专利名称：硫酯酶及其用途的制作方法
技术领域：
公开了编码硫酯酶的核苷酸序列、产生它们的方法、它们在形成硫酯的方法中的用途。背景对于干酪、蔬菜、肉和咖啡产品等而言，硫酯是重要调味化合物。特别有用的硫酯包括但不限于硫代丁酸甲酯(下文称作“MTB”)、硫代乙酸甲酯(下文称作“MTA”)和硫代丙酸甲酯(下文称作“MTP”)。可以合成地产生硫酯。然而，因为食品趋势和健康顾虑及福祉顾虑，对于从天然产物直接获得或通过生物学过程产的调味化合物(如硫酯)存在特殊需要。这类化合物的一个特殊优点是，可以将它们称作“天然”的并且可能在消费产品上这样标注。已知多种细菌在发酵期间产生硫酯。然而，这些现有过程的产量和产物比率难以影响。因此，将有益的是，开发更可预测和可能在经济上更有可行性的产生硫酯的方法，所述硫酯可能用于消费产品中并且标注为“天然的”。详述申请人:现在已经鉴定编码硫酯酶的核苷酸序列。这项研究结果使这些核苷酸序列能够用于以下方法中，其中所述方法能够高效地产生可以添加至消费产品并标记为“天然”的硫酯。另外，这些核苷酸序列可以用于鉴定能够形成硫酯的其他野生型细菌的筛选方法中。根据第一个说明性实施方案，提供了编码具有硫酯酶活性的酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物。不限于并且仅以说明的方式，这些核酸可以从属于短杆菌属(Brevibacterium)家族的细菌分离。根据某些实施方案，这些核酸可以从属于扩展短杆菌(Brevibacteriumlinens)物种的细菌分离，一个非限制性实例是美国典型培养物保藏中心(下文称作ATCC)菌株 9174 (BL2)。核苷酸序列的功能等同物包括这些核苷酸序列，其因遗传密码的简并性而拥有与本文中公开的那些核苷酸序列不同的核苷酸序列，但是编码具有相同活性的相同氨基酸序列。功能等同物包括本文所述序列的天然存在变体以及合成核苷酸序列，例如，通过化学合成或天然存在的DNA重组所获得的那些核苷酸序列。功能等同物可以是天然或合成性置换、添加、缺失、替换或插入一个或多个核苷酸的结果。功能等同物的实例包括这些核酸序列，它们包含因不导致多肽活性的改变并因此可以在功能上视为中性的至少一个保守氨基酸置换而产生的有义突变。提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。例如，选择保守性置换的一个示例性指导包括(原始残基跟随示例性置换):ala/gly或ser ；arg/lys ；asn/gln或his ;asp/glu ；cys/ser ；gln/asn ；gly/asp ；gly/ala 或 pro ；his/asn 或 gin ；ile/leu 或val ；leu/ile 或 val ；lys/arg 或 gin 或 glu ；met/leu 或 tyr 或 ile ；phe/met 或 leu 或 tyr ；ser/thr ；thr/ser ；trp/tyr ;tyr/trp 或 phe ;val/ile 或 leu。替代的示例性指导使用以下6个组，每个组含有彼此互为保守性置换的氨基酸:1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸⑴；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、赖氨酸(I)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。另一个的示例性指导是允许全部带电荷的氨基酸彼此作为保守性置换，无论它们是否带正电荷或带负电荷。在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比(例如至多到26%、至多到20%、至多到10%或至多到5%)的氨基酸的单个置换、缺失或添加还视为功能等同物。功能等同物的其他非限制性的实例包括片段、直向同源物、剪接变体、单核苷酸多态性和等位变体。这类功能等同物将与本文中公开的核苷酸序列具有60%、75%、80%、90%、95%或更大的同源性。核苷酸序列同源性可以通过序列同一性或通过杂交确定。序列同一性可以使用基本局部比对搜索工具技术(下文称作BLAST)确定。BLAST技术是由可在http://www.ncb1.nlm.nih.gov获得的程序blastn使用的启发式检索算法。如果通过杂交确定同源性，则应当将这些核苷酸序列视为基本上同源的，前提是它们能够选择性地杂交至本文中公开的核苷酸序列。杂交应当在严格杂交条件下在42° C的温度在由50%甲酰胺、5x标准柠檬酸钠(下文称作SSC)和1%十二烷基硫酸钠(下文称作SDS)组成的溶液中实施。