一种氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球及其制备方法和应用与流程

本发明涉及分子识别、磁性分离、纳米材料和食品分析等技术领域，具体涉及一种氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球及其制备方法和应用。

背景技术：

绿原酸(chlorogenicacid，cga)是一种在多种膳食植物和药用植物中发现的多酚化合物，具有抗氧化活性、抗炎作用、抗菌性、降血糖、降血脂、抗肿瘤作用和抗高血压作用。

cga易溶于水，通常有一些相似官能团的化合物与之共存，如咖啡酸、没食子酸等等。因此，在量化cga之前，首先需要从复杂基质中选择性提取cga。

目前，检测复杂基质中绿原酸常用的方法主要有色谱法(包括气相色谱法(gc)、高效液相色谱法(hplc))、质谱法(ms)和联用技术(gc-ms、hplc-ms)等。这些方法均存在样品前处理过程复杂、需要时间长、选择性差等缺点。

分子印迹技术(molecularlyimprintedtechnique，mit)最早由wulff和sarhan在1972年提出，现已成为一项有吸引力的技术，用以构建具有与模板分子在大小、形状和化学功能完全互补的特异性位点的分子印迹聚合物(molecularlyimprintedpolymers，mips)。mips具有预定性、成本低、制备简单、机械和化学稳定性高、适用于恶劣环境、选择特异性高等优点。由于其突出的优点，mips已经广泛应用于色谱、生物传感器、药物输送、固相萃取(spe)等领域。在这些应用中，聚合物作为固相萃取吸附剂，在从各种复杂基质中对目标分析物选择性提取或去除中，有很大的应用前景。

之前报道的cga分子印迹聚合物大都是在有机介质中制备的，可能导致聚合物识别能力差、在水基质中非特异性吸附高。因此，发展简便和有效的制备亲水性cga分子印迹聚合物的方法，对实现复杂基质中绿原酸的高效富集、有效检测、快速去除等具有重要的研究意义。

超支化聚合物是一类具有三维球状立体结构的高度无规多级支化聚合物，其独特的三维分子结构使其具有低粘度、高反应活性和良好的相溶性等优良性能，同时大量的末端基可以进一步功能化。超支化聚合物的概念是1988年由杜邦公司kim和webster第一次提出，此后便很快成为高分子科学界研究的热点。超支化聚合物的合成有abx的单体缩聚、ab^*单体的自缩合、乙烯基聚合以及abx单体的多支化开环聚合等多种方法，合成步骤简单且无需多步复杂的分离提纯。对超支化聚合物的功能化研究近年来逐渐扩展到纳米材料、电致发光材料、药物缓释剂、传感材料等新型功能材料的应用方面。

磁性分离是依据物质的磁性差异，在磁场作用力的驱动下，把磁性组分从非磁性组分混合物中分离出来的一种分离技术。传统上，mips必须装入固相萃取柱或在进行固相萃取时采用离心和过滤。过程费时、复杂，且通常提取效率较低。磁性fe3o4纳米粒子(nps)具有生物相容性良好、磁化率高、毒性低等特点。以nps为载体制备的分子印迹聚合物作为固相萃取吸附剂除具有一般纳米材料比表面积大、吸附速率快等优点，还具有较低的矫顽力和超顺磁性，可以将之直接分散在溶液中选择性富集目标物，利用磁场快速分离后即可完成萃取。

目前，还没有关于利用磁性纳米球及超支化聚合反应制备能够快速高选择性地分离富集复杂基质中绿原酸的绿原酸分子印迹聚合物的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球及其制备方法和应用，该方法以磁性纳米球为载体，并对载体进行了超支化，采用固定模板法分子印迹技术制得了氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球，该方法制得的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球能快速高选择性地分离富集复杂基质中的绿原酸。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将ag氯化铁、bg乙酸钠、cg己二胺和dml乙二醇置于反应釜中，在180～210℃下反应7～9h，反应结束后，将反应产物洗涤、干燥，即得到氨基磁性纳米球；其中a:b:c:d＝(0.8～1.2):(3.4～4.8):(4.5～6.5):(20～30)；

