专利名称：双酶体系制备l-叔亮氨酸类化合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种基于采用生物酶制剂拆分制备手性化合物的方法，尤其是指一种双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法。
背景技术：
L-叔亮氨酸(III)主要用作营养强化剂、动物饲用添加剂，合成药物。作为合成药物中间体主要用于合成抗艾滋病(HIV)药物阿扎那韦(Atazanavir)和山德士(Sandoz)，以及一些抗癌药物、生物抑制剂及生物活性肽等。
抗HIV作用的蛋白酶抑制剂阿扎那韦是目前世界上主要的抗艾滋病药物，仅在美国就已有约13万名患者接受这种药物的治疗，该药物的有效成分--“C-末端中间体”是合成强效的蛋白酶抑制剂阿扎那韦的重要中间体，具有持续强效抑制艾滋病病毒、低耐药、用药方便、对脂肪代谢副作用小的特点，2006年全球销售额达到32. 26亿美元。
阿扎那韦药品目前仍属于专利保护药品，专利由施贵宝公司掌握，只授权少数几家制药公司生产。根据L-叔亮氨酸用于生产阿扎那韦的用量估计，预计今后几年医药行业对该中间体的需求将迅速增加，阿扎那韦的专利将于2011年到期，届时随着药品专利的失效，仿制药生产厂家将大量出现，对L-叔亮氨酸的需求也将成倍增长。目前每年国内外市场对L-叔亮氨酸的需求量为10-15吨，预计5年后可增加至百吨。该产品今年预计可实现销售收入1. 3亿元，实现利税2400-3600万元。预计2011年将实现销售收入3. 2亿元，利税约0. 9亿元。
目前国内外生产L-叔亮氨酸的生产方法主要有 (1)以3，3- 二甲基丁酸利用类似Leuckart反应合成消旋产物，再用S-苯乙胺拆分得到(R)和(S)-叔完氨酸，收率较低(23% ),e. e.值为 95% (TetrahedronLett. 1997， 38,2153-2154)。(2)由光学活性的(R) _叔丁基甘氨醇出发，经过氨基保护、氧化、氢化脱保护，得到L-叔亮氨酸·收率可达到64%, e. e.值大于99% (Pat. Appl，DE 19524338. 2)。 (3)在催化剂邻羟苯亚甲基亚胺衍生物非金属催化剂的存在下，HCN对亚胺的加成，得到的加成化合物，收率为88%，e. e.值为96%，重结晶后(e. e.值大于99% )，再经过水解、脱甲酰化制得L-叔亮氨酸，收率可达84%, e. e.值大于99% (Org,Lett. 2000，2 (6)，867-870)。 通过不对称合成方法可以得到好的光学产率，但因所用的催化剂价格昂贵，不适合大规模生产。(4)在BuOH存在下，脂肪酶(Lipase)选择性催化水解4-叔丁基-2-苯基吖内酯， 生成的酯，先用蛋白酶(Alcalase)水解，以防逆反应发生，再用酸水解断键，得到L-叔亮氨酸，收率为 69%，e. e.值为 97% (Tetrahedron Lett. 1995，7，1113-1116)。(5)用 HC00NH4 作为NAD+的还原剂，在甲酯脱氢酶不可逆的氧化作用下，使NAD+转变成NADH继续循环使用冈，并且生成C02，得到L-叔亮氨酸的收率为85%，e. e值为99% (Meth. Enzymol, 1988， 136，34-45)。
目前德国Degussa公司采用生产工艺(5)，得到e. e.值达99%的L_叔亮氨酸，该工艺成熟，反映条件温和。但是所使用的辅酶价格较贵，并且不易保存和回收，比较容易失活。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供一种基于采用生物酶制剂的双酶体系动力学拆分 N-酰化叔亮氨酸类化合物制备手性化合物L-叔亮氨酸类化合物的方法。该方法反应条件温和、收率高、环境友好、成本低。
一种双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，所述的方法为以式II所示的 N-酰化叔亮氨酸类化合物在双酶体系下，于水或缓冲溶剂中15-60°C下反应制备式III所示手性L-叔亮氨酸类化合物，所述生物酶为酰化氨基酸消旋酶(丙氨酸消旋酶)和水解酶的混合酶，其制备反应方程式为
其中，X = (^，朋^殿风力！^其中礼，&，民= (5直链，支链，一、二或者三卤素取代的烷烃)的任一基团。
所述水解酶为脂肪酶或酯酶。其中脂肪酶为lipase from Thermomyceslanuginosus, Lipase B from Candida antarctica, Lipase from Candide Rugosa (CRL) , Lipase PS "Amano " SD, Lipase AS "Amano，，，Lipase AK "Amano，，， LipaseAYS "Amano，，的一种或多种；酉旨醇为 Esterase from Escherichia coli. K12 (esterasefrom locus tag b3412)的一种或多种；所述的酰化氨基酸消旋酶为 Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440 (rascemase from locus
