专利名称：对雌激素受激亮氨酸氨基太酶的单克隆抗体的制作方法
此项发明论述能和亮氨酸氨基太酶(es-LAPase)的人类雌激素响应的同功酶特异性结合的单克隆抗体。也论述了被称为7B6的骨髓瘤细胞系及由此产生的单克隆抗体。进一步论述了用来自骨髓瘤细胞系7B6的单克隆抗体检测血液，血清，或血浆中对LAPase的雌激素响应同功酶水平的诊断系统。这一抗体特别适用于快速诊断乳腺癌。
背景技术：
对人类疾病如乳腺癌进行有效检测及设计治疗药物的关键在于能够鉴别危险因素和病理生理改变。在各种与乳腺癌早期形成有关的危险因素中，雌激素及与雌激素有相似活性的雌激素类似物仍是对乳腺癌早期发生和发展的最重要的被检物。在正常生理条件下，有些组织是雌激素起关键作用的器官，例如生殖系统和第二性器官如乳腺。此外，雌激素还可以通过促使靶细胞增殖来参与骨生长调节，肝脏，心血管功能及激素代谢周期。这些不同组织对雌激素的反应能部分解释雌激素在不同人类肿瘤特别是乳腺肿瘤的发病和发展方面所起的活性作用。尽管雌激素刺激调节各种生理功能的精确分子机制需要进一步阐述，雌激素参与了初期和早期细胞功能。因此，由雌激素引起细胞早期活动导致细胞增殖，很可能是通过加速细胞由G1期向S期发展的速率，而缩短细胞周期。最近有报道，在相同浓度下雌激素可以通过共同激活细胞周期蛋白D1-CdK4和E-CdK2这两个密切相关的关键的G1调节太的表达来促进细胞增殖。
广泛应用的乳腺癌诊断方法有影像技术，如超声，X射线法。但是这一技术受到影像分辨率的限制，只能诊断大到一定程度的肿瘤。
活组织的组织学分析是诊断乳腺癌的另一常用方法。这一方法依赖于可见的细胞类型鉴别。虽然这种方法比较客观，但要靠检测者的技术水平。
分子诊断测定广泛应用于活组织细胞中雌激素和孕激素受体检测，从而确定此种肿瘤是否对激素治疗有效。
流动细胞学分析也用于测定一些参数，如与肿瘤细胞相关的DNA含量，细胞周期特定时期的细胞比例。
然而，细胞学，雌激素和孕激素受体分析，及流动细胞学分析都需取活组织，样品处理复杂。
显然，迫切需要一种快速，灵敏，较少侵害性的方法来对乳腺癌进行诊断。尤其是灵敏的分析方法来检测血液中能够反映转移是否存在的细胞标记物。更重要的是需要在乳腺癌发展过程中起主导作用的雌激素的细胞标记，而不是对雌激素起作用的雌激素和孕激素受体。
发明概述目前的发明是关于对人类es-LAPase特异结合的单克隆抗体。进一步论述用单克隆抗体检测血液，血清，血浆或组织中LAPase水平的诊断方法。
根据此发明可提供对es-LAPase特异性单克隆抗体。
进一步提供通过检测样品中es-LAPase水平检测转移癌的方法。
图例简介下图进一步说明我们的发明图一说明乳腺癌细胞系母细胞上清液中雌激素对LAPase活性的作用。
图二说明用Bestatin，thioredoxin和glutathione抑制LAPase的动力学。
优选实施方案的描述此项发明说明单克隆抗体对在可溶型或膜形式的es-LAPase的特异性结合。进一步论述用单克隆抗体检测血液，血清，血浆或组织中es-LAPase水平的诊断系统。
为了从乳腺肿瘤和组织母细胞中寻找对雌激素响应的细胞因子，研究者分离出了假设的LAPase的同功酶。LAPase同功酶通过estradiol恒温乳腺肿瘤母上皮细胞而释放进入超细胞环境。雌激素活性取决于计量，产生活性的最佳LAPase浓度为100nM。
为了获得对雌激素有反映的LAPase同功酶，将人乳腺癌组织上皮细胞与雌激素一起培养。最好与浓度范围在10-8-10-5M(10-7M)的estradiol一起培养。参照图一，显然这一培养过程促进了LAPase得释放。该酶用HPLC-凝胶渗透，然后用DEAE-纤维素和Bestatin-Sepharose亲和色谱从细胞上清液中提纯。用不同柱子的凝胶渗透分析结果，提纯后的LAPase分子量为315 kDa。这一LAPase同功酶与文献报导的其它同功酶分子量有明显差别。
目前单克隆抗体是根据Campbellde和Lietzke，R，Unsicker，K传统方法制备的。该法将老鼠骨髓瘤细胞经组织培养与抗体结合从免疫老鼠产生杂交细胞，这些细胞产生大量的单一抗体分子。即用抗原免疫动物如小鼠，大鼠，兔，羊，马或牛制备产生抗体的细胞。免疫步骤及抗原浓度取决于能够提供足够量的产生抗体的细胞。这些产生抗体的细胞可以是脾细胞，淋巴细胞，淋巴结细胞或外周血淋巴细胞。