步骤二：将emg步骤一制得的氨基磁性纳米球、fml无水乙醇和gml丙烯酸甲酯置于反应容器中，常温下反应5～7h，再加入hml乙二胺-乙醇溶液，在40～60℃下搅拌反应3～6h，反应结束后，将反应产物洗涤、干燥，即得到氨基超支化修饰的磁性纳米球；其中e:f:g:h＝(100～500):(20～30):(5～20):(15～25)；

步骤三：将ig步骤二制得的氨基超支化修饰的磁性纳米球、jmg盐酸多巴胺和kmg绿原酸加入到mmltris-hcl缓冲液中，室温下聚合反应6～8h，生成固态聚合物；其中i:j:k:m＝(0.1～0.2):(45～65):(20～30):(20～30)；

步骤四：待步骤三中的聚合反应结束后，通过外加磁场将反应液中生成的固态聚合物分离出来；再对分离出的固态聚合物进行洗脱、干燥，即得到氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球。

所述步骤一和步骤二中用超纯水将反应产物洗涤至中性，然后在40～50℃及0.05～0.09mpa的压力下真空干燥4～7h。

所述步骤二中的乙二胺-乙醇溶液是由体积比为1:(1～3)的乙二胺和无水乙醇混合配制而成。

所述步骤三中的tris-hcl缓冲液的ph值为7～8.5。

所述步骤四中使用的洗脱液是体积比为(92～99):(8～1)的无水乙醇与乙酸的混合溶液。

所述步骤四中的干燥温度为40～50℃，干燥时间为4～7h。

所述的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球的制备方法制得的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球，所述氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球对绿原酸的吸附量为5.98～6.27mg/g。

所述氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球的粒径为20～25nm。

所述的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球在对基质中绿原酸的富集、检测、分离及去除方面的应用。

所述的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球在吸附绿原酸方面的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球的制备方法，先用水热法合成氨基磁性纳米球；然后将氨基磁性纳米球与丙烯酸甲酯加入到乙醇中，常温搅拌后，再加入乙二胺加热搅拌，得到氨基超支化修饰的磁性纳米球；再将氨基超支化修饰的磁性纳米球、绿原酸加入到乙醇中，得到模板-载体的复合物；再加入盐酸多巴胺进行聚合，得到固态聚合物；最后通过外加磁场将固态聚合物分离出来，将固态聚合物洗脱、干燥后，即得到氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球。本发明制备方法简单、条件温和，采用磁性纳米球作为载体，既可实现在外加磁场下固液的快速分离，又可保证载体的良好分散性，同时对载体磁性纳米球进行了氨基超支化，增加了其表面氨基活性基团的数目。并且本发明以盐酸多巴胺为功能单体和交联剂，可与模板分子充分作用，且反应简单易于操作；采用固定模板法分子印迹技术，使所得固态聚合物既对特定的模板分子有专一的选择性，又具有良好的水溶性。

本发明制得的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球粒径均一、稳定性强、水溶性好，对绿原酸的吸附能力强、吸附量大，可简便、高效、快速地实现对复杂基质中绿原酸的高选择性去除、分离和富集，在对基质，尤其是复杂基质中绿原酸的富集、检测、分离及去除等方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1步骤一合成的氨基磁性纳米球的透射电镜图。

图2为本发明实施例1制得的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球的透射电镜图。

具体实施方式

下面结合附图及本发明较优的实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

步骤一、将0.98g氯化铁、3.46g乙酸钠、6.03g己二胺和30ml乙二醇置于反应釜中，200℃反应9h，反应结束后，将反应产物用超纯水洗至中性，在45℃、0.06mpa下真空干燥4h，即得到氨基磁性纳米球。如图1所示，制得的氨基磁性纳米球的粒径约为20nm。

