专利名称：一种工业化提取纯化兔肝锌金属硫蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及金属硫蛋白的提取、纯化方法，具体的说涉及兔肝金属硫蛋白的提取、纯化方法背景技术1957年Margoshes和Vallee在研究金属生物学作用时，从动物器官分离出一种新的蛋白质，它含有丰富的巯基，能螯合大量的金属离子，此物质称为金属硫蛋白(英文为Metallothionein，简称MT)。人体、动物、植物以及微生物体内均含MT，而且其理化特性基本一致。MT分子呈椭圆形，分子量为6500道尔顿，直径30-50A，分两个结构域，每个分子含7-12个金属原子，具有特殊的光吸收。MT构象较坚固，具有较强的耐热性。典型的哺乳动物MT分子量约为6500道尔顿，不含金属的MT则约为6000道尔顿。它在生物进化上是极保守的，通常由61个氨基酸组成；其中有20个Cys(半胱氨酸)，且不含芳香族氨基酸及组氨酸。MT的三级结构呈哑铃形，由相互独立又相互协调作用的呈球形的α结构域和β结构域组成，α结构域含有11个Cys残基，可结合4-6个二价金属离子；β结构域含有9个Cys残基，可结合3-6个二价金属离子。国际上已经召开了五次MT的国际会议，并且第五次国际MT会议是去年在北京召开的，这说明了国内对MT的研究又出现了一个新的高潮，随着人们对MT的深入研究，其用途也日益广泛，那么对MT的需求量也是越来越大，虽然有很多有关大规模提取MT的方法的报道，但从结果上来看都不理想，因此有必要提供一种大规模、高提取、低成本的提取金属硫蛋白的生产工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种可提高Zn-MT的得率，提取成本低，分离纯度高，生产制备工艺简单，方便的工业化提取纯化兔肝锌金属硫蛋白的方法。
本发明的目的是通过下述方式实现的本发明的制备包括诱导，粗提，层析纯化；诱导为选用健康的成年兔，采用锌剂量逐渐递增的溶液进行腹部皮下注射透导5-7次，每次剂量以每千克兔体重注射锌量为10-250mg范围内逐渐递增。
所述粗提为将新鲜兔肝捣碎后放入提取罐-1中，加入匀浆液搅拌匀浆，再加入变性液搅拌后，冷冻离心取上清液-1放入提取罐-2中，并迅速给提取罐-2加热，到70℃～80℃保持2-5分钟，迅速冷却到室温，再次冷冻离心，得上清液-2；所述层析纯化为将上清液-2通过超滤膜浓缩，得浓缩液离心后的上清液-3通过凝胶介质层析，收集后冷冻干燥，得冻干粉。
用配制好的ZnSO4·7H2O溶液采用腹部皮下注射诱导，隔天注射，一共诱导7次，每次剂量以每千克兔体重(kg)注射锌(mg)量计，分别为10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg。
使用超滤膜的孔径范围，截留分子量为2000-4000道尔顿。
所述凝胶介质为Sephacrly S-100。
本发明采用锌剂量逐渐递增的溶液进行腹部皮下注射诱导，采用逐渐递增锌浓度，使家兔逐渐增强对锌的耐受性和适应性，从而保证了锌诱导的MT逐渐积累的效果。
本发明所得的肝脏，以每克鲜肝中含的金属硫蛋白计，金属硫蛋白的含量≥5mg/g。而本发明冻干所得金属硫蛋白的纯度≥60％；提取率≥45％，(以金属硫蛋白计，产出量与投料量的比值)。
本发明具有以下优点1、我们的工艺优化了诱导条件，不仅降低了家兔的死亡率，而且提高了金属硫蛋白的含量，是普通诱导方法的2-3倍，并且不影响兔肉的质量，并可提高兔肉的锌含量。
2、传统金属硫蛋白提取方法一般是采用乙醇沉淀后再溶解后上层析，而本方法没有用乙醇沉淀，直接超滤浓缩，并经过离心后的上清液直接上层析，减少了MT在有机溶剂中的损失，减少了乙醇消耗的成本，和有机溶剂排放难的问题。
3、另外，层析中我们弃用了上一代的Sephadex G-50凝胶介质，传统的G-50介质分离效果低，流速慢，层析时间长，胶粒机械强度差，耐酸碱性差，在应用新一代的Sephacryl S-100凝胶介质后，提高了分离纯度，提高了流速，缩短了层析时间，提高了使用寿命。
