专利名称：一种从金银花中同时制备绿原酸和木犀草苷的方法
技术领域：
本发明属于生化物品制备领域，涉及一种从金银花中同时制备绿原酸和木犀草苷 的方法。
背景技术：
金银花(Chinese honey suckle,/7Zo^ Lonicerae)为忍冬 ^QCapri foliaceae)忍 冬属(Xcmicera )植物忍冬ilonicera. japonica Thunb.)的干燥花蕾，为常用中药，具有清 热解毒、凉风散热、抗病毒、保肝利胆的功能，是一种药食同源的绿色天然产物。金银花主要成分为有机酸类、黄酮类、挥发油、三萜苷类、环烯醚萜苷类、神经酰胺 类化合物等。其中，绿原酸是一种极性有机酸，易溶于水、乙醇、丙酮、甲醇等极性溶剂中，木 犀草苷是黄酮苷类化合物，溶于水、甲醇、乙醇中。绿原酸和木犀草苷具有显著的生理活性绿原酸对消化系统、血液系统和生殖系 统疾病均有治疗作用，其明显的抗菌作用有利于急性咽喉炎症及皮肤病的治疗(张鞍灵等， 中草药，2001，32 (2) :173 174)；此外绿原酸还具有止血，增强白血球及抗病毒作用，能缩 短血凝及出血时间(Jaclyn M L等，Mol Cell Biochem, 2001，226 :89—95)。木犀草苷也 具有一定的的药理活性，已有研究表明木犀草素及其苷具有抗诱变、抗肿瘤、抗感染、抗过 敏等药理活性，并被认为是羟基的自由基清除剂及蛋白激酶C的抑制剂，木犀草苷(木犀草 素-7-0-β -D-葡萄糖苷)具有明显的抗氧化损伤的能力，修复心肌细胞损伤(Cimanga等， Journal of Ethnopharmacology 2006，107(1) :83_90)。最近研究表明，木犀草素通过诱导 细胞凋亡抑制恶性肿瘤细胞(Ko WG等，Phytother Res, 2002,16 295 - 298)，并且木犀草 苷比木犀草素对K562细胞增殖表现出更强的抑制作用(韩宁宁等，上海师范大学学报(自 然科学版)，2008，(6) :622 626)，它对MT-4细胞系具有中等强度的细胞毒作用(应景艳 等，药学学报，2008，(4) :335 342)。由于这类物质具有很广泛的生物活性，所以在科学研 究和临床上的需求量很大。现阶段，有关金银花中绿原酸提取研究很多。关于如何从金银花中同时提取主要 成分绿原酸和木犀草苷的报道几乎没有，这在很大程度上制约了这种传统药物的进一步发展。林缎嫦等人(中成药，1994，16 (7) :2 4)采用70%乙醇从金银花中提取了绿原酸， 绿原酸得率为6. 1%。孙志勇等人(中医中药，2004，25(6) :57 58)采用乙醇热回流法从金 银花中提取绿原酸，正交实验研究表明，各因素的影响大小依次为提取次数>提取时间> 料液比 > 乙醇浓度。白海波等人(中国现代应用药学杂志，2003，20(2) :130 132)同样采 用了正交实验法优化了乙醇热回流提取绿原酸的最佳工艺，70%乙醇、85°C、提取2次，每次 lh。如果利用传统的方法(聚酰胺前处理结合s印hadex LH_20凝胶色谱纯化方法以及 制备型高效逆流色谱(HSCCC)方法)从金银花中对绿原酸进行分离纯化，虽然可以得到纯度 较高的绿原酸，但是这类方法往往存在着分离步骤繁琐、工艺复杂、设备成本过高等不足，
3因此，该方法很难用于工业化生产中。同时，有关木犀草苷的制备研究尚未见研究报道，木 犀草苷为黄酮苷类化合物，分离制备黄酮苷类化合物的常用方法一般为碱提酸沉，而金银 花中木犀草苷的含量一般在0. 1%左右，显然不适宜用常规的碱提酸沉法。所以，研究设计出一种能够简单的大量分离纯化绿原酸和木犀草苷的工艺，是十 分重要的，可以有效的利用植物资源，为开发与利用这两种有着良好生物活性的天然产物 提供更好的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从金银花中同时制备绿原酸和木犀草苷的方法，该方 法工艺简单，所得化合物纯度较高。为了实现上述任务，本发明的通过以下技术方案得以实现
