一种人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的定量测定方法、试剂及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本申请设及一种人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的定量测定方法、试 剂及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 天冬氨酸氨基转移酶（Aspartateaminotransferase,AST)广泛存在于人体各种 组织细胞中，尤W肝、屯、组织细胞含量最为丰富，而正常人血清中AST活性很低。人体中AST 存在两种同工酶，一种是cAST，主要来源于细胞浆，另一种是mAST，存在于线粒体内。该两 种同工酶在基因组成上有差异，在氨基酸组成、免疫学特性W及在体内的半衰期等均不同。
[0003] 在机体轻度病变时，组织细胞的细胞膜通透性增高，CAST透过细胞膜进入血液系 统中，但mAST有两层线粒体膜的保护，不易释放入血；而当机体严重疾病时，出现细胞坏 死、线粒体崩解，附着在线粒体上的mAST可迅速释放进入血中。因此，血清mAST活性可反映 组织细胞的坏死程度，若血清中检测出高水平mAST，则表明屯、肌、肝脏严重受损；另外mAST 在血中的半衰期比CAST短，当细胞不再破坏或修复时，血清中mAST很快降至正常水平，因 此mAST又是屯、肌、肝脏损害预后的评价指标，对疾病的诊断、治疗具有重要的价值。
[0004] 目前，血清中mAST测定主要有电泳法、层析法W及免疫抑制法等。该些方法具有 操作繁琐、耗时长、价格昂贵、过度浪费资源的缺点，不适于常规检验，尤其是大规模流行病 学检查或临床大批量标本诸多项目的同时检测。
【发明内容】
[0005] 本申请的目的是提供一种人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性定量测定 方法、试剂及试剂盒。
[0006] 本申请采用了W下技术方案：
[0007] 本申请的一方面公开了一种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活 性的试剂，该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有Tris缓冲液、 k天口冬氨酸、苹果酸脱氨酶、乳酸脱氨酶、C-AST羊抗人抗体、酶稳定剂；所述试剂II含有 a-酬戊二酸、还原性辅酶。
[000引进一步的，所述试剂I中Tris缓冲液含量为50-150mmol/l，k天口冬氨酸含量为 100-500mmol/l，苹果酸脱氨酶含量为0. 5-2KU/1，乳酸脱氨酶含量为0. 2-1. 5KU/1，C-AST 羊抗人抗体含量为0. 5-1. 5ml/l，酶稳定剂含量为0. 5-5g/L。
[0009] 进一步的，所述试剂I中Tris缓冲液含量为lOOmmol/L，k天口冬氨酸含量为 240mmol/l，苹果酸脱氨酶含量为化U/1，乳酸脱氨酶含量为0. 8KU/1，C-AST羊抗人抗体含 量为0. 8ml/l，酶稳定剂含量为Ig/L。
[0010] 进一步的，所述试剂II中a-酬戊二酸含量为l-50mmol/l，还原性辅酶含量为 0.05-lmmol/L。
[0011] 进一步的，所述试剂II中a-酬戊二酸含量为lOmmol/l，还原性辅酶含量为 0.2mmol/L。
[0012] 进一步的，所述Tris缓冲液PH为8. 0。
[0013] 进一步的，所述酶稳定剂包括海藻糖、庶糖、牛血清白蛋白、甘油、吐温80中的一 种或者几种；
[0014] 进一步的，所述还原型辅酶I稳定剂包括海藻糖、牛血清白蛋白、甘油、吐温80中 的一种或几种。
[0015] 本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活 性的试剂盒，其中装有上述定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂， 该试剂由分别放置的试剂I及试剂II组成。
[0016] 本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活 性的方法，该方法包括向血清样品中加入所述试剂I，37°c解育5分钟，然后向样品中加入 试剂II，继续解育1-2分钟后，在340nm波长下连续监测1-2分钟样本吸光度变化，计算样 本每分钟平均吸光度变化值A/min;用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化 值AAea/min;再通过下式（1)计算得到血清样品的线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性：
[0017] m-AST活性（U/L) = (AA样本 /min-AA空白 /min)XK(1)
[001 引K= 2090
[0019] 本方法的原理为；血清中天口冬氨酸氨基转移酶的活性为胞浆型AST(c-AST)和 线粒体型AST (m-AST)之和。本法用免疫抑制法酶动力学测定m-AST活性，在羊抗人的C-AST 抗体存在的条件下，标本中C-AST活性被抑制，而m-AST活性不受影响。可用速率法进行测 定，标本中m-AST的活性与NADH下降的速率呈正比。
[0020] 本发明直接定量测定人血清样品中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂盒，是 将分别放置的上述试剂I和试剂IIW不同的规格装入试剂盒包装中。该试剂盒具有多种 不同的规格，可W分别适用于目前在临床实验室普遍使用的各种国内外品牌的自动生化分 析仪器。
[0021] 本发明采用的试剂盒及检测方法只需几十微升血清，无需离屯、或电泳等分离处 理，操作简便，可满足全自动化分析的要求，适用于大规模样品的及时准确检测。
【具体实施方式】
[0022] 实施例一
[0023] 按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II :
[0024] 试剂 I:
[0025]
【主权项】
1. 一种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂，该试剂由分别放 置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有Tris缓冲液、L-天门冬氨酸、苹果酸脱 氢酶、乳酸脱氢酶、c-AST羊抗人抗体、酶稳定剂；所述试剂II含有a -酮戊二酸、还原性辅 酶。
2. 根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂I中Tris缓冲液含量为 50-150mmol/L，L-天门冬氨酸含量为100-500mmol/L，苹果酸脱氢酶含量为0. 5-2KU/L，乳 酸脱氢酶含量为〇. 2-1. 5KU/L，c-AST羊抗人抗体含量为0. 5-1. 5ml/L，酶稳定剂含量为 0. 5-5g/L〇
3. 根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂I中Tris缓冲液含量为 100mmol/L，L-天门冬氨酸含量为240mmol/L，苹果酸脱氢酶含量为1KU/L，乳酸脱氢酶含量 为0. 8KU/L，c-AST羊抗人抗体含量为0. 8ml/L，酶稳定剂含量为lg/L。
4. 根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂II中a _酮戊二酸含量为 l-50mmol/L，还原性辅酶含量为0. 05-lmmol/L。
5. 根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述试剂II中a-酮戊二酸含量为 10mmol/L，还原性辅酶含量为0. 2mmol/L。
6. -种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂盒，其特征在于， 其中装有权利要求1至5中任一所述的定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活 性的试剂，该试剂由分别放置的试剂I及试剂II组成。
7. -种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的方法，该方法包括向血 清样品中加入所述试剂I，37°C孵育5分钟，然后向样品中加入试剂II，继续孵育1-2分钟 后，在340nm波长下连续监测1-2分钟样本吸光度变化，计算样本每分钟平均吸光度变化值 A /min ;用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化值A Aee /min ;再通过下式 (1)计算得到血清样品的线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性： m-AST 活性（U/L) = ( A A样本 /min- A A空白 /min) XK (1) K = 2090。
【专利摘要】本申请涉及一种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂，该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有Tris缓冲液、L-天门冬氨酸、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、c-AST羊抗人抗体、酶稳定剂；所述试剂II含有α-酮戊二酸、还原性辅酶。本发明采用的试剂盒及检测方法只需几十微升血清，无需离心或电泳等分离处理，操作简便，可满足全自动化分析的要求，适用于大规模样品的及时准确检测。
【IPC分类】G01N21-33
【公开号】CN104865214
【申请号】CN201510230706
【发明人】张益军
【申请人】浙江蓝森生物科技有限公司
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年5月8日