洗涤可以在65° C在0.2xSSC和0.1%SDS的溶液中实施。背景杂交可能因为其他核苷酸序列存在于例如cDNA中而发生。小于随靶DNA所观察到的特异性相互作用的强度10倍的任何信号应当视为背景。可以测量相互作用的强度，例如，通过将探针例如用32P进行放射标记。核苷酸序列也可以包含以下项中的一个或多个:合适的5’非翻译区、能够实现在适宜的宿主细胞中表达的启动子、合适的3’非翻译区、终止密码子和标签。标签的非限制性实例包括但不限于膜输出标签和用于硫酯酶检测的标签，包括但不限于His标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签(GST)。5’非翻译区可以包含影响转录或翻译效率的其他操纵基因或基序。3’非翻译区可以包含其他信号如用于转录性终止的信号。影响转录或翻译的操纵基因或基序的非限制性实例包括但不限于使转录物高效多聚腺苷酸化所需的信号、核糖体结合位点、识别位点例如EcoRl。根据所讨论的宿主细胞和所需的结果，选择合适的5’和3’非翻译区、标签、终止密码子和影响转录或翻译的操纵基因或基序完全在本领域技术人员的能力范围内。在本文所包括的实施例中给出非限制性实例。在SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物可以用来产生包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物的硫酯酶。可以通过充分建立的克隆技术实现具有硫酯酶活性的酶的表达，其中所述酶包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物中的一个或多个。
根据另一个说明性实施方案，提供了用SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物中的一个或多个转染的宿主细胞。这类宿主细胞能够表达具有硫酯酶活性的酶，其中所述酶包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物中的一个或多个。合适的宿主细胞包括细菌、真菌、植物或动物源的原核生物和真核细胞。根据一个说明性实施方案，细胞是细菌细胞或真菌细胞。在另一个说明性实施方案中，细胞选自以下一种或多种:大肠杆菌(Escherichiacoli)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Cornynebacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、诺卡菌属(Nocardia)、甲基杆菌属(Methylobacteri)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、魏斯氏菌属(Weisella)、肉食杆菌属(Carnobacterium)和四体球菌属(Tetragenococcus)。丙酸杆菌属物种(Proprionibacterium sp.)、双歧杆菌属某些物种(Bifidobacterium spp.)、肠球菌属某些物种(Enterococcus spp.)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、节杆菌属物种(Arthrobacter sp.)、藤黄微球菌(Micrococcus Iuteus)和马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)。白地霉(Geotrichumcandidum)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia Iipolytica)、乳酸克鲁维酵母(KluyveromycesIactis)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。如本领域熟知，宿主细胞可以用核苷酸序列或其功能等同物瞬时或稳定转染。可以使用将核苷酸序列导入宿主细胞的任何已知方法。仅需要所用的具体基因工程方法能够成功地将所需的核苷酸序列或其功能等同物导入能够表达所需的氨基酸序列或其功能等同物的宿主细胞中。这些方法可以包括将克隆的基因组DNA、cDNA、合成性DNA或其他外来遗传物质导入宿主细胞中，并且包括使用磷酸I丐转染法、polybrene (溴化己二甲胺)、原生质体融合、电穿孔、脂质体、微量注射、表达载体等。