步骤二、取100mg步骤一制得的氨基磁性纳米球，再将30ml无水乙醇，5ml丙烯酸甲酯一起置于三口瓶中，常温下反应5h，再加入20ml乙二胺-乙醇溶液，50℃下搅拌反应3h，反应结束后，将反应产物用超纯水洗至中性，在45℃、0.06mpa下真空干燥4h，即得氨基超支化修饰的磁性纳米球；其中乙二胺-乙醇溶液是由体积比为1:1的乙二胺和无水乙醇混合配制而成；

步骤三、将0.1g步骤二制得的氨基超支化修饰的磁性纳米球、45mg功能单体盐酸多巴胺(本功能单体还能起到交联剂的作用)和20mg绿原酸加入到30mlph值为8.5的tris-hcl缓冲液中，室温下聚合反应8h，生成固态聚合物；

步骤四、聚合反应结束后，通过外加磁场将步骤三反应液中生成的固态聚合物分离出来；

步骤五、用体积比为92:8的无水乙醇与乙酸的混合液洗脱步骤四中分离出的固态聚合物，再在45℃下干燥4h，即得氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球。如图2所示，制得的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球的粒径约为22nm。

将实施例1制得的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球进行吸附性能检测，具体如下：

(1)将氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球10mg加入到10ml浓度为35μg/ml的cga的水溶液中，室温下震荡10min后，通过外加磁场将上清液分离出来；

(2)用高效液相色谱测定(1)中所得上清液中cga的浓度，再计算出氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球对cga的吸附量；

所测得的上清液中cga的浓度为28.86μg/ml；

所述的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球对cga的吸附量的计算公式为：

式中ce为上述上清液中cga的浓度；

通过计算，氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球对cga的吸附量为：6.14mg/g。

实施例2

步骤一、将1.05g氯化铁，3.98g乙酸钠、5.14g己二胺和25ml乙二醇置于反应釜中，180℃反应8h，反应结束后，将反应产物用超纯水洗至中性，在40℃、0.07mpa下真空干燥5h，即得氨基磁性纳米球。

步骤二、取200mg步骤一制得的氨基磁性纳米球，再将25ml无水乙醇，15ml丙烯酸甲酯一起置于三口瓶中，常温下反应5h。再加入18ml乙二胺-乙醇溶液，60℃下搅拌反应4h，反应结束后，将反应产物用超纯水洗至中性，在40℃、0.07mpa下真空干燥5h，即得氨基超支化修饰的磁性纳米球；其中乙二胺-乙醇溶液是由体积比为1:1.5的乙二胺和无水乙醇混合配制而成；

步骤三、将0.15g步骤二制得的氨基超支化修饰的磁性纳米球、50mg功能单体盐酸多巴胺(本功能单体还能起到交联剂的作用)和20mg绿原酸加入到25mlph值为7.5的tris-hcl缓冲液中，室温下聚合反应7h，生成固态聚合物；

步骤四、聚合反应结束后，通过外加磁场将步骤三反应液中生成的固态聚合物分离出来；

步骤五、洗脱步骤四中分离出的固态聚合物，再在40℃下干燥5h，即得氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球。其中洗脱液是体积比为93:7的无水乙醇与乙酸的混合液。

将实施例2制得的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球进行吸附性能检测，具体如下：

(1)将氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球10mg加入到10ml浓度为35μg/ml的cga的水溶液中，室温下震荡10min后，通过外加磁场将上清液分离出来；

(2)用高效液相色谱测定(1)中所得上清液中cga的浓度，再计算出氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球对cga的吸附量；

所测得的上清液中cga的浓度为28.77μg/ml；

通过计算，氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球对cga的吸附量为：6.23mg/g。

实施例3

步骤一、将1.15g氯化铁，4.06g乙酸钠、5.29g己二胺和28ml乙二醇置于反应釜中，190℃反应8h，反应结束后，将反应产物用超纯水洗至中性，在48℃、0.06mpa下真空干燥6h，即得氨基磁性纳米球。