选择适当的融合启动子，使这些产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合，细胞系可以来源于各种动物如鼠，兔及人类。许多小鼠骨髓瘤细胞系是已知并可从医学科学团体及其它储存处获得如美国分类培养收集机构，Rockville，Maryland.所用的这些骨髓瘤细胞对培养基应具有选择性以使未融合的骨髓瘤细胞在选择性介质中不能存活，而杂交细胞则能存活。最常用的细胞系是抗8-氮鸟票呤系，它含有较少的次黄票呤-鸟票呤-磷酸核糖转移酶，因此不能在HAT培养介质中生长。一般说来，该细胞系应是“非分泌”类，因而不产生抗体。所选的融合启动子是聚乙二醇，其分子量在1000到4000之间。也可用聚乙烯醇，病毒或电场作为融合启动子。
这些存活的细胞(杂交物)需经筛选，找出能分泌特异性抗体的细胞。通常用ELASA进行初选。进一步，将这些杂交物培养上清液加到预先加好抗原的微滴定盘中，这里所用的抗原是提纯的LAPase。培养上清液的特异抗体可用第二标记抗体检测。最常用的第二抗体是用过氧化物酶标记的抗鼠IgG(有商品出售)。对es-LAPase抗原阳性的培养液用限制稀释法克隆。第二杂交物培养液用上法进行再筛选。通过测定抗体是否与抗原结合来评估培养液并测定抗体结合的动力学参数。对选择的培养液再克隆直到培养液稳定并获得克隆。刚杂交之后的融合产物含有大约80个染色体。克隆过程是选择那些仍保留产生抗体的染色体密码的细胞。克隆过程一直重复到100％的亚群呈现特异性抗体的生产，这代表杂交物“稳定”。此外杂交物培养皿可有多种克隆，其中有些可能不产生抗体。克隆过程允许选择从单一细胞衍生的阳性杂交物。
具体实验提供了被称为MAb 7B6的单克隆抗体。这一产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系于2000年3月23日存放在加拿大国际存放机构。这一单克隆抗体是IgG1a的亚型。它既能鉴别可溶性又能鉴别与膜有关的es-LAPase型式。具有一般技术的人可知此法既能制备多克隆抗体又能制备单克隆抗体。该发明的一方面，MAb 7B6能够结合到固体基质上。这一固体基质可以是蛋白G基质。MAb 7B6结合到基质上可用于es-LAPase免疫沉淀。这一免疫沉淀可以降低抗体的非选择性结合。这一免疫沉淀可以用于测定酶活度或其它测定。
目前的发明还包括任何具有抗体活性结合区域的片段，如Fab，F(ab)2和Fv片段。这些片段可用已知技术从7B6抗体获得。
更具体的还有一些能够结合相同抗原测定物如7B6抗体的抗体和片段。包括，但并不限制在，与7A6抗体有相同抗原性却来源不同或不同生长环境或具不同结合亲和力的抗体。显然这一类及其抗体的变种可用重组类转换和融合技术制备，这些技术可在“技术”里找到。
这些单克隆抗体可用生物反应器或从腹水中生产，这两种方法均来自“技术”里。
这些单克隆抗体可用于血液，血清，血浆或组织中es-LAPase水平的免疫学测定。
目前免疫测定使用双重抗体检测被检物的存在。这些技术在“抗原-抗体反应基本原理”中有介绍。这些系统称为快速形式系统，因为它们适用于快速检测被检物的存在。这一系统要求被检物与抗体有很强的亲和力。目前试验显示，用一对抗体检测LAPase的存在，每个抗体对LAPase都有特异性。这对抗体之一指的是“检测抗体”，另一个是指“捕获抗体”。我们所发明的单克隆抗体既可单独用作捕获抗体或检测抗体，也可以在一个测定中同时用作两者。另一方面可用双抗体三明治法测定生物液体样品中的es-LAPase。在此法中，被检物(es-LAPase)是夹在检测抗体和捕获抗体之间的，捕获抗体被不可逆地固定在固体支持物上。检测抗体含有可检测的标记以便测定抗原-抗体复合物从而检测被检物的存在。
早期使用的固体支持物是在放射免疫学和酶免疫学领域里常用的盘，试管或聚苯乙烯珠。最近，许多多孔性材料如尼龙，硝酸纤维素，醋酸纤维素，玻璃纤维及其它多孔聚合物被用作固体支持物。
方法之一是使用流通免疫测定设备。Valkirs等发明了一种设备，包括将被检抗原特异性抗体结合到多孔性膜或过滤器上，将液体样品加入该膜。当液体流过膜时，被检物与抗体结合。加完样品之后，再加标记的抗体。对所标记抗体的检测能指示样品中被检物的存在。
另一使用流通设备的例子是Kromer等所描述的，一个试剂传送系统包括一个基质，用试剂或分散在水溶性聚合物中的组分来控制放在基质下的传递到反应基质中的试剂的溶解速度。