一种从金银花中同时制备绿原酸和木犀草苷的方法，其特征在于，依次按以下步骤进
行
(1)将金银花风干粉碎；在4(T60°C下用质量分数为559Γ70%的乙醇加热提取3次，每 次30min ；合并提取液，过滤，减压回收乙醇，得到含有绿原酸和木犀草苷的浸膏；
(2)用pH=6的弱酸性水溶解浸膏，过滤，滤液用DlOl型大孔树脂纯化；依次用去离子 水、pH=6的质量分数10%-20%的乙醇和pH=6的质量分数30%_40%的乙醇洗脱，减压浓缩质 量分数10%-20%和质量分数30%-40%的乙醇相的浸膏，分别得到含绿原酸和木犀草苷的浸 膏；
(3)将质量分数10%乙醇相和质量分数20%乙醇相的浸膏同硅胶混合制备成干样，将 干样填充到200-300目的硅胶色谱柱上端，分别用乙酸乙酯、乙酸乙酯甲酸水=20:1:0. 1 的混合溶剂、乙酸乙酯甲酸水=10:1:0. 1的混合溶剂洗脱，将绿原酸含量在70%以上的 馏分集中起来，浓缩后用乙酸乙酯_甲醇重结晶，得纯度大于98%的绿原酸；
(4)将质量分数30%乙醇相和质量分数40%乙醇相的浸膏同聚酰胺拌样，旋转蒸发仪蒸 干，研磨至均勻的细粉，将干样填充到80-100目的聚酰胺色谱柱上端，分别用氯仿、氯仿 甲醇=40:1-20:1的混合溶剂、氯仿甲醇=15:1的混合溶剂、氯仿甲醇=10:1-5:1的混合 溶剂、甲醇洗脱，将木犀草苷含量在60%以上的馏分集中起来，浓缩后得到淡黄色粉末，用 质量分数95%的乙醇重结晶，得纯度大于98%的木犀草苷。本发明的方法工艺简单，可得到较高纯度的绿原酸和木犀草苷；该工艺过程中所 用的树脂、溶剂和洗脱剂均可以重复使用，工艺成本很低，适合工业化生产。
图1是本发明的方法路线图2是纯化后绿原酸的高效液相色谱图； 图3是纯化后木犀草苷的高效液相色谱下面结合附图及发明人给出的实施例对本发明作进一步详细的描述。
具体实施例方式本发明是以金银花为原料，经乙醇加热浸提提取，然后依次利用大孔树脂柱层析法、硅胶柱层析法、聚酰胺柱层析和重结晶法得到较高纯度的绿原酸和木犀草苷。其操作步骤如下
a、将金银花风干粉碎；在4(T60°C下用质量分数为559Γ70%的乙醇加热提取3次，每次 30min ；合并提取液，过滤，减压回收乙醇，得到含有绿原酸和木犀草苷的浸膏。b、用pH=6的弱酸性水溶解浸膏，过滤，滤液用DlOl型大孔树脂吸附。其中大孔 树脂柱的最佳吸附条件为上样量为生药/大孔=(Γ1. 5) g · g_l，上样液浓度为生药的 0. Γ0. 5g · mL—1，上样液pH为4，上样速度为2 4倍柱体积/小时，吸附时间8 12小时；。C、洗脱前用5 15倍吸附材料的去离子水淋洗吸附柱，直到流出液为无色即可。d、用pH=6、质量分数为10%_20%的乙醇洗脱，洗脱剂用量分别为吸附材料的4、 倍。收集洗脱液，合并浓缩后得到含有大量绿原酸的浸膏。e、用pH=6、质量分数为30%_40%的乙醇洗脱，洗脱剂用量为吸附材料的7 10倍。
