检测硫酸基转移酶活性的杂合型化合物及其应用的制作方法

检测硫酸基转移酶活性的杂合型化合物及其应用的制作方法
【专利摘要】检测硫酸基转移酶活性的杂合型化合物及其应用，分子通式如（I）所示：X-L-H（I）；H为激素或羟化胆固醇部分；X为能被抗体识别的小分子基团；L为能使X部分与H部分基团连接的连接部分。本发明提供一种灵敏度高、重现性好、取材方便、操作简单易行和安全性高的检测和分析方法，能够快速检测样品中的硫酸基转移酶活性。本发明提出用激素或羟化胆固醇的杂合体作为酶底物，通过免疫分析法检测被硫酸化酶底物的水平，以确定被测样品中硫酸基转移酶活性的方法。
【专利说明】检测硫酸基转移酶活性的杂合型化合物及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于硫酸基转移酶活性检测领域，具体涉及一种检测硫酸基转移酶活性的 杂合型化合物及其应用。

【背景技术】
[0002] 硫酸基转移酶（sulfotransferase，SULT)家族是一类主要负责催化硫酰基 (S03-)从供体3磷酸腺苷一 5磷酸硫酸盐（PAPS)转移到广泛存在的含有羟基（hydroxyl) 或氨基（amine)基团的化合物，从而形成硫酸盐（sulfates)或磺胺盐（sulfmates)，使底物 发生硫酸化代谢，也被称为硫酸化（Sulfation)。
[0003] 人类SULT基因家族主要有SULT1，SULT2，SULT4和SULT6,在类固醇分泌器官、肝、 血液和激素依赖型组织（激素反应性器官，如胎盘、前列腺、皮肤和乳腺等）中高表达。催 化雌激素硫酸化的主要有酚类固醇（SULT1)亚家族，包括SULT1E1，SULT1A1和SULT1B1 (如 图1A所示），其中SULTIE1编码的蛋白质与雌二醇（E2)、雌酮（E1)的亲和力最强。羟基类 固醇硫酸基转移酶（家族成员SULT2A1和SULT2B1)主要催化雄酮、孕烯醇酮、脱氢表雄酮 等羟基类固醇的硫酸化。SULT2A1可催化雌激素、甲状腺激素、外源性激素、药物的硫酸化。 此外，SULT2Blb能催化25-羟化胆固醇（25HC)硫酸化反应，主要产物为3-硫酸-25-羟化 胆固醇（25HC3S)(如图1B所示）。
[0004]目前已有的主要检测手段仅能分析SULT1E1的表达水平，并不能准确地反映硫 酸基转移酶对酶底物的硫酸化能力。（l)SULTlEl蛋白水平的检测试剂盒（人雌激素硫 酸转移酶重组蛋白的C末端融合了一个6个氨基酸的His标签，该蛋白最终由标准的色 谱技术纯化出）；（2)用SULT1E1抗体进行免疫组织染色，反映SULT1E1的表达量；（3)用 Westernblot的方法，检测SULT1E1的蛋白水平；（4)用实时定量RT-PCR的方法，检测细胞 中SULT1E1的mRNA水平。
[0005] 此外，本 申请人:已申请的检测雌激素硫酸基转移酶活性（专利申请号： 201310366700. 8)技术方案：用H3标记-雌激素（H3-E2)作为反应底物，PAPSS提供硫 酸基团，添加血浆样品作为SULT1E1的供体；反应后产生17 0 -雌二醇-3硫酸盐结合体 (H3 -E2-S)用液体闪烁计数仪进行检测标记E2的放射性浓度来分析硫酸基转移酶活性。
[0006]目前国内外检测雌激素、雄激素、甲状腺激素的技术仅限于报告总的激素水平，包 括有活性功能的激素、被代谢和降解的无功能活性激素二部分。因此迫切需要开拓一种新 技术方案能区分活性激素或无活性激素的水平。


【发明内容】

[0007] 解决的技术问题：本发明的目的在于提供一种检测硫酸基转移酶活性的杂合型化 合物及其应用，利用该化合物可以简单便捷且准确度高的检测硫酸基转移酶活性。
[0008] 技术方案：检测硫酸基转移酶（sulfotransferase，SULT)活性的杂合型化合物， 分子通式如（I)所示：X-L_H(I) ;H为激素或羟化胆固醇部分；X为能被抗体识别的小分子 基团；L为能使X部分与H部分基团连接的连接部分。
[0009]所述H为雌激素/雌酮（E2/E1)、甲状腺激素（T4/T3)、睾酮（T)、孕烯醇酮（PREG)、 脱氢表雄酮（DHEA)、外源性激素或25-羟化胆固醇（25HC)。
[0010] 所述X为磺胺类（Sulfonamides)、链霉素（Streptomycin)、氯霉素 (Chloramphenicol)、呋喃唑酮西林代谢物、呋喃它酮妥因代谢物、喹诺酮类（Quinolones)、 新霉素（Neomycin)、庆大霉素（Gentamicin)、呋喃它酮妥因代谢物、呋喃西林唑酮代谢物、 四环素类（Tetracyclines)、孔雀石绿（MalachiteGreen)、伏马毒素（FumonisinB1)、赫 曲霉毒素A(0chratoxinA)、T_2 毒素（Trichothecenes2)、玉米赤霉稀丽（Zearalenol)、 呕吐毒素（Deoxynivalenol)、黄曲霉毒素Ml(AflatoxinsMl)、黄曲霉毒素B1(Aflatoxins Bl)、泰乐菌素（Tylosin)、植物维生素C(VC)、植物钙调素（CAM)、花生凝集素（PNA)、植物维 生素B6(VB6)、双花扁豆凝集素（DBA)、植物吲哚乙酸（IAA)、植物维生素D(VD)、豌豆凝集素 (PSA)、植物凝脂酸（PA)、植物维生素D3 (VD3)、蓖麻凝集素（RCA)、植物生长激素（GH)、植物 维生素D2、扁豆凝集素（LCA)、植物血凝素（phA)、植物维生素E(VE)、植物赤霉素（GA)、植物 维生素A(VA)、植物玉米索核苷（ZR)、植物维生素B12 (VB12)、槐凝集素（SJA)、植物磷脂酰 甘油（PG)、植物激素脱落酸（ABA)或荆豆凝集素（UEA)。
[0011] 所述L是直接键、C1-C12亚烷基、C2-C12亚链烯基或C2-C12亚炔基，所述亚烷基、 亚链烯基或亚炔基的至少一个-CH2-基团任选被-0-、-5-、-502-、亚环烷基、亚芳基、亚杂脂 环基、亚杂芳基和/或-NR5-置换，以及所述亚烷基、亚链烯基或亚炔基任选被至少一个羰 基氧和/或羟基取代。
[0012] 优选为以下化合物：