步骤二、取250mg步骤一制得的氨基磁性纳米球，再将28ml无水乙醇，18ml丙烯酸甲酯一起置于三口瓶中，常温下反应6.5h。再加入22ml乙二胺-乙醇溶液，48℃下搅拌反应5.6h，反应结束后，将反应产物用超纯水洗至中性，在48℃、0.06mpa下真空干燥6h，即得氨基超支化修饰的磁性纳米球。其中乙二胺-乙醇溶液是由体积比为1:2的乙二胺和无水乙醇混合配制而成；

步骤三、将0.13g步骤二制得的氨基超支化修饰的磁性纳米球、60mg功能单体盐酸多巴胺(本功能单体还能起到交联剂的作用)和20mg绿原酸加入到26mlph值为8.0的tris-hcl缓冲液中，室温下聚合反应7.4h，生成固态聚合物；

步骤四、聚合反应结束后，通过外加磁场将步骤三反应液中生成的固态聚合物分离出来；

步骤五、洗脱步骤四中分离出的固态聚合物，再在48℃下干燥6h，即得氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球。其中洗脱液是体积比为94:6的无水乙醇与乙酸的混合液。

将实施例3制得的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球进行吸附性能检测，具体如下：

(1)将氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球10mg加入到10ml浓度为35μg/ml的cga的水溶液中，室温下震荡10min后，通过外加磁场将上清液分离出来；

(2)用高效液相色谱测定(1)中所得上清液中cga的浓度，再计算出氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球对cga的吸附量；

所测得的上清液中cga的浓度为28.73μg/ml；

通过计算，氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球对cga的吸附量为：6.27mg/g。

实施例4

步骤一、将0.85g氯化铁，4.52g乙酸钠、4.86g己二胺和24ml乙二醇置于反应釜中，195℃反应7.8h，反应结束后，将反应产物用超纯水洗至中性，在46℃、0.08mpa下真空干燥4.5h，即得氨基磁性纳米球。

步骤二、取350mg步骤一制得的氨基磁性纳米球，再将27ml无水乙醇，5ml丙烯酸甲酯一起置于三口瓶中，常温下反应5.5h。再加入20ml乙二胺-乙醇溶液，55℃下搅拌反应5.8h，反应结束后，将反应产物用超纯水洗至中性，在46℃、0.08mpa下真空干燥4.5h，即得氨基超支化修饰的磁性纳米球；其中乙二胺-乙醇溶液是由体积比为1:3的乙二胺和无水乙醇混合配制而成；

步骤三、将0.16g步骤二制得的氨基超支化修饰的磁性纳米球、65mg功能单体盐酸多巴胺(本功能单体还能起到交联剂的作用)和20mg绿原酸加入到30mlph值为8.0的tris-hcl缓冲液中，室温下聚合反应6.9h，生成固态聚合物；

步骤四、聚合反应结束后，通过外加磁场将步骤三反应液中生成的固态聚合物分离出来；

步骤五、洗脱步骤四中分离出的固态聚合物，再在46℃下干燥4.5h，即得氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球。其中洗脱液是体积比为95:5的无水乙醇与乙酸的混合液。

将实施例4制得的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球进行吸附性能检测，具体如下：

(1)将氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球10mg加入到10ml浓度为35μg/ml的cga的水溶液中，室温下震荡10min后，通过外加磁场将上清液分离出来；

(2)用高效液相色谱测定(1)中所得上清液中cga的浓度，再计算出氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球对cga的吸附量；