收集洗脱液，合并浓缩后得到含有大量木犀草苷的浸膏。f、将含绿原酸的提取物通过硅胶柱层析进行分离，洗脱剂选用乙酸乙酯-甲 酸-水混合溶剂。分别用乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲酸-水混合溶剂(乙酸乙酯甲酸水 =20:1:0. 1)、乙酸乙酯-甲酸-水混合溶剂(乙酸乙酯甲酸水=10:1:0. 1)洗脱；将绿原 酸含量在70%以上的馏分集中起来，浓缩后用乙酸乙酯-甲醇重结晶，得纯度大于98%的绿 原酸。g、将含木犀草苷的提取物通过聚酰胺柱层析进行分离，洗脱剂选用氯仿_甲醇系 统。即分别用氯仿、氯仿甲醇=40:1-20:1的混合溶剂、氯仿甲醇=15:1的混合溶剂、氯 仿甲醇=10 1-5 1的混合溶剂、甲醇洗脱，将木犀草苷含量在60%以上的馏分集中起来，浓 缩后得到淡黄色粉末，用95%的乙醇重结晶，得纯度大于98%的木犀草苷。本实施例所用的乙醇、氯仿、甲醇、乙酸乙酯、甲酸均为分析纯，乙腈和磷酸为HPLC 级，水为HPLC级和去离子水。各部分产品的分析测定均采用美国AgilentllOO型高效液相色谱仪，色谱柱为 UltimateC18色谱柱(250mmX4. 6 mm，5 μ m)，柱温30°C，绿原酸流动相为甲醇(A)和1%的 乙酸水溶液(B)，30 70 (V/V)，木犀草苷流动相为甲醇(A)和1%的乙酸水溶液(B)，42.5 57. 5 (V/V)，流速1. OmL ^irT1,检测器为可变波长扫描紫外检测器(VWD)，检测波长分别为 327nm、350nm，进样量为 10 μ L。以下是发明人给出的实施例，这些实施例是较优的例子，本发明不限于这些实施 例。实施例1
取金银花干粉500g，加入质量分数为60%的乙醇10L，超声提取3次，每次30min，合并 提取液，提取液过滤后去除滤渣，将滤液浓缩至棕红色粘稠状浸膏；用PH=6的去离子水溶 解浸膏3次，过滤，滤液以3倍柱体积/小时的流速通过DlOl型大孔树脂柱，吸附10h，用去 离子水以4倍柱体积/小时的流速洗脱3h，再分别用pH=6的质量分数为10%的乙醇、质量 分数为的20%乙醇以2倍柱体积/小时的流速洗脱3h，接着用pH=6的质量分数为30%的乙 醇、质量分数为40%乙醇以2倍柱体积/小时的流速洗脱4h，最后用质量分数为95%的乙醇 以5倍柱体积/小时的流速洗脱4h。将质量分数10%的乙醇和质量分数20%的乙醇洗脱液合并浓缩至干，得到82. 93g浸膏，其中绿原酸的含量为28. 5%，取该浸膏26. OOg用甲醇溶解后加入31. 28g硅胶制成 干样，将干样置于硅胶柱上端，分别用乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲酸-水(20:1 0. 1)、乙酸乙 酯-甲酸-水(10 1 0. 1)、甲醇洗脱，每流分IOOmL,所得流分经薄层检测，并结合显色剂显 色，将相同流分合并，将绿原酸的含量大于70%的馏分收集到一起，浓缩后得到7. 42g粉末 状结晶，用乙酸乙酯_甲醇重结晶后得到6. 07g纯度大于98%的绿原酸。将质量分数为30%的乙醇和质量分数40%的乙醇洗脱液合并浓缩至干，得到 48. 07g浸膏，其中木犀草苷的含量为1. 28%，取该浸膏20. OOg,将其用聚酰胺拌样，旋转 蒸发仪蒸干，研磨至均勻的细粉备用。取IOOml聚酰胺粉(80-100目)用氯仿装柱，分 别用氯仿、氯仿甲醇=40:1-20:1的混合溶剂、氯仿甲醇=15:1的混合溶剂、氯仿甲醇 =10:1-5:1的混合溶剂、甲醇洗脱，将木犀草苷含量在60%以上的馏分集中起来，浓缩后得 到淡黄色粉末256mg，用95%的乙醇重结晶，得纯度大于98%的木犀草苷129mg。实施例2