【权利要求】
1. 检测硫酸基转移酶活性的杂合型化合物，其特征在于分子通式如（I)所示： X-L-H(I) H为激素或羟化胆固醇部分； X为能被抗体识别的小分子基团； L为能使X部分与H部分基团连接的连接部分。
2. 根据权利要求1所述的检测硫酸基转移酶活性的杂合型化合物，其特征在于所述H 为雌激素/雌酮、甲状腺激素、睾酮、孕烯醇酮、脱氢表雄酮、外源性激素或25-羟化胆固醇。
3. 根据权利要求1所述的检测硫酸基转移酶活性的杂合型化合物，其特征在于所述X 为磺胺类、链霉素、氯霉素、呋喃唑酮西林代谢物、呋喃它酮妥因代谢物、喹诺酮类、新霉素、 庆大霉素、呋喃它酮妥因代谢物、呋喃西林唑酮代谢物、四环素类、孔雀石绿、伏马毒素、赭 曲霉毒素 A、T-2毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、黄曲霉毒素 Ml、黄曲霉毒素 B1、泰乐菌素、 植物维生素 C、植物钙调素、花生凝集素、植物维生素 B6、双花扁豆凝集素、植物吲哚乙酸、 植物维生素 D、豌豆凝集素、植物凝脂酸、植物维生素 D3、蓖麻凝集素、植物生长激素、植物 维生素 D2、扁豆凝集素、植物血凝素、植物维生素 E、植物赤霉素、植物维生素 A、植物玉米索 核苷、植物维生素 B12、槐凝集素、植物磷脂酰甘油、植物激素脱落酸或荆豆凝集素。
4. 根据权利要求1所述的检测硫酸基转移酶活性的杂合型化合物，其特征在于所述L 是直接键、C1-C12亚烷基、C2-C12亚链烯基或C2-C12亚炔基，所述亚烷基、亚链烯基或亚炔 基的至少一个-CH 2-基团任选被-0-、-S-、-S02-、亚环烷基、亚芳基、亚杂脂环基、亚杂芳基 和/或-NR5-置换，以及所述亚烷基、亚链烯基或亚炔基任选被至少一个羰基氧和/或羟基 取代。
5. 根据权利要求1所述的检测硫酸基转移酶活性的杂合型化合物，其特征在于为以下 化合物：

6. 权利要求1?5任一所述杂合型化合物检测硫酸基转移酶活性的方法，其特征在于 包括：（1)将杂合型化合物X-L-H作为硫酸基转移酶的底物；（2)将所述底物和硫供体在含 有硫酸基转移酶的待测样品催化作用下发生硫酸化反应；（3)通过免疫分析法对反应得到 的硫酸化底物进行检测，计算出硫酸基转移酶的活性。
7. 根据权利要求6所述的杂合型化合物检测硫酸基转移酶活性的方法，其特征在于所 述的硫供体为5' -磷酸磺基-3' -磷酸腺苷或5 "-磷酸磺基-2' -磷酸腺苷；所述的待测 样品为体液或器官组织；所述的免疫分析法包括酶免疫分析法、荧光免疫分析法或化学发 光免疫分析法。
8. 根据权利要求7所述的杂合型化合物检测硫酸基转移酶活性的方法，其特征在于： X-L-H作为反应底物，5' -磷酸磺基-3' -磷酸腺苷或5' -磷酸磺基-2' -磷酸腺苷作为硫供 体提供硫酸基团，添加含有硫酸基转移酶的待测样品，反应后产生X-L-H的硫酸盐结合体 X_L_H-[S];反应体系中加入二氯甲烧或氯仿抽提3次，尚心提取含有X_L_H-[S]的上清，去 除未反应的X-L-H ;将含有X-L-H-[S]的上清与X的特异性抗体进行免疫反应；通过检测反 应液中X与抗体结合的水平，计算出反应液中X-L-H-[S]的浓度，推算出待测样品中硫酸基 转移酶的活性。
9. 权利要求1?5任一所述杂合型化合物在检测硫酸基转移酶活性试剂盒中的应用。
10. 检测硫酸基转移酶活性试剂盒，其特征在于含有权利要求1?5任一所述杂合型化 合物。
【文档编号】G01N33/573GK104387436SQ201410572319
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】陈玲, 王小丽, 缪冶炼 申请人:南京医科大学, 缪冶炼