tagNC00294I)。
进一步的，所述式I化合物与混合酶的质量之比为1 0. 005 0. 1。
进一步的，所述缓冲溶剂为Tris盐酸缓冲液、PBS磷酸缓冲溶液或者混合溶液，所述混合溶液为叔丁醇、乙醇、甲醇、丙酮或丁酮与水、Tris盐酸缓冲液、PBS磷酸缓冲溶液任一种的混合液，体积比为1 20-1 2。
进一步的，所述反应温度为15-60°C，控制反应温度波动幅度为士5°C;所述反应的反应时间为2-15小时。
5 进一步的，所述反应是以TLC小板跟踪监测反应，展开剂是乙酸乙酯与石油醚体积比为1 2 5的混合试剂；通过监测反应中新产生的点的浓度和剩下的点的浓度来判断反应终点。
进一步的，所述反应用液相监测反应进度，通过监测液相色谱中式II化合物的形成和式I化合物的消失来判断反应终点。
进一步的，所述反应完毕后，用有机溶剂萃取产物，所使用的有机溶剂为乙醚、甲苯、氯苯、乙酸乙酯，异丙醚，正己烷，甲酸乙酯，环己烷之中的任一种。并且溶剂经简单处理后可以重复套用。
进一步的，所述反应体系中所使用的混合酶为消旋酶与酯(脂肪)酶的质量之比为1 3-2 1 ；反应完毕后，将缓冲溶液的pH值调节到前相同值，酶体系可重复使用。
进一步的，所述反应的是按照以下步骤进行 a.将化合物(I)投放到水溶液中，然后加入助溶剂。再加入按照一定比例组成双酶制剂。于摇床中或者动力搅拌装置中充分搅拌反应。
b.按照化合物(I)混合酶制剂，质量之比为1 0.0001-1 1进行投料。
c.控制温度于15 60°C进行反应，期间用TLC硅胶板或液相色谱进行跟踪监测， 直至反应基本进行完毕；反应完毕，用有机溶剂萃取反应液。然后减压除去有机溶剂，即可得到粗化合物(II)。
d.将反应溶液调节pH值于一定的值，可重复利用该反应溶液。
本发明利用双酶体系进行动力学拆分叔亮氨酸得到单一手性L-叔亮氨酸的生产工艺，理论收率是100 %，S卩消旋叔亮氨酸可完全转化为目标产物。该工业能在室温下进行， 并且操作简单，无污染，能显著降低生产成本。该生产方法革除了原有工艺中使用有毒，有污染性的化学原料。基本无污染。通过酶工程技术可以改造酶制剂，使之能更加适合对特定底物的拆分。从而达到预计目标。具有良好的技术应用和产业化前景。
具体实施例方式以下具体实例来说明本发明的技术方案，但保护的范围并不仅限于此。
本专利所涉及到的脂肪酶购于天野酶制品公司(Amano Enzyme Inc. China)，酯酶和酰化氨基酸消旋酶由本申请单位实验室制备。其余反应物及试剂均为市场购买所得。如未加特别说明，该方法所使用的生物酶均为游离酶粉末。
实施例1 将20mL PBS磷酸缓冲溶液(5mM，Ph = 8. 5)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X = NH2) 3. 44g加入到锥形瓶中。继续加入消旋酶Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440 (rascemase from locus tag NC002947)禾口 CRL 共 0. 13g (二者质量之比为2 1)，加入完毕，将温度固定在35°C，摇床中反应12小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。反应完毕后，加入20mL乙酸乙酯萃取，然后将溶剂减压出去，即可得到白色固体L-2-氨基-3，3- 二甲基丁酰胺。
L-2-氨基-3，3_ 二甲基丁酰胺，收率 74%，纯度 98%，e.e.值 96%。
L-2-氨基-3，3_ 二甲基丁酰胺[a ]D2。，+6. 4(c = 5 % in 5M HC1) ；1H NMR (400MHz, CDC13) 8 1. 03(9H) ,3. 24 (S, 1H)，5. 40(S，2H)，6. 98(S，2H). 13C NMR(100MHz,CDC13) 6 29. 6,40. 3,81. 0，170. 3. 实施例2 将20mL PBS磷酸缓冲溶液(5mM，Ph = 8. 5)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料⑴(此处X = NH2) 3. 44g加入到锥形瓶中。加入2mL甲醇后继续加入Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemase from locustag NC002947)禾口 CRL 共 0.3g(二者质量之比为2 1)，加入完毕，将温度固定在35°C，摇床中反应10小时。期间 TLC小板监测或高效液相色谱监测。反应完毕后，加入20mL乙酸乙酯萃取，然后将溶剂减压出去，即可得到白色固体L-2-氨基-3，3- 二甲基丁酰胺。