取金银花干粉500g，加入质量分数为70%的乙醇15L，超声提取3次，每次30min，合并 提取液，提取液过滤后去除滤渣，将滤液浓缩至棕红色粘稠状浸膏，用pH=6的去离子水溶 解浸膏3次，过滤，滤液以3倍柱体积/小时的流速通过DlOl型大孔树脂柱，吸附9h，用去 离子水以4倍柱体积/小时的流速洗脱2. 5h，再分别用pH=6的质量分数为10%的乙醇和 质量分数为20%的乙醇以3倍柱体积/小时的流速洗脱3h，接着用pH=6的质量分数为30% 的乙醇和质量分数为40%的乙醇以2. 5倍柱体积/小时的流速洗脱4h，最后用质量分数为 95%的乙醇以5倍柱体积/小时的流速洗脱4h。将质量分数10%的乙醇洗脱液和质量分数20%的乙醇洗脱液合并浓缩至干，得到 80. 58g浸膏，其中绿原酸的含量为27. 2%，取该浸膏26. OOg用甲醇溶解后加入31. 28g硅胶 制成干样，将干样置于硅胶柱上端，分别用乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲酸-水(20 1 0. 1)、乙 酸乙酯-甲酸-水(10:1 0. 1)、甲醇洗脱，每流分IOOmL,所得流分经薄层检测，并结合显色 剂显色，将相同流分合并，将绿原酸的含量大于70%的馏分收集到一起，浓缩后得到7. 07g 粉末状结晶，用乙酸乙酯_甲醇重结晶后得到5. 78g纯度大于98%的绿原酸。将质量分数30%的乙醇洗脱液和质量分数40%的乙醇洗脱液合并浓缩至干，得 到46. 23g浸膏，其中木犀草苷的含量为1. 22%，取该浸膏20. OOg,将其用聚酰胺拌样，旋 转蒸发仪蒸干，研磨至均勻的细粉备用。取IOOml聚酰胺粉(80-100目)用氯仿装柱，分 别用氯仿、氯仿甲醇=40:1-20:1的混合溶剂、氯仿甲醇=15:1的混合溶剂、氯仿甲醇 =10:1-5:1的混合溶剂、甲醇洗脱，将木犀草苷含量在60%以上的馏分集中起来，浓缩后得 到淡黄色粉末244mg，用质量分数95%的乙醇重结晶，得纯度大于98%的木犀草苷115mg。实施例3
参照附图1，取金银花干粉800g，加入质量分数为65%的乙醇12L，超声提取3次，每次 30min，合并提取液，提取液过滤后去除滤渣，将滤液浓缩至棕红色粘稠状浸膏，用pH=6的 去离子水溶解浸膏3次，过滤，滤液以3倍柱体积/小时的流速通过DlOl型大孔树脂柱，吸 附llh，用去离子水以4倍柱体积/小时的流速洗脱3h，再分别用pH=6的质量分数为10% 的乙醇和质量分数为20%的乙醇以3倍柱体积/小时的流速洗脱4h，接着用pH=6的质量分 数为30%的乙醇和质量分数为40%乙醇以3倍柱体积/小时的流速洗脱3h，最后用质量分 数为95%的乙醇以5倍柱体积/小时的流速洗脱4h。
将质量分数10%的乙醇洗脱液和质量分数20%的乙醇洗脱液合并浓缩至干，得到 130. 66g浸膏，其中绿原酸的含量为28. 9%，取该浸膏30. OOg用甲醇溶解后加入35g硅胶制 成干样，将干样置于硅胶柱上端，分别用乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲酸-水(20 1 0. 1)、乙酸 乙酯-甲酸-水(10 1 0. 1)、甲醇洗脱，每流分IOOmL,所得流分经薄层检测，并结合显色剂 显色，将相同流分合并，将绿原酸的含量大于70%的馏分收集到一起，浓缩后得到8. 67g粉 末状结晶，用乙酸乙酯_甲醇重结晶后得到7. 02g纯度大于98%的绿原酸。将质量分数30%乙醇洗脱液和质量分数40%的乙醇洗脱液合并浓缩至干，得到 75. 12g浸膏，其中木犀草苷的含量为1. 31%，取该浸膏40. OOg,将其用聚酰胺拌样，旋转 蒸发仪蒸干，研磨至均勻的细粉备用。取200ml聚酰胺粉(80-100目)用氯仿装柱，分 别用氯仿、氯仿甲醇=40:1-20:1的混合溶剂、氯仿甲醇=15:1的混合溶剂、氯仿甲醇 =10:1-5:1的混合溶剂、甲醇洗脱，将木犀草苷含量在60%以上的馏分集中起来，浓缩后得 到淡黄色粉末524mg，用质量分数95%的乙醇重结晶，得纯度大于98%的木犀草苷261mg。上述实施例中，纯化后绿原酸、纯化后木犀草苷的高效液相色谱图参见图2和图 3。