在迁移类型测定中将膜浸在测定所用的试剂中，产生分析物测定带，该带结合了标记分析物，因此可读取检测标记。例如，见Tom等的专利和Zuk的专利。迁移测定装置通常将试剂与有色标记接触，不需再加其他物质就有可见的检测分析结果。例子见BernsteinUS专利4770853)，May等(WO88/08534)，及Ching等(EP-A0299428)。我们所研究的单克隆抗体可用于所有类型的流通设备。
直接标记是目前所用的标记方法之一。直接标记被定义为一种实体，其在自然状态下，可用肉眼或借助于光学滤片观察到，或用UV激发产生荧光。在目前这些有色标记例子中，包括金属溶胶微粒，例如Leuvering所描述的金溶胶微粒；GribnauMay所描述的染料溶胶微粒；May，supra，Snyde所描述的染色胶乳；或Cambell等提出的包胶的脂质体染料。其它直接标记有放射核甘太，荧光或发光。除了这些直接标记方法外，也可用间接酶标法。各种类型的免疫酶联测定都是众所周知的，如硷性磷酸酶，辣根过氧化物酶，溶菌酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，乳酸脱氢酶，尿激酶等在酶免疫测定ELISA和EMIT文中有详细介绍。
其它用单克隆抗体测定es-LAPase的生物诊断方法在G.Grenne等的专利中有介绍。
在诊断检测试验中常用血样试管从病人身上取血。试管内壁起到单克隆或多克隆抗体载体作用并且需要试剂或检测方法产生可测量的信号。这一设计是将捕获抗体固定在测定试管壁上。血样从病人体内取出后，只需震摇试管以使内部的检测抗体与血样中的es-LAPase反应。这些单克隆抗体或是当作捕获抗体，或是作为检测抗体。必需使用除去红细胞的样品以使红细胞不影响分析结果。如果血样中含有被检物，就会夹在捕获抗体和检测抗体之间，这些抗体含有适当的标记进行直接检测或和试剂反应后进行间接测定。然后清洗固体支持物(试管)以除去未结合的标记物。许多物质都可用作该法的固体支持物，如试管壁，塑料杯，玻璃珠，塑料球，量桶及微滴定盘，纸和玻璃纤维。
当前有几种自动分析装置可对许多样品同时进行快速分析。这些自动装置有连续/随机测定装置。例如PB诊断系统的OPUS及IMX分析仪。总之，样品操作的全部过程，从吸取样品到测定装置，恒温，及所得信号的读取均是自动控制。自动测定系统一般包括一系列工作站，每一个工作站完成检测过程的一个步骤。这些检测装置可以用各种方式由一个工作站转到下一个，使检测步骤能够按顺序进行。测定装置还包括试剂储存，混合液体，稀释样品槽。还应有一个开口允许加入已知量的液体，如有必要把所需试剂加入多孔膜。还有一个窗口能够读取多孔膜中样品的荧光或有色光变化例如分光光度计或荧光计。
PB诊断系统自动检测仪见US专利5051237；5138868；5141871和5147609。
关于IMX分析仪见Fiore等“Abbott IMX自动操作台免疫化学分析仪系统”。US专利4956148题为“锁架(LockingRacking)及一次性样品盒”分析仪，它被指定给Abbott实验室。其中描述了用与Abbott IMX系统连接的携带许多反应细胞的演示。此技术的进一步发展在加拿大专利2069531中有说明，并由Abbott实验室进行。这一免疫化学分析仪系统能够用现有的仪器一次分析三到四个样品。这一系统将使用者把一组中三批样品同时测定而不需分三次分析。单克隆抗体可用于这些自动分析仪。
更进一步的可用单克隆抗体的免疫化学分析仪系统有生物传感器或光学免疫传感器系统。总之，光学生物传感器是使用光学原理定量把所需的化学和生物化学浓度或活性转换成电信号。这些系统可分为四类反射技术；表面plasmon共振；光纤技术和相应的光学设备。反射技术包括ellipsometry，多组成反射光度计，及荧光毛细管填充装置。光纤技术包括瞬间场荧光，光纤毛细管和光纤荧光敏感器。响应的光学设备包括计划瞬间场荧光，输入光跚连接免疫敏感器，Mach-Zehnder干涉仪，Hartman干涉仪，示差干涉仪敏感器。这些光学免疫敏感器在综述文章中有概述。
另一免疫化学分析法是流动细胞学分析。该法是用含有抗原的样品与用荧光标记的单克隆抗体反应。样品经过具有一定波长的激光束，该波长能激发抗体的发色团。每一个有抗体结合的微粒或细胞会产生荧光因而可以测定。这一技术能够分析特定的细胞类型尤其是特定的血细胞类型。因此，可用于测定带有es-LAPase抗原的细胞。