包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的至少一个核酸序列或其功能等同物的表达载体，作为独立表达载体或作为表达载体文库表达载体，均可以通过多种常规技术导入细胞的基因组、细胞的细胞质或细胞的胞核中并且在其中表达。选择合适的技术完全在本领域技术人员的能力范围内。根据一个说明性实施方案,表达载体可以用来用SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物转染宿主细胞。在本发明的另一个方面，提供了包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物的载体。可以使用任何适合的表达载体。载体类型的非限制性实例包括噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体；病毒表达载体或细菌表达载体。根据所讨论的宿主细胞和所需的结果，选择合适的表达载体完全在本领域技术人员的能力范围内。在一个说明性实施方案中，载体选自pBL、pET-22b(+)、Pgem-5z、pGIVl。在转染后，可以使用本领域熟知的标准培养条件培养转染的细胞。
技术人员将显而易见，不同的细胞需要不同的培养条件，包括适宜的温度和细胞培养基。根据所讨论的宿主细胞和所需的最终结果，决定培养条件完全在本领域技术人员的能力范围内。在另一个方面，提供了产生具有硫酯酶活性的酶的方法，所述酶包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物中的一个或多个，所述方法包括将包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物的核苷酸序列插入载体中；用所述载体转化宿主细胞并在合适的培养基中培育转化的宿主细胞。如上文所述，技术人员将显而易见，不同的细胞需要不同的培养条件，包括适宜的温度和细胞培养基。根据所讨论的宿主细胞和所需的最终结果，决定培养条件完全在本领域技术人员的能力范围内。关于某些细胞的适宜培养基和条件的信息，可以在美国典型培养物保藏中心(ATCC)网站:http: //www.lgcstandards-atcc.0rg/Home/tab id/477/Default, aspx 上找至 l|。在一个具体的说明性实施方案中，所用的细胞是短杆菌细胞、棒状杆菌细胞或大肠杆菌细胞并且培养基是基于乳制品或乳清的。在另一个具体的说明性实施方案中，所用的细胞是短杆菌细胞、棒状杆菌细胞或大肠杆菌细胞并且培养基选自胰酪胨-大豆、deMan-Rogosa-Sharpe (MRS)、Elliker' s>M17、营养培养液或LB培养基。细胞在37° C孵育过夜。为了增加硫酯酶的产量，SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物可以通过将它们置于强组成型启动子控制下进行过量表达。根据所讨论的宿主细胞和所讨论的载体，选择合适的组成型启动子完全在本领域技术人员的能力范围内。如果需要包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物的硫酯酶，则可以使用本领域熟知的方法从培养基分离。包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物中至少之一的分离的硫酯酶或包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物中至少之一的转染的宿主细胞可以用来产生硫酯。在另一个方面，提供包括一种产生硫酯的方法，包括使包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公开的至少一个氨基酸序列或其功能等同物的至少一种硫酯酶和/或包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的至少一个核苷酸序列或其功能等同物的至少一种宿主细胞与至少一种合适的底物接触，孵育所述混合物，分离含有硫酯的粗产物并且纯化所述粗产物以便仅获得硫酯。孵育可以在20°C至40°C的温度，以4至9的pH实施范围从I至100小时的时间。在一个说明性实施方案中，孵育可以在25°C至38°C的温度，以6至8的pH实施范围从I至72小时的时间。短链脂肪酸辅酶A衍生物已经由申请人发现是包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公开的至少一个氨基酸序列或其功能等同物的硫酯酶的合适底物。在一个说明性实施方案中，合适的底物包含短链脂肪酸辅酶A(SCFA-CoA)。在另一个说明性实施方案中，合适的底物包括Cl-C8SCFA_CoA。