L-2-氨基 _3，3-二甲基丁酰胺，收率79%，纯度98%，6.6.值 98%。
实施例3 将20mL PBS磷酸缓冲溶液(10mM，pH = 9. 0)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处x = NH2) 3. 44g加入到锥形瓶中。继续加入Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440 (rascemase from locus tag NC002947)禾口 CRL共(X 5g (二者质量之比为1 1)，加入完毕，将温度固定在40°C，摇床中反应8小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。反应完毕后，加入20mL乙酸乙酯萃取，然后将溶剂减压出去，即可得到白色固体L-2-氨基-3，3- 二甲基丁酰胺。
L-2-氨基 _3，3-二甲基丁酰胺，收率69%，纯度92%，6.6.值 94%。
实施例4 将20mL普通水(pH = 8. 5)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X =NH2)3. 44g加入到锥形瓶中。再加入叔丁醇3mL后继续加入Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440 (rascemase from locus tag NC002947)禾口 CRL共(X 2r (二者质量之比为1 2)，加入完毕，将温度固定在25°C，摇床中反应8小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。反应完毕后，加入20mL乙酸乙酯萃取，取有机相然后将溶剂减压除去，即可得到白色固体L-2-氨基-3，3- 二甲基丁酰胺。
L-2-氨基-3，3_ 二甲基丁酰胺，收率 73%，纯度 95%，e.e.值 94%。
实施例5 将20mL PBS磷酸缓冲溶液(5mM，pH = 9. 0)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X = 0H)3.44g加入到锥形瓶中。再加入叔丁醇2mL后继续加入Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemase fromlocus tag NC002947)禾口 CRL 共0.5g(二者质量之比为1 3)，加入完毕，将温度固定在35°C，摇床中反应10小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。反应完毕后，加入20mL乙酸乙酯萃取，取有机相然后将溶剂减压除去，即可得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率83%，纯度95%，e.e.值97%。
L-叔亮氨酸:[a ]D20, +7. 3(c = 5 % in 5M HC1) ；1H NMR(400MHz, CDC13) 8 0. 97(9H) ,3. 41 (S, 1H) ,5. 18(S，2H)，10. 91 (S, 1H) 13C NMR(100MHz, CDC13) 8 26. 3， 39. 1,76. 0，176. 5. 实施例6 将20mL PBS磷酸缓冲溶液(5mM，pH = 8. 5)加入到lOOmL的锥形瓶中，然后将原料 (I)(此处X = 0H) 3. 44g加入到锥形瓶中。再加入叔丁醇3mL后继续加入生物酶Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemasefrom locus tag NC002947)禾口 Lipase AS “Amano”共0. 4g(二者质量之比为1 1)，加入完毕，将温度固定在35°C，摇床中反应10小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。
其他操作如同实施例6纯化处理得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率89%，纯度97%，e. e.值98%。
实施例7 将20mLPBS缓冲溶液(5mM，pH = 8. 0)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料 (I)(此处X = 0H)3.44g加入到锥形瓶中。再加入乙醇3mL后继续加入生物酶Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440(rascemase fromlocus tag NC002947)禾口 Lipase PS “Amano”共0. 5g(二者质量之比为1 1)，加入完毕，将温度固定在35°C，摇床中反应7小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。