另一具体实验是用单克隆抗体检测血液，血清，血浆或组织样品中的es-LAPase。这一检测是在具有检测部分和捕获部分的滤膜或固体支持物的装置中进行的。检测部分含有检测抗体，它将与es-LAPase反应。检测抗体可逆地固定在固体支持物上，使用时将随样品一起移动。最好标记检测抗体。例如用放射核甘太，酶，荧光物质，发光物质或如前所述的有色标记。捕获部分包括捕获抗体，将其不可逆地固定在固体支持物上。这些捕获和检测抗体及必需试剂用标准技术固定在固体支持物上，如前所述的流通型免疫测定设备。总之，用非极性蛋白亚结构与非极性支持材料之间的相互反应将抗体吸附在固体支持物上。
根据我们的具体实例，如果血液中有es-LAPase存在，它将在检测部分与检测抗体反应，在滤膜上向捕获端迁移并在此处与捕获抗体进一步结合。因此，es-LAPase将被夹在有适当标记的捕获抗体和检测抗体之间。
如果用有色标记或能产生有色标记的酶标记抗体，病人的血要先离心或预过滤除去红细胞使之不影响有色标记。如果用放射标记或荧光标记则不必须先离心或预过滤。单克隆抗体既可作为捕获抗体也可作为检测抗体。用单克隆抗体作为捕获抗体。检测抗体可以是其它的es-LAPase单克隆抗体，和其它同型的LAPase反应的单克隆抗体或抗-es-LAPase多克隆抗体。鸡，兔，羊或鼠多克隆抗体都可以用。很多这类抗体是已知的并可以用已知方法制备和标记。
这一免疫测定方法的说明见US专利5290678。我们发现的这一抗体特别适用于这一检测系统，因为它对es-LAPase有高度亲和性。
单克隆抗体7B6也可以用于检测具有高度乳腺癌发病危险的病人。因为血清es-LAPase受雌激素影响，而雌激素是鉴别有些类型乳腺癌生长的重要因素。危险个体包括那些服用雌激素类避孕药，激素替代治疗或激素代谢不正常类型的人。
以上的研究还需改进以便区分可溶性及与膜相关的es-LAPase。
可见，es-LAPase的基线水平可由正常病人提供。因此，高于基线水平的es-LAPase可以测定。这一测定既可用与正常结果比较的方法也可用调节免疫测定灵敏度的方法以使高于特定限度的值呈阳性结果。
如以下例子所示，es-LAPase水平与乳腺癌和乳腺癌转移有关。因此，我们发现的单克隆抗体7B6以及上述的具体实例是非常有效的新的诊断工具。
为更好地理解我们的研究结果，特举例说明。以下例子只帮助理解，并不说明我们的研究仅限于此。
实例例1依赖雌激素的LAPase的分离和纯化人类肿瘤组织的乳腺癌母细胞用100nm 17-B-雌二醇刺激24小时，或用培养介质作对照。细胞介质为RPMI 1640培养介质+10％FCS+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素。经在无缝葡聚糖试管(MV12,400)中用PBS降解24小时(4℃)后收集上清液。然后用HPLC-凝胶渗透色谱与DEAE-纤维素和Bestatin-琼脂糖凝胶亲和色谱从降解的细胞上清液中纯化LAP。简言之，将细胞上清液倒入Bio-Sil SEC-250柱(600×7.5mm)上，该柱子用含有100mM磷酸钠(pH6.8)，100mMNa2SO4，1uM ZnCl2，和10％甘油缓冲液预先平衡。然后用300ml同样的缓冲液以0.5ml/min.的流速洗涤柱子。用YM5膜高速离心将蛋白浓缩至10ml。浓缩液再经DEAE纤维素柱(2.6×28.5cm)，此柱先用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)；1uMZnCl2；和10％(v/v)甘油平衡并洗涤。Bestatin-亲和柱的制备是根据厂家提供的方法，用Ultralink EDC/DADPA Amide结合基质通过用100mg纯Bestatin和EDC/DADPA基质反应制备的。在加入含LAP的洗涤液之前，将Bestatin亲和柱用10ml Tris-HCl(pH8.0)含1uM ZnCl2缓冲液平衡，再用300ml该结合缓冲液洗涤。es-LAPase用蠕动pump以0.10ml/min的流速通过这一系统进行再循环两小时。再循环后用八倍柱容量的结合缓冲液洗涤柱子。用线性洗脱液(0-0.5M NaCl)(含有1uM ZnCl2的10nM Tris-HCl pH8.0)洗提Bestatin键合的es-LAPase。在280nm测定洗脱下来的键合LAP。提纯的es-LAPase分装成500ul储存于50mM Tris-HCl pH7.8和50uMZnCl2溶液中。每一步提纯后都要用Pulido-Cejudo(J.Chromatogr.B660(1994)37-47)的方法测定其浓度。