所测得的上清液中cga的浓度为28.87μg/ml；

通过计算，氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球对cga的吸附量为：6.13mg/g。

实施例5

步骤一、将0.8g氯化铁，3.4g乙酸钠、4.5g己二胺和20ml乙二醇置于反应釜中，205℃反应7h，反应结束后，将反应产物用超纯水洗至中性，在40℃、0.05mpa下真空干燥4h，即得氨基磁性纳米球。

步骤二、取400mg步骤一制得的氨基磁性纳米球，再将20ml无水乙醇，10ml丙烯酸甲酯一起置于三口瓶中，常温下反应6h。再加入15ml乙二胺-乙醇溶液，40℃下搅拌反应5h，反应结束后，将反应产物用超纯水洗至中性，在40℃、0.05mpa下真空干燥4h，即得氨基超支化修饰的磁性纳米球。其中乙二胺-乙醇溶液是由体积比为1:1.8的乙二胺和无水乙醇混合配制而成；

步骤三、将0.12g步骤二制得的氨基超支化修饰的磁性纳米球、55mg功能单体盐酸多巴胺(本功能单体还能起到交联剂的作用)和25mg绿原酸加入到20mlph值为7.0的tris-hcl缓冲液中，室温下聚合反应6h，生成固态聚合物；

步骤四、聚合反应结束后，通过外加磁场将步骤三反应液中生成的固态聚合物分离出来；

步骤五、洗脱步骤四中分离出的固态聚合物，再在40℃下干燥4h，即得氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球。其中洗脱液是体积比为97:3的无水乙醇与乙酸的混合液。

将实施例5制得的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球进行吸附性能检测，具体如下：

(1)将氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球10mg加入到10ml浓度为35μg/ml的cga的水溶液中，室温下震荡10min后，通过外加磁场将上清液分离出来；

(2)用高效液相色谱测定(1)中所得上清液中cga的浓度，再计算出氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球对cga的吸附量；

所测得的上清液中cga的浓度为29.02μg/ml；

通过计算，氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球对cga的吸附量为：5.98mg/g。

实施例6

步骤一、将1.2g氯化铁，4.8g乙酸钠、6.5g己二胺和26ml乙二醇置于反应釜中，210℃反应8.5h，反应结束后，将反应产物用超纯水洗至中性，在50℃、0.09mpa下真空干燥7h，即得氨基磁性纳米球。

步骤二、取500mg步骤一制得的氨基磁性纳米球，再将23ml无水乙醇，20ml丙烯酸甲酯一起置于三口瓶中，常温下反应7h。再加入25ml乙二胺-乙醇溶液，45℃下搅拌反应6h，反应结束后，将反应产物用超纯水洗至中性，在50℃、0.09mpa下真空干燥7h，即得氨基超支化修饰的磁性纳米球。其中乙二胺-乙醇溶液是由体积比为1:2.5的乙二胺和无水乙醇混合配制而成；

步骤三、将0.2g步骤二制得的氨基超支化修饰的磁性纳米球、62mg功能单体盐酸多巴胺(本功能单体还能起到交联剂的作用)和30mg绿原酸加入到23mlph值为7.8的tris-hcl缓冲液中，室温下聚合反应6.5h，生成固态聚合物；

步骤四、聚合反应结束后，通过外加磁场将步骤三反应液中生成的固态聚合物分离出来；

步骤五、洗脱步骤四中分离出的固态聚合物，再在50℃下干燥7h，即得氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球。其中洗脱液是体积比为99:1的无水乙醇与乙酸的混合液。

将实施例6制得的氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球进行吸附性能检测，具体如下：

(1)将氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球10mg加入到10ml浓度为35μg/ml的cga的水溶液中，室温下震荡10min后，通过外加磁场将上清液分离出来；

(2)用高效液相色谱测定(1)中所得上清液中cga的浓度，再计算出氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球对cga的吸附量；

所测得的上清液中cga的浓度为28.93μg/ml；

通过计算，氨基超支化的绿原酸分子印迹磁性纳米球对cga的吸附量为：6.07mg/g。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。