其他操作如同实施例6纯化处理得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率82%，纯度97%，e. e.值99%。
实施例8 将20mL PBS磷酸缓冲溶液(10mM，pH= 10. 0)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X = 0H) 3. 44g加入到锥形瓶中。再加入丙酮2mL后继续加入生物酶Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440 禾口 LipasePS“Amano，，共 0. 5g( 二者质量之比为1 3)，加入完毕，将温度固定在35°C，摇床中反应9小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。
其他操作如同实施例6纯化处理得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率85%，纯度97%，e.e.值99%。
实施例9 将20mL Tris盐酸缓冲液(10mM，pH = 8. 0)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料 (I)(此处X = 0H) 3. 44g加入到锥形瓶中。再加入丙酮2mL后继续加入Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440和 Lipase △丫9111^110，，共0.5§(二者质量之比为1 2)， 加入完毕，将温度固定在35°C，摇床中反应6小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。
其他操作如同实施例6纯化处理得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率44%，纯度97%，e.e.值95%。
实施例10 将20mL Tris盐酸缓冲液(10mM，pH = 8. 0)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X = 0H) 3. 44g加入到锥形瓶中。再加入丙酮2mL后继续加入生物酶Lipase AYS“Amano”，加入完毕，将温度固定在30°C，摇床中反应8小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。
其他操作如同实施例6纯化处理得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率92%，纯度97%，e.e.值94%。
实施例11 将20mL20mLTris盐酸缓冲液(10mM，pH= 10. 0)加入到100mL的锥形瓶中，然后将原料(I)(此处X = 0H)3. 44g加入到锥形瓶中。再加入丙酮2mL后继续加入生物酶Alanineracemase from Pseudomonas putida KT2440禾口Esterase from Escherichia coli.K12共 0. lg(二者质量之比为1 1)，加入完毕，将温度固定在45°C，摇床中反应8小时。期间TLC 小板监测或高效液相色谱监测。
其他操作如同实施例6纯化处理得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率82%，纯度97%，e. e.值96%。
实施例12 将20mL20mL Tris盐酸缓冲液(10mM，pH = 10. 0)加入到100mL的锥形瓶中， 然后将原料(I)(此处X = 0H) 3. 44g加入到锥形瓶中。再加入丁酮2mL后继续加入生物酶 Alanine racemase from Pseudomonas putida KT2440 禾口 LipaseB from Candida antarctica共0. lg(二者质量之比为1 3)，加入完毕，将温度固定在40°C，摇床中反应8 小时。期间TLC小板监测或高效液相色谱监测。
其他操作如同实施例6纯化处理得到白色固体L-叔亮氨酸。
L-叔亮氨酸，收率70%，纯度97%，e.e.值99%。
序列表 <110>浙江大学 <120>双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法 <170>PatentIn version 3. 权利要求