本发明的转染的宿主细胞和/或酶可以在运动或固定的形式下使用。在一个说明性实施方案中，这种酶和/或宿主细胞以固定的形式使用。任何纯化技术可以用来纯化粗产物并且决定采用这样的技术完全在本领域技术人员的能力范围。纯化技术的非限制性实例包括:亲和纯化、离心、层析。在本发明的另一个方面，提供通过如本文所述的方法可获得或产生的硫酯。在另一个方面提供一种用于产生硫酯的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种硫酯酶和/或至少一种宿主细胞，所述硫酯酶包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公开的至少一个氨基酸序列或其功能等同物，所述宿主细胞包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的至少一个核苷酸序列或其功能等同物，和至少一种合适的底物。这种试剂盒可以用来实施如本文所公开的用于产生硫酯的方法。在一个说明性实施方案中，合适的底物包含短链脂肪酸辅酶A(SCFA-CoA)。在另一个说明性实施方案中，合适的底物包括Cl-C8SCFA_CoA。Cl-C8SCFA-CoA 底物可以按 0.01 μ Μ-500 μ Μ、0.01 μ Μ-200 μ Μ、0.01 μ Μ-50 μ M 的浓度提供。已知干酪中存在的硫酯的量和比率影响其风味。硫酯由干酪中存在的微生物在其制造和成熟期间产生。经常将这些微生物添加至干酪作为起子培养物。在另一个方面，提供一种对干酪调味的方法，其包括在干酪制造过程期间向其添加至少一种硫酯酶和/或至少一种宿主细胞，所述硫酯酶包含在序列ID编号2、4、6和8中所公开的至少一个氨基酸序列或其功能等同物，所述宿主细胞包含在序列ID编号1、3、5和7中所公开的至少一个核苷酸序列或其功能等同物。在一个说明性实施方案中，将硫酯酶和/或宿主细胞作为起子培养物的部分添加。在另一个说明性实施方案中，将硫酯酶和/或宿主细胞作为添加至乳的起子培养物的部分添加。在另一个方面，提供根据本文以上限定的方法可获得或产生的干酪产品。在SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物可以用来筛选和鉴定野生型生物，其中所述野生型生物含有编码硫酯酶的基因，所述硫酯酶由SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物编码。在另一个方面提供在SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物作为筛选方法中标记的用途，其中所述方法筛选能够产生硫酯酶的野生型生物，所述硫酯酶由SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物编码。在另一个方面提供一种鉴定能够产生硫酯酶的生物的方法，所述硫酯酶由SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物编码，所述方法包括使用SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物作为筛选方法中的标记。这种方法中鉴定的生物可以是任何原核和真核生物。在一个说明性实施方案中，生物是野生型生物。可以使用任何已知的筛选方法。熟知筛选方法的实例包括但不限于，计算机驱动的公共序列数据库的核苷酸或蛋白质同源性检索法、通过高通量测序的核苷酸筛选法和聚合酶链反应(PCR)筛选。
可以分离和纯化通过本文中公开的方法形成的硫酯用作许多组合物和消费产品中的调味化合物。在另一个方面，提供了包含通过本文中所述的方法所获得或产生的至少一种硫酯的组合物。在另一个方面提供一种产生或调节组合物的风味的方法，所述方法包括向所述组合物添加如本文中公开那样所形成的至少一种硫酯。这些硫酯可以在净形式下或在溶剂中存在或添加至组合物中，或它们可以首先例如通过用包埋材料(例如聚合物、胶囊、微胶囊、纳米胶囊、脂质体、前体、成膜物质、吸收剂)，例如通过使用碳沸石、环状寡糖及其混合物包埋加以修饰，或它们可以与适合在施加外源刺激如光、酶等时释放硫酯的基材化学地结合。一个类型的硫酯可以是组合物的单一调味组分。可选地，可以组合使用多个类型的硫酷。组合物可以额外地包含其他调味成分和赋形剂，例如香料组合物中常规使用的载体材料。所述其他调味成分包括但不限于天然香料、人工香料、香辛料、调料等。