一种负载型血红蛋白组合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物组合物领域，尤其涉及一种负载型血红蛋白组合物及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 输血在外科医学和战伤救治中具有举足轻重的作用，随着人类生活的多样化和复 杂化，血液的供给来源和安全性问题越来越成为经济社会民生问题的重要内容。由于血液 代用品具有"通用性好、安全性高、保质期长"的优点，使得血液代用品的研发始终具有重 要意义而备受关注。其中，基于血红蛋白的氧载体（hemoglobin-basedoxygencarriers， HBOCs)是血液代用品领域的研宄热点，分为化学修饰的血红蛋白、血红蛋白和各种酶体的 偶联物以及类细胞结构负载血红蛋白三类。其中类细胞结构负载血红蛋白可以避免血红蛋 白直接与周围组织及血液其他成分直接作用，防止血管收缩、避免肾毒性、提高体内循环时 间。该品种根据材料不同可分为脂质体负载血红蛋白和高分子材料负载血红蛋白。脂质体 负载血红蛋白过程中会发生脂质体过氧化，还原酶系统不能穿过脂质体膜，使得血红蛋白 易氧化。与脂质体相比，生物可降解的高分子材料在负载血红蛋白中具有以下几种优势：机 械强度高，制备过程易于控制粒子大小以及颗粒厚度，体内循环时间和稳定性更强，并且其 设计的灵活性和智能化更易连接更长的PEG链。
[0003] 生物可降解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(D,L-lactide-co-glycolid)， PLGA]是由丙交酯（LA)和乙交酯（GA)两种单体聚合而成的高分子共聚物，是目前大量应 用于载药控释系统的合成高分子生物降解材料，其降解机制为在体内水解脱脂生成乳酸单 体，并在乳酸脱氢酶作用下生成丙酮酸，作为能量代谢物质之一参与体内三羧酸循环。PLGA 具有良好的生物相容性，没有明显的炎性反应、免疫反应和细胞毒性反应。PLGA已被美国 FDA批准正式作为药用辅料进了美国药典，近年来也用于缓释药物载体以及其他人体植入 的装置材料。以PLGA为载体制成的纳米粒具有缓释性，可减少给药次数和药量，增强器官 靶向作用及药效，因此得到广泛的应用。聚乙二醇（PEG)亲水性好、减少蛋白质附着，覆盖 在纳米粒子表面，可以减少单核吞细胞系统（mononuclearphagocytesystem，MPS)中巨 噬细胞吞噬，延长体内的循环时间。
[0004] Chang等在1997年曾用PLA、PLGA和聚氰基丙烯酸异丁酯 (polyisobutycyanoacrylate)混合物作为一种包材包裹血红蛋白，粒径分布从70nm到 1110nm，但其安全性和有效性未见报道。
[0005]CN1419936A公开了一种血红蛋白微胶囊血液代用品及其制备方法，该发明通过双 乳化法制备的微胶囊含有一种或多种聚乳酸单甲氧基聚乙二醇共聚物和血红蛋白，制备方 法工艺简单，容易放大，而且耗时短，但是此发明制备得到的血红蛋白微胶囊的粒径为几个 微米，粒径较大，容易被单核吞噬细胞系统中巨噬细胞吞噬，在体内的循环时间较短。
[0006] CN102861322A公开了一种血红蛋白类携氧载体及其制备方法，该血红蛋白类携氧 载体包含血红蛋白、结合珠蛋白和聚乙二醇一聚酯纳米粒，血红蛋白通过结合珠蛋白连接 在聚乙二醇一聚酯纳米粒表面，本发明血红蛋白类携氧载体对细胞无明显毒性，输注后血 浆中无明显游离血红蛋白，无高血压反应，可克服传统血红蛋白类携氧载体副作用强的缺 陷，具有良好的应用前景和经济效益。然而此发明在制备该血红蛋白类携氧载体时，需要对 聚合物材料进行化学修饰，并通过结合珠蛋白将血红蛋白结合至聚乙二醇一聚酯纳米粒表 面，工艺比较复杂。
[0007] 因此，本领域期望利用较简单的方法开发一种具有较小粒径、并可保护血红蛋白 不被破坏的安全有效的血红蛋白氧载体。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种负载型血红蛋白组合物及其制 备方法。
[0009] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] -方面，本发明提供一种负载型血红蛋白组合物的制备方法，所述方法包括以下 步骤：
[0011] (1)将载体聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物溶于有机溶剂，再将其与血红 蛋白的水溶液混合、超声，形成初乳；
[0012] (2)向步骤⑴所得初乳中加入表面活性剂的水溶液，混合、超声，形成复乳；
[0013] (3)除去有机溶剂，离心，得到负载型血红蛋白组合物。
[0014] 在本发明所述负载型血红蛋白组合物的制备方法中，步骤（1)所述载体聚乙二 醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物（PEG-PLGA)的结构式如下：
【主权项】
1. 一种负载型血红蛋白组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 将载体聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物溶于有机溶剂，再将其与血红蛋白 的水溶液混合、超声，形成初乳； (2) 向步骤⑴所得初乳中加入表面活性剂的水溶液，混合、超声，形成复乳； (3) 除去有机溶剂，离心，得到负载型血红蛋白组合物。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述载体聚乙二醇-聚乳酸 羟基乙酸嵌段共聚物的结构式如下：