1.一种双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在于所述的方法为以式I 所示的N-酰化叔亮氨酸类化合物在双酶体系下，于水或缓冲溶剂中反应制备式II所示的 手性L-叔亮氨酸类化合物，所述生物酶为酰化氨基酸消旋酶和水解酶的混合酶，其制备反 应方程式为
其中，X = OH，NH2, NR1R2，OR3(其中R1, R2, R3 = C1 C5直链，支链，一、二或者三卤素取 代的烷烃)的任一基团。
2.根据权利要求1所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在 于所述的酰化氨基酸消旋酶为丙氨酸消旋酶Alanine racemasefrom Pseudomonas putida KT2440 ；所述水解酶为脂肪酶或酯酶，其中脂肪酶为Lipase from Thermomyces lanuginosus, Lipase B from Candidaantarctica,Lipase from Candide Rugosa,Lipase PS "Amano"SD, LipaseAS "AmanoLipase AK "AmanoLipase AYS "Amano" fM^ 种；酯酶为 Esterase from Escherichia coli. K12 的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在 于所述式I化合物与混合酶的质量之比为1 0. 005 0. 1。
4.根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在 于所述缓冲溶剂为Tris盐酸缓冲液、PBS磷酸缓冲溶液或者混合溶液，所述混合溶液为叔 丁醇、乙醇、甲醇、丙酮或丁酮与水、Tris盐酸缓冲液、PBS磷酸缓冲溶液任一种的混合液， 体积比为1 20-1 2。
5.根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征 在于所述反应温度为15-60°C，控制反应温度波动幅度为士5V ；所述反应的反应时间为 2-15小时。
6.根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在 于所述反应是以TLC小板跟踪监测反应，展开剂是乙酸乙酯与石油醚体积比为1 2 5 的混合试剂；通过监测反应中新产生的点的浓度和剩下的点的浓度来判断反应终点。
7.根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在 于所述反应用液相监测反应进度，通过监测液相色谱中式II化合物的形成和式I化合物 的消失来判断反应终点。
8.根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在 于所述反应完毕后，用有机溶剂萃取产物，所使用的有机溶剂为乙醚、甲苯、氯苯、乙酸 乙酯，异丙醚，正己烷，甲酸乙酯，环己烷之中的任一种。并且溶剂经简单处理后可以重复套 用。
9.根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在于所述反应体系中所使用的混合酶为酰化氨基酸消旋酶与水解酶的质量之比为 1:3-2: 1 ；反应完毕后，将缓冲溶液的pH值调节到前相同值，酶体系可重复使用。
10.根据权利要求1或2所述的双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，其特征在于所述反应的是按照以下步骤进行a.将化合物I投放到水溶液中，然后加入助溶剂。再加入按照一定比例组成双酶制剂。 于摇床中或者动力搅拌装置中充分搅拌反应。b.按照化合物I酶制剂，质量之比为1 0. 005 0. 1进行投料。c.控制温度于15 60°C进行反应，期间用TLC硅胶板或液相色谱进行跟踪监测，直至 反应基本进行完毕；反应完毕，用有机溶剂萃取反应液。然后减压除去有机溶剂，即可得到 粗化合物II。d.将反应溶液调节pH值于一定的值，可重复利用该反应溶液。
全文摘要
本发明涉及一种基于采用生物酶制剂拆分制备手性化合物的方法，尤其是指一种双酶体系制备L-叔亮氨酸类化合物的方法，所述的方法为以式II所示的N-酰化叔亮氨酸类化合物在双酶体系下，于水或缓冲溶剂中15-60℃下反应制备式III所示手性L-叔亮氨酸类化合物，所述生物酶为酰化氨基酸消旋酶(丙氨酸消旋酶)和水解酶的混合酶，其制备反应方程式为其中，X＝OH，NH2，NR1R2，OR3(其中R1，R2，R3＝C1～C5直链，支链，一、二或者三卤素取代的烷烃)的任一基团。本发明能在室温下进行，并且操作简单，无污染，能显著降低生产成本。
文档编号C12P13/02GK101845476SQ201010138158
公开日2010年9月29日 申请日期2010年4月2日 优先权日2010年4月2日
发明者于洪巍, 王博, 车大庆, 沈文和 申请人:浙江大学