绿原酸在制备通过P53、PI3K-Akt和MAPK通路预防和治疗肺母细胞瘤药物中的用图
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及绿原酸在制备治疗肺母细胞瘤的药物中的用途，具体涉及绿原酸制备 通过P53、PI3K-Akt和MPK通路预防和治疗肺母细胞瘤的药物中的用途，属于药物领域。
【背景技术】
[0002] 绿原酸（Chlorogenic acid, CGA)，又名咖啡单宁酸，化学名为3-0-咖啡酰奎尼酸 (3-〇_cafTeoylquinic acid)，是由咖啡酸（Caffeic acid)与奎尼酸（Quinic acid)组成 的羧酚酸。
[0003] 绿原酸是植物体有氧呼吸代谢的产物，是许多中药材以及水果蔬菜中的主要有效 成分，具有多种生物活性，如：心血管保护作用、抗氧化作用、抗紫外及抗辐射作用、抗诱变 及抗癌作用、抗菌作用、抗病毒作用、降脂降糖作用、免疫调节作用等。在医药化工和食品等 领域都具有广泛的应用。
[0004] 肺母细胞瘤是一种罕见肺部原发恶性肿瘤，分为成人型肺母细胞瘤和儿童胸膜肺 母细胞瘤。肺母细胞瘤的临床症状及影像学检查无特异性，容易误诊，术前诊断困难，术后 病理需结合形态学和免疫组化综合考虑。本病首选手术治疗，手术方式以肺叶切除加纵隔 淋巴结清扫术为主。预后与病理类型、分期及肿瘤部位等有关，总体预后差。
[0005] 目前，临床上用于治疗肺母细胞瘤的唯一手段是手术。本病主张以手术为主的综 合治疗，手术方案与肺癌相似，以肺叶或者全肺切除配合纵隔、肺门淋巴结清扫，术后辅助 化疗，放疗的疗效不确切，主张术后放疗者甚少。该病对化疗不敏感，目前应用何种化疗药 物以及何种化疗方案还没有定论。
【发明内容】
[0006] 针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种绿原酸的新用途。
[0007] 本发明的上述目的是通过如下技术方案实现的：一种绿原酸在制备预防和治疗肺 母细胞瘤的药物中的应用。
[0008] 在本发明中，绿原酸能够抑制肿瘤血管的生成，从而治疗肺母细胞瘤和控制肺母 细胞瘤的转移。绿原酸是通过P53、PI3K-Akt和MPK通路达到预防和治疗肺母细胞瘤的 目的。具体而言，绿原酸是激活P53通路，促进肿瘤细胞的凋亡而达到治疗肺母细胞瘤的目 的。此外，绿原酸是作为PI3K和AKT的靶点抑制剂，抑制PI3K-Akt活性，具体是抑制肿瘤 血管的生成，从而治疗肺母细胞瘤和控制肺母细胞瘤的转移。此外，绿原酸作为MPK激酶 激酶的靶点抑制剂，抑制MPK激酶激酶活性，从而抑制MPK激酶活性，从而再抑制MPK活 性，具体是抑制肿瘤血管内皮细胞和肿瘤血管的生成，从而治疗肺母细胞瘤和控制肺母细 胞瘤的转移。
[0009]P53是一个肿瘤抑制蛋白，在避免肿瘤的发生和发展中起着重要的作用，例如，月中 瘤细胞的凋亡和抑制肿瘤新血管的生成等。P53蛋白能抑制细胞生殖周期停留于G1A的节 律点上，达成DNA修复的辨识，以启动DNA的修复；若DNA不可修复，则P53启动细胞凋亡程 序，避免肿瘤细胞的继续分裂生长。突变后的P53蛋白将可能丧失与DNA形成有效结合的 能力，以发出停止细胞分裂的信号。因此，受损细胞将不受控制的进行细胞分裂，最终形成 导致肿瘤的发生发展。
[0010] 发明人研宄发现，绿原酸作用于细胞内p53信号通路中的P53蛋白的靶基因上， 激活其靶基因，表达P53蛋白，使其具有生物活性以抑制肿瘤的发生发展，起到抗肿瘤的作 用。PI3K-Akt信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一，通过影响下游多种效应分子的 活化状态，在体内发挥着促进细胞增殖和抑制凋亡的关键作用，它与多种肿瘤的发生和发 展密切相关，绿原酸作用于PI3K_Akt信号通路中的关键点pllOa亚基和pAkt或者作用于 这些靶点的靶基因，使这些靶点失去原有的活性或者使这些靶点蛋白的表达受到抑制，从 而抑制肿瘤的发生发展、促进肿瘤细胞的凋亡和抑制肿瘤细胞的浸袭和转移。丝裂原活化 蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)级联是细胞内广泛存在的丝/苏氨 酸蛋白激酶超家族，是将细胞质的信号传递至细胞核并引起细胞核发生变化的重要物质， MAPK可分为4个亚族：ERK、p38、JNK和ERK5。p38MAPK和ERK的激活，使细胞发生形态学 改变，由立方形转变为长梭形，并伴随着E-cadherin下调，促进细胞生长、迀移及侵袭。JNK 在细胞周期、生产、凋亡和细胞应激等多种生理和病理过程中起重要作用。绿原酸作用于 MAPK信号通路中的ERK和p38MAPK，抑制ERK和p38MAPK的活，从而抑制肿瘤细胞的生物、 迀移和侵袭。绿原酸作用于JNK，激活JNK信号通路，促进肿瘤细胞的凋亡。