简言之，100-200ul样品用去离子水透析，然后把每个样品2-20ul放入聚乙烯管中。样品在110℃干燥60分钟。接著用250ul冰醋酸中和。然后使样品与500ul下列印三酮-还原印三酮溶液反应，该溶液组成为2g印三酮，150mg还原印三酮(Sigma)溶于65ml 2-甲氧基乙醇，然后加入35ml 4M醋酸钠(pH5.5)。将试管于110℃恒温15分钟。加入2.5ml 5％(v/v)乙醇，然后在570nm测定其吸收度。蛋白质含量可由吸收曲线的到，该曲线是由1-10ug BSA的样品测得的。从人类乳腺癌母细胞中纯化17-B-雌二醇-刺激的es-LAPase概括见表1。表1从人类乳腺癌母细胞中纯化LAP的总结StepProtein1Total Activity2Specific Activity2Fold Yield％(mg) (nmole/min) (nmole/min/mg)Supernatant 15.4 98.216.73 1 100Gel Permeation 4.2 82.1319.553.07 83.63Cellulose DEAE 0.72 48.2567.0110.51 49.13Bestatin-0.005 37.117422 1165 37.79Sepharose1.根据Pulido-Cejudo等J.Chromatgr.B660 1994 37-47)的方法用印三酮测定硷水解后的蛋白含量。
2.用亮氨酸-B-奈氨作为底物用荧光法测定(Kuramochi，H.，et al.1987 J.Antibiot.40，1605-1611)。
例2A)单克隆抗体的生产和纯化产生17-B-雌二醇-刺激的LAPase鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞系7B6，免疫抗原的制备，免疫动物脾细胞的制备，脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，及融合细胞在选择性介质中的涂铺方法均来自Campbell提出的方法和Lietzhe与Unsicker详细描述的方法。
简言之，基本的免疫反应是用提纯的es-LApase经脱盐后进行的。在第14，35，56天时用提纯的es-LApase促进，在24和45天筛选BALB/C小鼠。小鼠在第59天杀死，将反应最好的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。用在硝化纤维上的点图免疫染色进行筛选。
用限制稀释法单细胞克隆获得杂交瘤克隆7B6。准备四个系列稀释试管，其中含有杂交瘤细胞及20％FBS+2X OPI培养液。将每中稀释液100ul加到96孔的盘中，并在每个孔中加入50ul喂养脾细胞，置于37℃，5％CO2培养箱。第七天，从各孔中取上清液，用在硝化纤维上的点图免疫染色进行筛选。
B杂交瘤克隆7B6的扩展把杂交瘤克隆7B6细胞由96孔盘中转移到0.5ml培养液中，该培养液含有20％FBS+1X OPI+1X HAT放于24孔的盘中。一旦细胞浓缩，将其5mls转移至60mm盘，然后再成10ml转移至100mm盘中。当60mm盘中的细胞被认为没有次黄票呤，胸腺密定脱氧核甘，氨基票呤，7B6杂交瘤细胞将继续生长直到成指数级生长。抗-LAPase，MAb 7B6从收集的杂交瘤7B6细胞上清液中用免疫纯的IgG亲和色谱分离。用在硝酸纤维素上的点图免疫染色进行筛选。
C)MAb 7B6的免疫类型MAb 7B6类型用Sigma的免疫分类试剂测定。即单克隆与预涂分类硝酸纤维膜结合，然后用灵敏的生物素-抗生物素蛋白-酶检测系统进行免疫测定。免疫球蛋白的类型由其自身的性质可见。
D)MAb 7B6在蛋白G基质上的固定在MAb 7B6提纯后，相应的IgG1a被固定在DSS交叉连接系统，见Pierce(Rockford，IL，USA)。MAb 7B6蛋白G基质用于在测定LAPase活性之前从血浆和细胞膜结合部分选择性免疫沉淀LAPase。