示例性调味成分包括合成香料油和调味芳香物质和/或油、油树脂(oleoresin)、精油、源自植物、叶、花、果实等的馏出液和提取物和包含前述至少一种的组合。其他调味成分的其他实施例可以在National Academy of Sciences, "ChemicalsUsed in Food Processing(食品加工中的化学品)〃，1274出版,第63-258页中找到。香料组合物中常规使用的所述赋形剂包括但不限于溶剂(包括水、醇、乙醇、油、脂肪、植物油和miglyol)、粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、增味剂、着色剂、防腐剂、抗氧化齐U、乳化剂、稳定剂、风味增进剂(flavour-enhancer)、抗结块剂等。香料组合物中常规使用的调味成分和赋形剂的其他实施例可以在“Perfume andFlavour Materials of Natural Origin (天然来源的香料和香料物质)”，S.Arctander编著，Elizabeth, N.J.，1960 ;引自 “Perfume and Flavour Chemicals (香料和香料化学品)，，，S.Arctander 编著，第 I 和第 II 卷，Allured Publishing Corporation, CarolStream, USA, 1994 ；引 自 “Flavourings (香料)”，E.Ziegler 和 H.Ziegler (编著)，Wiley-VCHWeinheim, 1998 和 “CTFA Cosmetic Ingredient Handbook (CTFA 化妆品成分手册)，，，J.Μ.Nikitakis (编著)，第 I 版，The Cosmetic, Toiletry and FragranceAssociation (美国化妆品与香料协会)，Inc., Washington, 1988.中找到。香料组合物的其他合适且合乎需要的成分在标准文件如“Handbook ofIndustrial Chemical Additives (工业化学品添加物手册)”，M.和 1.Ash,第 2版，(Synapse 2000)中描述。如本文中公开那样形成的硫酯可以在组合物中以至多到100%的浓度使用。根据某些实施方案，硫酯可以以范围约0.01%至约99%的浓度包含在组合物中。根据其他实施方案，硫酯可以以范围约1%至约99%的浓度包含在组合物中。在另一个方面，提供一种产生、增强或调节消费产品的风味的方法，所述方法包括向所述消费产品添加如本文中公开那样所形成的至少一种硫酯。如本文中公开那样形成的硫酯或含有如本文中公开那样的至少一种硫酯的组合物可以通过使用将所述硫酯或组合物直接混入消费产品的常规技术，添加至消费产品。如本文中公开那样形成的硫酯可以向消费产品添加的量可以在宽范围内变动，并且特别取决于消费产品的性质、取决于所需的效果、向消费产品添加如本文中公开那样形成的硫酯的目的，例如增强或产生味觉，并且取决于消费产品中所包含的任何其他组分(例如其他香料成分)的性质和量。根据所需的最终用途和效果，决定并入消费产品中的如本文中公开那样形成的硫酯的合适量完全在本领域技术人员的能力范围内。基于消费产品重量以重量ppm计，如本文中公开那样形成的硫酯的常见非限制性浓度是约500ppm至约0.0lppm,更具体地约250ppm至约0.0lppm,仍更具体地约IOOppm至约 Ippm。在另一个方面，提供了包含通过本文中所述的方法所获得或产生的至少一种硫酯的消费产品。如本文所用的术语“消费产品”意指意在置于口腔中并摄取或已在口中使用并随后抛弃的任何产品。合适的消费产品包括但不限于酱汁、调味品、全部类型的食品原料、糖食产品，焙烘产品、甜品、美味产品，包括调味肉和肉产品和调味蔬菜和蔬菜产品、乳产品、饮料、口腔护理产品和其组合。示例性食品原料包括但不限于冷藏点心、甜点心和开胃点心、水果点心、薯片/薯条(chips/crisp)、膨化小吃、墨西哥圆饼/玉米片、爆米花、椒盐卷饼、坚果、其他甜点心和开胃点心、点心棒、燕麦棒、早餐棒、能量棒、水果棒、其他点心棒、代餐产品、瘦身产品、康复期饮料、快餐、罐装快餐、冷冻快餐、干燥快餐、冷餐快餐、什锦正餐、冷冻匹萨、冷藏匹萨、汤、罐装汤、脱水汤、速食汤、冷藏汤、UHT汤、冷冻汤、面食、罐装面食、干燥面食、冷藏/新鲜面食、面条、素面条、方便面、杯装/碗装方便面、小袋装方便面、冷藏面条、点心面条、干燥食品、什锦甜点、酱汁、调味汁和调味品、芳草和香辛料、涂抹酱、果酱和蜜饯、蜜、巧克力涂抹酱、基于坚果的涂抹酱和基于酵母的涂抹酱。