优选地，所述聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物中聚乙二醇链段的重均分子量为 1000-5000Da，聚乳酸羟基乙酸链段的重均分子量为4500-45000Da ; 优选地，所述聚乳酸羟基乙酸链段由乳酸和羟基乙酸两种单体聚合而成，其中所述乳 酸和羟基乙酸两种单体的摩尔比为75:25或50:50。
3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述有机溶剂为乙酸乙 酯、二氯甲烷或三氯甲烷中的任意一种或至少两种的混合物。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤⑵所述表面活性剂 的水溶液为聚乙烯醇水溶液或聚乙烯醇水溶液与丙二醇嵌段聚醚水溶液的混合物。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤⑵所述表面活性剂 的水溶液为聚乙烯醇水溶液与丙二醇嵌段聚醚水溶液的混合物，所述的混合物中聚乙烯醇 水溶液和丙二醇嵌段聚醚水溶液的体积比为1:1-9:1，优选为7:3 ; 优选地，所述的聚乙烯醇水溶液和丙二醇嵌段聚醚水溶液的浓度均为2wt%。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述载体聚乙二 醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物与血红蛋白的质量比为5:4-5:12,优选为5:6。
7. 根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述血红蛋白的 水溶液浓度为60-240mg/mL，优选为120mg/mL ; 优选地，步骤（1)所述聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物浓度为10-30mg/mL，优选 为 20mg/mL ; 优选地，相对于2mL所述聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物溶液，所述表面活性剂 的水溶液用量为IOmL。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述超声利用超 声细胞破碎仪在80-lOOw下于冰水浴中进行，超声时间为3-5min ; 优选地，步骤（2)所述超声利用超声细胞破碎仪在200-250?下于冰水浴中进行，超声 时间为3_5min ; 优选地，步骤（3)所述离心转速为6, 000-13, OOOrpm，离心时间为8_15min。
9. 根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 将聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物溶于乙酸乙酯，使其浓度为20mg/mL，将 2mL聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物溶液与0. 4mL浓度为120mg/mL的血红蛋白的水 溶液混合，利用超声细胞破碎仪在80w下于冰水浴中超声3min，形成初乳； (2) 向步骤（1)所得初乳中加入IOmL表面活性剂的水溶液，混合，利用超声细胞破碎仪 250w下于冰水浴中超声5min，形成复乳； (3) 除去乙酸乙酯，以13, OOOrpm转速离心10min，得到负载型血红蛋白组合物； 其中所述表面活性剂的水溶液为聚乙烯醇水溶液和丙二醇嵌段聚醚水溶液的混合物， 所述的聚乙烯醇水溶液和丙二醇嵌段聚醚水溶液的体积比为7:3,所述的聚乙烯醇水溶液 和丙二醇嵌段聚醚水溶液的浓度均为2wt%。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的制备方法制备得到的负载型血红蛋白组合物。
【专利摘要】本发明涉及一种负载型血红蛋白组合物及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)将载体聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物溶于有机溶剂，再将其与血红蛋白的水溶液混合、超声，形成初乳；(2)向步骤(1)所得初乳中加入表面活性剂的水溶液，混合、超声，形成复乳；(3)除去有机溶剂，离心，得到负载型血红蛋白组合物。本发明采用双乳法制备负载型血红蛋白组合物，方法简单易行，制备得到的负载型血红蛋白组合物具备携放氧功能，与全血有近似的流变特性，稳定性高，具备良好的血液相容性，不会引起红细胞聚集；本发明的载体材料不仅原料丰富，而且具有低成本，可生物降解，良好生物相容性和生物亲和性、无毒、易于化学改性等优点。
【IPC分类】A61K38-42, A61P7-08, A61K47-34, A61K9-51
【公开号】CN104644614
【申请号】CN201510069797
【发明人】吴雁, 赵彩艳, 邵磊厚
【申请人】国家纳米科学中心
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月10日