权利要求
一种从金银花中同时制备绿原酸和木犀草苷的方法，其特征在于，依次按以下步骤进行(1)将金银花风干粉碎；在40~60℃下用质量分数为55%~70%的乙醇加热提取3次，每次30min；合并提取液，过滤，减压回收乙醇，得到含有绿原酸和木犀草苷的浸膏；(2)用pH=6的弱酸性水溶解浸膏，过滤，滤液用D101型大孔树脂纯化；依次用去离子水、pH=6的质量分数为10%的乙醇、质量分数为20%的乙醇，以及pH=6的质量分数30%的乙醇、质量分数为40%的乙醇洗脱，减压浓缩质量分数10%乙醇相和质量分数20%乙醇相的浸膏，以及质量分数30%乙醇相和质量分数40%的乙醇相的浸膏，分别得到含绿原酸和木犀草苷的浸膏；(3)将10%乙醇相和质量分数20%乙醇相的浸膏同硅胶混合制备成干样，将干样填充到200 300目的硅胶色谱柱上端，分别用乙酸乙酯、乙酸乙酯甲酸水=20:1:0.1的混合溶剂、乙酸乙酯甲酸水=10:1:0.1的混合溶剂洗脱，将绿原酸含量在70%以上的馏分集中起来，浓缩后用乙酸乙酯 甲醇重结晶，得纯度大于98%的绿原酸；(4)将质量分数30%乙醇相和质量分数40%的乙醇相的浸膏同聚酰胺拌样，旋转蒸发仪蒸干，研磨至均匀的细粉，将干样填充到80 100目的聚酰胺色谱柱上端，分别用氯仿、氯仿甲醇=40:1 20:1的混合溶剂、氯仿甲醇=15:1的混合溶剂、氯仿甲醇=10:1 5:1的混合溶剂、甲醇洗脱，将木犀草苷含量在60%以上的馏分集中起来，浓缩后得到淡黄色粉末，用质量分数95%的乙醇重结晶，得纯度大于98%的木犀草苷。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)滤液的上样量为生药/大孔 =(Γ1. 5)g.g-l,上样液浓度为生药的0. Γ0. 5g .mL-1,上样液pH为4，上样速度为2、倍 柱体积/小时，吸附时间纩12小时；质量分数10%乙醇洗脱液和质量分数20%的乙醇洗脱 液的PH值均为6，洗脱速度为2、倍柱体积/小时，洗脱柱体积分别为4、倍柱体积；质量 分数30%乙醇洗脱液和质量分数40%乙醇洗脱液的pH值均为6，洗脱速度为2、倍柱体积 /小时，洗脱柱体积分别为7 10倍柱体积。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的pH=6的质量分数10%乙醇用量和质 量分数20%的乙醇用量分别为吸附材料的4、倍。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的pH=6质量分数为30%乙醇用量和质 量分数为40%的乙醇用量分别为吸附材料的7 10倍。
全文摘要
本发明公开了一种从金银花中同时制备绿原酸和木犀草苷的方法，其包括乙醇提取、D101型大孔树脂富集、硅胶柱、聚酰胺柱分离纯化和重结晶等步骤。本发明的方法是通过热乙醇溶剂浸提法提取金银花中绿原酸和木犀草苷、通过调节大孔树脂所用洗脱液的浓度和pH值，达到富集、分离绿原酸和木犀草苷的目的，最后分别经过硅胶柱层析和聚酰胺柱层析以及重结晶的方法得到纯度大于95%的绿原酸和木犀草苷。
文档编号C07C67/56GK101985421SQ20101051893
公开日2011年3月16日 申请日期2010年10月26日 优先权日2010年10月26日
发明者吴进, 张树军, 张继文, 李娜, 王俊儒, 高鹏 申请人:西北农林科技大学