例3例6人类乳腺癌母细胞的ELASA分析人类乳腺癌母细胞进行ELASA分析说明MAb7B6对NDP-Kinase和LAPase相应的活性。简言之，在96孔的盘上，每孔加入在RPMI 1640培养液中的50000母细胞+10％FCS+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素，于37℃，5％CO2培养24小时。除去上清液，用PBS洗涤细胞，随后用1％gluteraldehydrade的PBS溶液室温下固定1小时。用PBS洗涤，然后用casein在37℃，5％CO2封闭一小时。用PBS洗涤后，在孔里加入MAb 7B6的系列稀释液并在37℃，5％CO2培养2小时。在加入第二抗体，抗-(IgG+IgM)过氧化物酶结合的羊-抗-鼠IgG+IgM(H+L)和OPD之后，能够显MAb7B6反应性。在490nm测得的读数总结如下(表2)。表2MAb 7B6对人类乳腺癌母细胞LAP反应性的总结MAb 7B6 Cell Line 1OD490nm- Cell Line 2OD490nm-(ng/well)Blank OD490nm Blank OD490nm2000.707-0.054＝0.653 0.6-0.005＝0.5951000.57-0.021＝0.5490.446-0.003＝0.4350 0.489-0.042＝0.447 0.327-0.003＝0.32425 0.38-0.047＝0.3330.24-0＝0.2412.5 0.294-0.05＝0.2440.165-0＝0.1656.25 0.225-0.05＝0.1760.1-0.003＝0.0973.125 0.155-0.044＝0.111 0.068-0.003＝0.0651.56 0.107-0.05＝0.0570.043-0.002＝0.0410.78 0.094-0.005＝0.039 0.023-0.001＝0.0220.39 0.067-0.073＝0 0.015-0＝0.0150.20.061-0.052＝0.009 0.008-0＝0.0080.10.053-0.046＝0.007 0-0＝0例4雌激素刺激后细胞上清液中LAPase水平把早期乳腺癌母细胞与100nM 17-B-雌二醇一起培养24小时，用单纯介质作空白。用7B6IgGla)-蛋白G-LAPase小珠分离上清液中的LAPase，这些小珠用共价交叉连接上单克隆抗体。LApase免疫沉淀上清液中LAPase的活性用亮氨酸-B-奈氨为底物用荧光法测定。
有Sigma得到的纯化的酶制剂与100nM 17-B-雌二醇培养24小时，用亮氨酸-B-奈氨为底物用荧光法测定LAPase的活性。
在雌激素刺激后，LAPase的最大释放量是在雌激素浓度为100nM，进发24小时培养后(见
图1)。在同一时期，对照细胞的细胞上清液中的LAPase没有变化。另外，基本母细胞系的细胞上清液中的LAPase活性用7B6(gGla)-蛋白G-LAPase基质键合抗体免疫沉淀测定。这些结果表明，雌激素刺激的细胞LAPase活性为7.7×10-5u/ml而作为对照的只有细胞介质的母细胞培养上清液中LAPase活性只有6.4×10-6u/ml。此外，在只有酶的纯制剂中雌激素培养对LApase活性没有影响。总的说来，这些结果表明，雌激素对LAPase的活性的影响包括细胞调节过程。
例5乳腺癌妇女雌激素响应的LAPase免疫流动细胞学分析检测MAb 7B6对母细胞的结合可以用于测定乳腺癌妇女的循环上皮细胞。另外，用MAb 7B6进行的血浆免疫沉淀表明患有非浸润性导管癌和转移癌的妇女具有较高的LAPase水平，而健康妇女则较低。
A)用亮氨酸-B-奈氨为底物用荧光法测定。乳腺癌发病病人和同龄健康妇女血浆中LApase活性进行比较。这一反应用在100℃煮沸10分钟的方法终止。然后，在4℃以780xg离心10分钟。测得LApase活性平均值，这一平均值是按16人一组三此测定结果的平均值。
LAPase的活性是用血浆免疫沉淀法测定的，用其价的MAb 7B6IgGla)-蛋白G-LAPase基质进行免疫沉淀。简言之，血浆在4℃500xg离心10分钟。吸去上清液，继续在4℃500xg离心5分钟。将所得血浆用PBS按1∶10稀释，将800ul血浆稀释液加到7B6IgGla)-蛋白G-LAPase小珠上，每200ul小珠含有5ul抗体并预先用封闭缓冲液培养。样品在预涂0.5％BSA的Eppendorf试管中，在不断转动下，室温培养15分钟。经培养后的样品于250xg，室温下用Eppendorf离心机离心，除去上清液。具有LAPase活性的珠粒用PBS；0.5％NFDM洗涤两次。最后用无钙的Hank′s溶液再溶解使最终体积为600ul并含有182uM 1-亮氨酸-B-奈氨。用LAPase-MAb7B6IgGla)-珠粒(涂有0.5％NFDM)作为相应的空白。