具体实施例方式
以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1、诱导选用健康的3kg左右成年青紫蓝家兔，用配制好的ZnSO4·7H2O溶液采用腹部皮下注射诱导，隔天注射，一共诱导7次，每次剂量分别为10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg；第十五天屠宰家兔，取肝脏。
2、粗提将取出的肝脏用生理盐水洗涤后，称量重量6000g，将兔肝绞碎后放入提取罐-1中，加入12L的0.02M(PH 8.6)Tris-HCl缓冲液，搅拌匀浆，搅拌提取30分钟，加入6L体积的乙醇∶氯仿＝1∶0.08变性液，于4℃，4000rpm，30分钟离心后弃去沉淀，取上清液，得到上清液1，将上清液1加入到提取罐-2中，使提取罐-2迅速升温至75℃，保持5min后迅速降到室温，再次于4℃，4000rpm 40分钟离心，去沉淀得上清液2，将上清液2通过超滤膜(截留分子量为2000-4000道尔顿)浓缩，浓缩所得体积为400ml，颜色棕红色。
3、层析纯化将浓缩得到的棕红色液体离心得到的上清液-3直接经过用0.01MNH4HCO3PH 8.6 0.15M NaCl平衡好的Sephacryl S-100层析柱，上样体积为柱体积的4％，然后用同一体系的缓冲液进行洗脱分离，收集巯基试剂显色部分，体积900ml。将得到的收集液经过超滤膜超滤浓缩，当浓缩液的体积达到浓缩前体积的20-30％时，在浓缩液中加入三倍于浓缩液体积的0.01mol/LNH4HCO3PH 8.6的缓冲液，再次浓缩，反复三次，得到脱盐浓缩液，体积约900ml。
4、脱盐浓缩液经冷冻干燥得成品16g。
权利要求
1.一种工业化提取纯化兔肝锌金属硫蛋白的方法，包括诱导，粗提，层析纯化；诱导为选用健康的成年兔，采用锌剂量逐渐递增的溶液进行腹部皮下注射透导5-7次，每次剂量以每千克免注射锌量为10-250mg范围内逐渐递增；所述粗提为将新鲜兔肝加入匀浆液搅拌匀浆，再加入变性液搅拌后，冷冻离心取上清液-1，并迅速加热，到70℃～80℃保持2-5分钟，迅速冷却到室温，再次冷冻离心，得上清液-2；所述层析纯化为将上清液-2通过超滤膜浓缩，得浓缩液离心后的上清液-3通过凝胶介质层析，收集液经脱盐后冷冻干燥，得冻干粉。
2.根据权利要求1的一种工业化提取纯化兔肝锌金属硫蛋白的方法，用配好的ZnSO4·7H2O溶液采用腹部皮下注射诱导，隔天注射，一共诱导7次，每次剂量以每于克兔体重注射锌量计，分别为10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg。
3.根据权利要求1的一种工业化提取纯化兔肝锌金属硫蛋白的方法，超滤膜的孔径范围，截留分子量为2000-4000道尔顿。
4.根据权利要求1的一种工业化提取纯化兔肝锌金属硫蛋白的方法，所述凝胶介质为Sephacrly S-100。
全文摘要
一种工业化提取纯化兔肝锌金属硫蛋白的方法，包括诱导，粗提，层析纯化；将成年兔进行腹部皮下注射透导5－7次，每次剂量以每千克兔注射锌量为10－250mg范围内递增；将兔肝用匀浆液搅拌匀浆，再加入变性液搅拌，冷冻离心取上清液－1，迅速加热，迅速冷却到室温，再次冷冻离心，得到上清液－2通过超滤膜浓缩，离心后的上清液－3通过凝胶介质层析，收集液经脱盐后冷冻干燥。本发明是提供一种可提高Zn－MT的得率，提取成本低，分离纯度高，生产制备工艺简单，方便的工业化提取纯化兔肝锌金属硫蛋白的方法。
文档编号C07K1/34GK101085814SQ20061003179
公开日2007年12月12日 申请日期2006年6月9日 优先权日2006年6月9日
发明者江冠群, 蒋腊才, 王少波, 曹醴承 申请人:湖南麓谷生物技术有限公司