示例性糖食产品包括但不限于口香糖(其包括加糖香口胶、无糖香口胶、功能性香口胶和泡泡糖)、夹心糖、巧克力和其他巧克力糖果产品、药制糖果产品、糖锭、片剂、糖果锭剂、薄荷糖、标准薄荷糖、提神薄荷糖(power mint)、奶糖、硬质糖果、硬糖(boiledcandy)、呼吸和其他口 腔护理膜或条(breath and other oral care film or strip)、柺杖糖、棒棒糖、橡皮糖(gummy)、冻胶糖、乳脂软糖、治糖、硬芯糖球和软芯糖球(hard and softpanned good)、太妃糖、乳脂糖(taffy)、甘草糖(liquorice)、明胶糖、胶糖(gum drop)、冻胶糖豆(jelly bean)、牛轧糖、翻糖、一种或多种以上糖的组合和并入一种或多种以上糖的可食用组合物。示例性焙烘产品包括但不限于曲奇饼(alfajore)、面包、包装/工业用面包、无包装/手工面包、馅饼、蛋糕、包装蛋糕、无包装/手工蛋糕、饼干、巧克力挂涂饼干、夹心饼干、注心饼干、美味饼干和薄脆饼、面包代用品。示例性甜品包括但不限于早餐谷物食品、即食(“rte”)谷物食品、急停早餐谷物食品、薄片、muesl1、其他即食谷物食品、J L童早餐谷物食品、热谷物食品。示例性美味产品包括但不限于咸味点心(马铃薯片、炸薯片、坚果、墨西哥圆饼-烤面包(tortilla-tostada)、椒盐卷饼、干酪点心、玉米点心、马铃薯点心、即食爆米花、可微波加工的爆米花、炸猪皮、坚果、薄脆饼、薄脆饼点心、早餐谷物食品、肉、肉冻、腌肉(火腿、咸肉)、午餐肉/早餐肉(热狗、冷盘冷、香肠)、番茄产品、人造奶油、花生黄油、汤(清汤、灌装汤、奶油汤、速食汤、UHT汤)、罐装蔬菜、意大利面酱。示例性乳产品包括但不限于、冰淇淋、速食冰淇淋(impulse ice cream)、单份装乳类冰淇淋、单份装水冰淇淋、多份装乳类冰淇淋、多份装水冰淇淋、家庭装冰淇淋、家庭装乳类冰淇淋、冰淇淋甜食、大块冰淇淋、家庭装水冰淇淋、冷冻酸奶、手工冰淇淋、乳产品、乳、鲜乳/巴氏消毒乳、全脂鲜乳/巴氏消毒乳、半脱脂鲜乳/巴氏消毒乳、长货架期/UHT乳、全脂长货架期/UHT乳、半脱脂长货架期/UHT乳、无脂长货架期/UHT乳、山羊乳、炼乳/淡乳、原味炼乳/淡乳、调味、功能性和其他炼乳、调味乳饮料、仅含乳的调味乳饮料、用果汁调味的乳饮料、酸乳、酸乳饮料、发酵乳类饮料、咖啡伴侣、乳粉、调味的乳粉饮料、奶油、酸奶、原味/天然酸奶、调味酸奶、果味酸奶、益生酸奶、饮用型酸奶、标准饮料饮用型酸奶、益生性饮用型酸奶、冷藏和货架稳定的甜食、基于乳的甜食、基于大豆的甜食。示例性饮料包括但不限于调味水、软饮料、水果饮料、基于咖啡的饮料、基于茶的饮料、基于果汁的饮料(包括水果和蔬菜)、乳基饮料、凝胶饮料、碳酸饮料或非碳酸饮料、粉状饮料、酒精饮料或无酒精饮料。对于乳产品，尤其干酪调味的产品，硫酯是特别重要的调味成分。具体而言，为提供真实干酪风味伴随良好的香影响，需要硫酯MTB，优选地与MTA和/或MTP组合使用。在一个说明性实施方案中，包含至少一种如本文中公开那样形成的硫酯的消费产品是干酿调味的广品。在另一个说明性实施方案中，消费产品是干酪调味的产品，其包含如本文中公开那样形成的MTA和/或MTB和/或MTP。序列鉴定已经参考以下序列ID编号描述本发明:SEQ ID N0.1-描述编码硫酯酶425的核苷酸序列。SEQ ID N0.2_描述硫酯酶425的氨基酸序列。SEQ ID N0.3_描述编码硫酯酶3320之一的核苷酸序列。SEQ ID N0.4_描述硫酯酶3320的氨基酸序列。SEQ ID N0.5_描述编码硫酯酶1875的核苷酸序列。SEQ ID N0.6_描述硫酯酶1875的氨基酸序列。SEQ ID N0.7_描述编码硫酯酶1874的核苷酸序列。SEQ ID N0.8_描述硫酯酶1874的氨基酸序列。阐述以下实施例以进一步详细描述本发明和显示所公开的方法和产物。然而，这些实施例不应当以任何方式解释为限制性的。
实施例实施例1 -克隆硫酉旨酶基因用于蛋白质表达使用聚合酶链反应(PCR)，以基因特异性引物(表I)，通过扩增从扩展短杆菌菌株ATCC9174 获得硫酯酶(下文称作 TE)TE 0425、TE1875、TE 3320 和 TE 1874 的 DNA 序列。引物包括允许基因定向克隆于pET_22b(+)载体(Novagen)中的限制性位点，同时避开在待克隆的基因内部的位点。5’引物包括XbaI位点，后接序列AGGAGGATTAACATATG，此序列提供强力大肠杆菌核糖体结合位点和ATG起始密码子。在ATG密码子后，每条5’引物包括14-20个碱基的符合可读框的基因特异性序列，其始于编码特定蛋白质的可读框的