用血浆选择性免疫沉淀与抗-LAPase MAb-蛋白G基质培养发现，有转移性疾病的妇女血浆中LAPase活性比对照组高4个数量级。这种LAPase活性的增加对原位导管癌(DCIS)病人不明显。结果总结见表3。
表3患乳腺癌妇女血浆中的LAPase活性水平Patient Population LAPase Levels(n＝10per group) (U/ml)Normal 6.16×10-4+0.82×10-4DCIS(non-invasive) 3.06×10-1±0.80×10-1Metastatic(Lung/Brain) 1.73±0.081U LAPase为在pH位7.5，37℃，每分钟水解1u mol L-亮氨酸-B-奈氨。
B)乳腺癌上皮细胞的流动细胞学分析肿瘤组织上皮细胞间接免疫荧光染色法是将吸附了MAb7B6抗体的人血清与附著细胞一起培养。即，用PBS洗涤融合的细胞，与20ul MAb 7B6抗体(200ug/ml)或对照小鼠IgG1于37℃培养，最终体积为2ml。经20分钟培养后，立即用PBS洗涤细胞。再与鼠-抗-IgG-PE或鼠-抗-IgG-FITC结合物一起培养15分钟。用PBS洗涤细胞三次，取一部分用夷蛋白酶处理并用流动细胞仪分析，仪器备有气体冷却的氩离子激光，其操作功率为10mwatt。在激发波长为488nm时，可同时测得FITC和PE结合物的激发。
如表4所示，MAb 7A6可用于测定由乳腺癌分离的母上皮细胞中膜键合的LAPase。循环细胞中LAPase活性筛选是同时对正常妇女及患原位导管癌及转移性乳腺癌的妇女检测并比较。即，将全血离心，除去淡黄色的层。淡黄色的层的细胞立即用PBS清洗并与MAb 7B6一起培养，最终体积为2ml PBS；0.5％NFDM。这一部分中的MAb 7B6细胞％用流动细胞学测定。
表4由人类乳腺癌分离的母上皮细胞中膜键合的LAPasePatient Population％MAb 7B6 Positive cells(n＝100 pergroup)Normal0.1-0.5DCIS(non-invasive)5-14Metastatic(Lung/Brain)18-25C)患初期乳腺癌妇女血浆中的LAPase活性水平用ELISA法使用单克隆抗体MAb 7B6测定患早期乳腺癌妇女血浆中LAPase水平并与相同年龄健康妇女比较。
用MAb 7B6进行血浆免疫沉淀结果显示，患有非浸润性导管癌和转移癌的病人的LAPase水平高于正常健康妇女。实验结果见表5。表5患乳腺癌妇女血浆中的LAPase水平Patient PopulationLAPase Levels(n＝100per group) (ug/ml)Normal 5-10DCIS(non-invasive) 450-600Metastatic(Lung/Brain)1200-3700所有选用的参考文献，专利和专利申请见参考文献。
我们以例子解释我们的发明，但是我们的研究并不限制于这些解释。对我们发明的全面解释见下列说明。
例6es-LAPase抑制剂用Rosen等描述的由CD+TMP6细胞提纯人的Thioredoxin，与从SIGMA-ALDRICH购买的由E.Coli.所得的Thioredoxin活性比较。
Thioredoxin通过氨键共价与Ultralink EDC/DADPA键合基质连结，这一连结是根据生产者的方法，用5mg纯Thioredoxin与碳化二亚氨EDC/DADPA基质反应。
LAPase是在330nm用分光光度法进行测定，用182uM 1-亮氨酸-B-奈氨作为底物测定B-奈氨产物的形成。动力学测定是用Spectronic Genesys 5型分光光度计进行的。在30分钟期间，每6秒记录一次吸收度。酶动力学测定是用8.0×10-2U的es-LAPase在最终体积600ul重复三次测定。将下列反应混合物置于冰上，按顺序加入，es-LAPase，无钙的Hank′s溶液制成600ul，182uM 1-亮氨酸-B-奈氨。用不含es-LAPase的相应空白溶液作基线。两试管都转移到分光光度计上，最后加入l-亮氨酸-B-奈氨溶液，记录0反应时间。抑制作用试验的测定是在下列物质存在下进行的，167uM Bestatin，167reduced Gluthathione和17uM reduced thioredoxin。
