾 脏，而金属硫蛋白MT3被视为是脑专一性的异构物，在神经系统中具有最尚的表达量，但也 表达于心脏、肾脏及生殖器官中。金属硫蛋白MT4异构物则显现出最受限制的表达模式，目 前仅于鳞状上皮细胞中被发现（Babula等人，2012年）。金属硫蛋白的表达由不同刺激所 诱导，如压力贺尔蒙（例如：糖皮质素glucocorticoids)、细胞激素（cytokines)、福射线、 重金属以及化学污染、发炎，以及氧化压力等（Babula等人，2012年）。金属硫蛋白的半衰 期视金属化状态（亦即，有多少结合位置与何种金属离子结合）以及氧化还原状态（亦即， 有多少游离的半胱胺酸硫基团被氧化）两者而定（Krezel等人，2007年）。金属硫蛋白的 降解主要发生于溶酶体内，且经由胆汁及尿道排出降解产物（Bremner等人，1987年）。
[0007] 基于金属硫蛋白的重金属结合、生理金属离子滴定、自由基不活化作用、抗氧化剂 以及氧化还原电位平衡的分子功能，最近金属硫蛋白与一连串医学疾病已被连结。在癌症 情况下，在例如肝癌细胞、结肠癌细胞、乳突性甲状腺癌细胞或前列腺癌细胞中，恢复金属 硫蛋白因病理性静默的表达，已在体外及体内被证实可以阻止癌细胞的生长与转移的潜能 (亦即，迀移、黏附、浸润），以诱导其细胞凋亡以及减少肿瘤质量及体积（Mao等人，2012年； Yan等人，2012年；Fu等人，2013年；Arriaga等人，2014年；Han等人，2013年）。分子机制 包含细胞内游离锌含量的平衡，其亦已被证明可造成癌细胞对化疗更加敏感（Arriaga等 人，2014 年）。
[0008] 中枢神经系统（central nervous system, CNS)中的慢性氧化压力被广泛地认为 是与年龄相关的神经退化性疾病如帕金森氏症（Parkinson's Disease, PD)与阿滋海默症 (Alzheimer's Disease，AD)的潜在原因（Eibl等人，2010年）。特别是，因为其化学性质， 神经传递物质多巴胺（dopamine，DA)具有高度反应性，且其细胞内外的游离程度必须被严 格调控（Eibl等人，2010年）。氧化多巴胺（oxDA)制品具有神经毒性，且已被证实与各种 细胞受质共价结合，因此阻碍其生物学上的功能。在各种受影响的蛋白质中，例如parkin 蛋白，其基因亦与遗传性家族性帕金森氏症有尚度的关联。经由氧化多巴胺（oxDA)制品进 行的Parkin蛋白的芳基化作用降低了 Parkin蛋白的溶解度，并且损害其酵素活性（LaVoie 等人，2005年）。经由氧化多巴胺（oxDA)物种进行的多巴胺运输蛋白（其自突触间隙清 除游离多巴胺）的类似的芳基化作用，已被证实可不活化该运输蛋白。在该突触间隙中残 留的多巴胺会自动氧化，造成该问题进一步的恶化（Whitehead等人，2001年；Miyazaki等 人，2008年）。金属硫蛋白已被证实作为氧化多巴胺（oxDA)物种的直接受质，因而帮助 不活化及清除该具有神经毒性的氧化多巴胺（oxDA) (Maret，2006年；Gauthier等人，2008 年）。在锌结合的金属硫蛋白的芳基化作用后，锌离子自金属硫蛋白中释放出来，且已知锌 不但可直接活化抗氧化剂铜-锌-过氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, S0D)，亦可活 化过氧化物歧化酶与过氧化氢酶基因的转录作用（Fattman等人，2003年）。金属硫蛋白以 这种方式进一步活化细胞防御对抗由氧化多巴胺（oxDA)调节的氧化压力（Eibl等人，2010 年）。帕金森氏症的其他病理特征包含a-突触核蛋白（a-Synuclein, a-Syn)的突变及 寡聚化。在帕金森氏症小鼠模式中已证实，人工活化金属硫蛋白可以阻断a-突触核蛋白 (a-Syn)的寡聚化，且可以去除有害的a-突触核蛋白（a-Syn)寡聚体的氧化还原活性 (Meloni等人，2011年）。过度活化表达金属硫蛋白的小鼠在许多不同的帕金森氏症模式情 境下，则可抵抗帕金森氏症的发生（Sharma等人，2013年；Ebadi等人，2005年）。