第二密码子的第一碱基。3’引物包括SalI或XhoI位点和与除天然终止密码子之外的特定可读框的17_23碱基3’序列相对应的基因特异性序列。pET-22b (+)载体由Novagen设计成在大肠杆菌中提供诱导型表达并通过并入已表达蛋白质中的多组氨酸结构域与镍柱的结合而纯化蛋白质。将克隆至这个载体中的基因转录设计成需要添加诱导物IPTG，并且出于本发明中所概述的目的，完全根据制造商的推荐使用pET-22b(+)载体系统。为基因表达，使用大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，其表达所用pET_22b (+)载体需要的T7RNA聚合酶。将所得到的基因特异性XbaI至SalI或XhoI片段克隆至pET_22b (+)载体，产生以下可读框， 其具有编码C端His标签结构域的符合可读框的序列和来自载体主链的终止密码子。表1.用来克隆TE基因至pET_22b(+)载体中的基因特异性引物
权利要求
1.一种编码具有硫酯酶活性的酶的核苷酸序列，其包含SEQ.1D.N0.1至4中所示序列的核苷酸或其功能等同物。
2.载体,其包含根据权利要求1所述的核苷酸序列。
3.宿主细胞,用根据权利要求2所述的载体转化。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌来源或真菌来源的。
5.产生具有硫酯酶活性的酶的方法，其包括:将根据权利要求1所述的序列插入表达载体中；用所述载体转化宿主细胞并且在合适的培养条件下培育所述转化的宿主细胞。
6.产生硫酯的方法，包括使包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公开的至少一个氨基酸序列或其功能等同物的至少一种硫酯酶和/或包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的至少一个核苷酸序列或其功能等同物的至少一种宿主细胞与至少一种合适的底物接触，孵育所述混合物，分离含有硫酯的粗产物并且纯化所述粗产物以便仅获得硫酯。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述底物包括Cl-C8SCFA-CoA。
8.用于产生硫酯的试剂盒，包括至少一种硫酯酶和/或至少一种宿主细胞，所述硫酯酶包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公开的至少一个氨基酸序列或其功能等同物，所述宿主细胞包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的至少一个核苷酸序列或其功能等同物，和至少一种合适的底物。
9.对干酪调味的方法，其包括在干酪制造过程期间向其添加至少一种硫酯酶和/或至少一种宿主细胞，所述硫酯酶包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公开的至少一个氨基酸序列或其功能等同物，所述宿主细胞包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公开的至少一个核苷酸序列或其功能等同物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述硫酯酶和/或宿主细胞作为起子培养物的部分添加。
11.调味的干酪产品或干酪调味的产品，通过根据权利要求9或10所述的方法可获得或产生。
12.SEQ.1D.N0.1至4中所示的核苷酸序列或其功能等同物中任一种的用途，作为筛选生物的方法中的标记物，所述生物能够产生由所述核苷酸序列或其功能等同物编码的硫酯。
13.组合物，其包含通过根据权利要求6、7或9中任一项所述的方法获得或产生的硫酯。
14.消费产品，其包含通过根据权利要求6、7或9中任一项所述的方法获得或产生的硫酯。
15.根据权利要求10所述的消费产品，其中所述消费产品选自干酪调味的产品或调味的干酪产品。
全文摘要
公开了编码硫酯酶的核苷酸序列、用于产生它们的方法、它们在形成硫酯的方法中的用途和它们在用于能够产生所述硫酯酶的其他野生型细菌的方法中的用途。另外，公开了包含由本文所公开方法产生的硫酯的组合物。
文档编号C12N15/00GK103153085SQ201180045593
公开日2013年6月12日 申请日期2011年9月26日 优先权日2010年9月24日
发明者T·波夫米克, J·布罗德本特, D·威尔克, J·斯蒂尔, M·布迪尼西 申请人:奇华顿股份有限公司, 犹他州大学, 威斯康星州男校友研究基金会