[0011] 本发明中，作为优选，所述的药物是由绿原酸为有效成分，加入药学上可接受的辅 料或辅助性成分制备而成的制剂。
[0012] 本发明的另一目的在于，提供一种治疗肺母细胞瘤的制剂，所述制剂包含绿原酸 和药物上可接受的赋形剂或辅料。所述辅料或赋形剂包括但不限于甘露醇、亚硫酸氢钠、淀 粉、糊精粉、无水乙醇、注射用水、糖粉、乳糖、轻丙甲纤维素、硬脂酸镁、鹿糖、聚维酮K30。
[0013] 具体而言，本发明所述的制剂是口服制剂或注射制剂。
[0014] 其中，所述的制剂每单位制剂含绿原酸1-lOOOmg，临床使用剂量为：l-100mg/kg。
[0015] 本发明的有益效果在于提供一种可以用于治疗肺母细胞瘤的绿原酸和药学上可 接受的赋形剂或辅料组成的制剂。所述药物对肺母细胞瘤有较为明显的治疗效果且预后性 较好。
【附图说明】
[0016] 图1为绿原酸抑制肺母细胞瘤细胞增生的效果图。
[0017] 图2为绿原酸诱导肺母细胞瘤细胞凋亡的示意图。
[0018] 图3为蛋白印迹实验检测caspase 3蛋白表达示意图。
[0019] 图4为不同剂量浓度下细胞周期状态检测示意图。
[0020] 图5为p53蛋白15位丝氨酸磷酸化示意图。
[0021] 图6为绿原酸（20mg/ml)诱导肺母细胞瘤细胞凋亡示意图。
[0022] 图7为PI3K-Akt通路关键蛋白在肺母细胞瘤细胞和正常细胞中的表达（Western Blot结果）。
[0023] 图8为绿原酸对肺母细胞瘤细胞增殖能力影响的量效关系（p〈0. 05)。
[0024] 图9为绿原酸对肺母细胞瘤细胞周期的影响示意图。
[0025] 图10为绿原酸对肺母细胞瘤细胞周期的影响示意图。
[0026] 图11为肺母细胞瘤细胞受绿原酸影响的流式细胞仪凋亡图谱。
[0027] 图12为绿原酸对肺母细胞瘤细胞pAkt表达的影响示意图。
[0028] 图13为绿原酸对肺母细胞瘤细胞pAkt表达的影响示意图。
[0029] 图14为MTT检测绿原酸对肺母细胞瘤细胞增殖的影响示意图。
[0030] 图15为细胞数法检测绿原对肺母细胞瘤细胞增殖的影响示意图。
[0031] 图16为绿原酸（20mg/ml)对肺母细胞瘤细胞凋亡的影响示意图。
[0032] 图17为绿原酸（20mg/ml)对肺母细胞瘤细胞中MPK信号通路的影响示意图。
[0033] 图18为绿原酸通过MAPK信号通路影响肺母细胞瘤细胞的凋亡示意图。
【具体实施方式】
[0034] 实施例1绿原酸激活P53实施例 P53肿瘤抑癌基因是一个转录因子，在调控细胞死亡和各种细胞程序中起关键作用。P53参与调控的细胞事件包括细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤修复以及衰老等。实验显示 绿原酸能够诱导肺母细胞瘤细胞凋亡。pifithrin-a是一种特异性p53蛋白抑制剂，用 pifithrin-a处理肺母细胞瘤细胞后，流式细胞实验显示肺母细胞瘤细胞凋亡完全被抑 制。
[0035] (1)细胞凋亡实验 用FITC-AnnexinV流式细胞实验（BD公司凋亡检测试剂盒）检测肺母细胞瘤细胞凋 亡。
[0036] a.收集细胞待细胞培养瓶中细胞达到60-80%汇合度时，向细胞培养瓶中加入 2mlEDTA-胰酶，显微镜下观察待90 %细胞脱离瓶壁时加入5ml全培养吹打终止消化收集 细胞，200g离心IOmins得到细胞沉淀。加入5ml培养基重悬液，显微镜下计数细胞。
[0037] b.种板将肺母细胞瘤细胞IxlO6个接种于IOOmm细胞培养皿。将细胞培养皿置于 5%CO2，37°C培养箱中培养24小时。
[0038] c?细胞贴壁后，第二日用20mg/ml绿原酸、100yMpifithrin-a处理细胞；对照 组用DMSO处理细胞。将细胞培养皿置于5 %CO2，37 °C细胞培养箱中培养30mins到24小 时。
[0039] d.流式细胞实验第三日用EDTA-胰酶消化收集细胞，200g离心lOmins，细胞用 PBS液洗2次；用IxBinding缓冲液重悬制成IxIO6AiI细胞悬液；将100yL细胞悬液转移 至5ml流式管中，加入5yLAnnexinV及5yLPropidiumiodide(PI)，混勾并室温避光孵 育15mins;向各流式管中加入4005yLIxBinding缓冲液，涡旋震荡后上流式细胞仪进行 检测。
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