图2表明，Bestatin和两种含硫醇的多太，reduced Gluthathione和reducedthioredoxin，都有相应的抑制作用。与es-LAPase对照组相比，es-LApase在thioredoxin和glutathione存在下反应速度明显减缓。另外，与167uM reducedGluthathione培养的样品相比，es-LApase在17uM thioredoxin存在时的反应速度较慢。再者，167uM Bestatin能明显抑制es-LApase活性。如表6所示，reducedthioredoxin是有效的es-LApase活性抑制剂。表6所给的每种抑制剂的最大反应速度(Vmax)，Macheal-Menten常数(Km)，及抑制常数(Ki)，表明各种太的不同抑制性能。在这一方面，与Bestatin培养的es-LAPase的Vmax值与es-LAPase单独存在时非常相似，而Km值明显很高。这一数据证实了Bestatin对es-LAPase抑制剂作用的竞争性质。相反，与Bestatin和glutathione培养相比，用reduced thioredoxin培养的es-LAPase其Vmax，Km明显降低，Ki值适中。总之，这些数据很明显的说明reduce thioredoxin抑制es-LAPase是以不竞争方式，而与reduced glutahthione抑制es-LAPase是非竞争方式。
表6Bestatin，reduced thiordoxin and glutathione的es-LAPase抑制常数VmaxKm Ki(10-4M/min) (10-4M) (10-6M)LApase alone 36.8±1.9 1.67±0.14 N/ABestatin 167uM34.0±3.9 48.7±8.46.22±1.61Thioredoxin 17uM 5.31±0.02 0.234±0.00063.40±0.58Glutathione 167uM 17.2+1.51.78+0.251.53+0.40
权利要求
1.对溶解的和膜内的人类es-LAPase单克隆抗体。
2.根据权利要求1的单克隆抗体，其中对人类es-LAPase的特异性单克隆抗体是用杂交瘤细胞系7B6制备的，并存放在加拿大国际存放机构，序列号为。
3.能够产生对溶解的和膜内的人类es-LAPase单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
4.根据权利要求3的杂交瘤细胞系，其存放在加拿大国际存放机构，序列号为。
5.根据测定样品中NDP-Kinase和es-LAPase水平诊断病人乳腺癌的方法。
6.根据权利要求5的方法，其中es-LAPase水平检测是从一组测定方法中选出的，这一组测定方法包括免疫测定样品中es-LAPase水平；免疫测定样品中es-LAPase的存在。
7.根据权利要求6的方法，其中es-LAPase的存在是用对溶解的和膜内的es-LAPase有特异性的单克隆抗体进行免疫测定测得的。
8.根据权利要求7的方法，其中单克隆抗体是用杂交瘤细胞系7B6制备的，并存放在加拿大国际存放机构，序列号为。
9.用测定样品中es-LAPase水平来检测转移癌的方法。
10.根据权利要求9的方法，其中es-LAPase水平检测是从一组测定方法中选出的，这一组测定方法包括免疫测定样品中es-LAPase水平；免疫测定样品中es-LAPase的存在。
11.根据权利要求10的方法，其中es-LAPase的存在是用对溶解的和膜内的es-LAPase有特异性的单克隆抗体进行免疫测定测得的。
12.根据权利要求11的方法，其中单克隆抗体是用杂交瘤细胞系7B6制备的，并存放在加拿大国际存放机构，序列号为。
全文摘要
对人类疾病如癌症进行有效检测及设计治疗药物的关键在于能够鉴别危险因素和病理生理改变的分子联系。在正常生理条件下,雌激素对多个器官起关键性的作用。这些组织对雌激素刺激的反应能够部分解释其在各种人类疾病的发生和发展中所起的活性作用,尤其是对乳腺癌。对早期乳腺癌肿瘤组织母细胞中能对雌激素响应的细胞因子的研究,发现了一种假定的LAPase的同功酶。结果显示,这一标记物在患有浸润性导管癌和转移癌的血清中含量较高。我们生产出了对这一种细胞标记物的单克隆抗体。这一发明说明LAPase单克隆抗体用于确认对乳腺癌的血液测定结果。
文档编号A61K38/06GK1362970SQ00807918
公开日2002年8月7日 申请日期2000年3月30日 优先权日1999年3月30日
发明者卡布里耶·普利多－塞胡多 申请人:加拿大卫生部