[0009] 阿滋海默症的病理特征包含由铜调节的各种淀粉样-0蛋白（amyloid-beta protein, 0-AP)异构物的聚集、在这些0-AP斑块中具有神经毒性的游离锌含量的胞外 累积，以及促氧化与具有神经毒性的铁离子在神经元内的累积。所有这些有害的氧化还原 电位相关的特征可被金属硫蛋白所抑制。例如，在小鼠阿滋海默模式中，施用与锌结合的 MT2蛋白已被证实经由锌、铜离子交换而抑制-AP异构物的聚集（Chung等人，2010年）。 在一个锌离子与铜离子交换的类似机制中，Meloni等人已证实与锌离子结合的MT3蛋白 (Zn 2+-MT3)可以在阿滋海默小鼠中去除活性氧物质（R0S)的产生以及P-AP斑块所造成的 神经毒性（Meloni等人，2008年）。
[0010] 慢性的不良生活方式以及营养不良所引起的氧化压力也被确认为各种代谢失调 的潜在原因（Chimienti, 2013)。对抗氧化压力的内在保护机制的持续超载会导致新的脂肪 储存细胞（脂肪细胞）的分化与发展，以及脂质在这些脂肪细胞中的累积。在白色脂肪组 织内脂质含量的增加会进一步导致氧化压力程度的增加（Chimienti，2013年）。以金属硫 蛋白作为抗氧化剂被认为可以透过缓冲氧化压力的程度以及提高抗氧剂保护的机制来打 破这个自我扩增的周期（Chimienti，2013年；Sato等人，2010年；Higashimoto等人，2013 年）。MT1及MT2蛋白已被证实在活体内可保护小鼠对抗高脂肪饮食所诱导的高脂血症及 肥胖症（Sato等人，2010年），以及对抗高脂肪饮食所诱导的氧化及内质网（endoplasmatic reticulum, ER)压力所造成的氧化DNA损伤（Higashimoto等人，2013年）。此外，金属硫蛋 白可预防糖尿病肾病变与心肌病变，这两者皆为基于高氧化及内质网压力而由糖尿病所引 起的疾病（Tachibana 等人，2014 年；Guo 等人，2009 年；Ruttkay-Nedecky 等人，2013 年）。 亦有强而有力的证据显示，与锌结合的金属硫蛋白可通过在胰小岛0细胞内精细地平衡 细胞内游离锌浓度，而协助稳定糖尿病患者异常的胰岛素浓度，并使之正常化（Chimienti， 2013 年）。
[0011] 参考文献
[0012] Cadenas E. , and Davies K. J. A. (2000). Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radic. Biol. Med. 29:222 - 230.
[0013] Swindell, ff. R. (2011). Metallothionein and the Biology of Aging. Ageing Res. Rev. 10(1) : 132-45.
[0014] Chimienti, F. (2013).Zinc, pancreatic islet function and diabetes:new insights into an old story. Nutrition Research Reviews 26:1-11.
[0015] Furukawa, S. , et al. (2004). Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J. Clin. Invest. 114:1752-61.
[0016] Ozcan, U. , et al. (2004) . Endoplasmatic reticulum stress links obesity,insulin action, and type 2diabetes. Science 306:457-61.
[0017] Miyazaki, I. , and Asanuma, M. (2008). Dopaminergic neuron-specific oxidative stress ca